多參數(shù)流式細胞術(shù)在多發(fā)性骨髓瘤微小殘留病變檢測中的應(yīng)用進展

靳小可，黃東平

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院血液內(nèi)科，安徽 蕪湖 241000)

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma, MM)是臨床常見的血液系統(tǒng)腫瘤，以漿細胞惡性增殖伴有分泌單克隆免疫球蛋白或輕鏈為特征，全世界每年新發(fā)病例數(shù)約86 000例,占所有新發(fā)腫瘤病例的1%，占血液系統(tǒng)腫瘤的13%[1]，中位生存期4～5年[2]。隨著各種診療手段的出現(xiàn)和診療水平的提升，多數(shù)患者的生存期得到明顯延長，但經(jīng)過現(xiàn)有的治療病情最終依然會進展，部分原因為對患者病情發(fā)展階段評估不準(zhǔn)確，導(dǎo)致在治療過程中對治療種類、劑量及時間點的選擇難以確定。近些年隨著科技的發(fā)展，流式細胞術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、基因測序等檢測手段在臨床的應(yīng)用越來越多，特別是流式細胞術(shù)因其高效、高敏感度、相對廉價等優(yōu)點在血液病微小病變檢測中應(yīng)用范圍最廣，對臨床的治療有著一定指導(dǎo)意義。

1 MM的診療現(xiàn)狀及預(yù)后評價

近幾十年來，硼替佐米、來那度胺等新藥的開發(fā)及造血干細胞移植技術(shù)的應(yīng)用，使得患者的緩解率和生存時間得到了明顯的提高[3-5]，然而個體差異較大，即便是治療后達到緩解，多數(shù)患者依然面臨著疾病進展和復(fù)發(fā)[6]，進一步治療則需要建立在對患者病情精確評估基礎(chǔ)上。一直以來，完全緩解(complete remission, CR)作為骨髓瘤患者治療后病情達到相對穩(wěn)定的評價標(biāo)準(zhǔn)被廣泛應(yīng)用，患者表現(xiàn)為血清、尿免疫固定電泳陰性，不存在任何軟組織漿細胞瘤，同時骨髓中的漿細胞數(shù)小于等于5 %，但這難以精確反映疾病控制的深度和狀態(tài)，隨著患者緩解率的提高，為了滿足臨床診療需求又出現(xiàn)了免疫表型的CR，分子生物學(xué)的CR等概念，一定程度上可以對患者體內(nèi)惡性漿細胞狀態(tài)描述得更加準(zhǔn)確，但這些概念涉及到不同的方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，給臨床治療方案選擇帶來一定困擾。

近年的研究認為微小殘留病變(minimal residual disease，MRD)陽性，即治療后形態(tài)學(xué)等傳統(tǒng)方法緩解，但患者體內(nèi)依然存在腫瘤細胞的免疫表型、分子生物或細胞基因?qū)W的表達是血液腫瘤復(fù)發(fā)的根本原因[7]。傳統(tǒng)檢測手段判定達到緩解的患者，骨髓中依然存在約109個腫瘤細胞，被認為是MM患者復(fù)發(fā)的根源，為了更加準(zhǔn)確地評估患者的疾病狀態(tài)，選用更恰當(dāng)?shù)闹委?，在現(xiàn)有技術(shù)手段下需要對患者體內(nèi)腫瘤負荷進行精確的監(jiān)測。在傳統(tǒng)的檢測手段中，形態(tài)學(xué)是最常用的方法，但骨髓瘤細胞往往成簇集分布，并且形態(tài)與正常漿細胞難以嚴(yán)格區(qū)分，這使得形態(tài)學(xué)難以精確反映漿細胞的比例和性質(zhì)。骨髓瘤細胞分泌的單克隆免疫球蛋白的多少有較大的個體差異，并且有寡分泌型或不分泌型，使得血、尿蛋白電泳及免疫固定電泳等檢測免疫球蛋白的方法使用受限。這就需要更加有效的檢測手段對患者腫瘤負荷狀態(tài)進行評估，防止治療過度或治療不足。

2 各種MRD檢測手段在血液病中的應(yīng)用對比

自MRD概念提出以來，國內(nèi)外研究者均積極地將各種方法MRD的檢測用于臨床研究[8-10]，以驗證其可行性和有效性，多數(shù)研究表明基于多參數(shù)流式細胞術(shù)(multiparameter flow cytometry,MFC)，等位基因特異性寡核苷酸-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Allele-specific oligonucleotide PCR,ASO-PCR)和二代測序/下一代測序(Next-generation sequencing, NGS)的MRD檢測對臨床治療具有指導(dǎo)意義。這三種方法均有較高的敏感度和特異度，在急性髓系白血病，急性淋巴細胞白血病、MM等血液病中均有相關(guān)應(yīng)用研究，各有優(yōu)劣。ASO-PCR敏感度可達10-6，但其檢測依賴于融合基因、基因突變、和高表達的基因，對于無明顯基因異常的惡性腫瘤難以檢出，檢測體系和技術(shù)要求相對高。NGS為近些年迅猛發(fā)展的檢測手段，敏感度在三種方法中最高，但成本高，需要一定平臺，目前在我國大多數(shù)醫(yī)院難以全面開展。MFC檢測覆蓋面廣，結(jié)果直觀，雖然各指標(biāo)未完全標(biāo)準(zhǔn)化，但依然為現(xiàn)今臨床最為普及的方法。而經(jīng)過多年的技術(shù)更迭，現(xiàn)有的MFC發(fā)展到多激光多色，可通過同時標(biāo)記多個抗體，根據(jù)不同的表型來區(qū)分正常漿細胞及異?？寺{細胞[11]，其檢測敏感度最高可達到10-5(0.001%)，不受漿細胞分布、單克隆球蛋白多寡等情況的影響。所以對于MM的MRD檢測，MFC為各實驗室最常用的使用方法。

3 MFC在MM患者MRD檢測中的應(yīng)用

3.1MFC檢測方案及臨界值選擇在漿細胞的鑒定中，CD38、CD138的表達最具特異性，而異常的單克隆漿細胞表型通常有有以下特征：(1)CD19，CD27，CD38或CD45低表達；(2)CD56過表達；(3)CD117的異常表達[12]。國內(nèi)流式檢測惡性漿細胞的抗體組合中除了CD38(或CD138)外一般要包括CD45、CD56和CD19，各實驗室設(shè)門方法不一致，但多基于CD38、CD138、SSC和CD45聯(lián)合設(shè)門，常根據(jù)初診免疫表型采用兩組四色抗體組合CD38/CD138/CD45/CD19和CD38/CD56/(或CD117等抗原)/CD45/CD19,進行檢測[13]。國外各實驗室的檢測方案亦未統(tǒng)一。為了解MM患者骨髓MRD的MFC檢測情況，2013年Flanders發(fā)表了對美國30家主要醫(yī)療機構(gòu)進行問卷調(diào)查結(jié)果，該課題組向每家機構(gòu)負責(zé)人發(fā)送包含14個相關(guān)問題的郵件，得到26家機構(gòu)反饋，其中有11家開展此項目，獲取細胞數(shù)從10萬到4百萬不等，敏感度和判斷MRD的最低克隆也在較大范圍波動，所使用的方案多包括CD38、CD138、CD45、CD19，也有包括單克隆輕鏈，CD27等其他方案[14]。目前國內(nèi)外各實驗室在MM患者MRD的多參數(shù)流式檢測方面尚未有統(tǒng)一方案。而對于MRD臨界值的確定，Rawstron[15]等的研究數(shù)據(jù)表示，將10-4定為陰性臨界值對患者體內(nèi)腫瘤負荷狀態(tài)進行定量評判要比單純的陰性和陽性更確切，目前國內(nèi)外多使用10-4作為臨界值，而隨著八色多參數(shù)流式細胞術(shù)的不斷發(fā)展，其敏感度較四色流式明顯提高，理論上只要能夠獲取足夠的細胞數(shù)，就可達到10-5[16]。

3.2MFC在MM患者MRD的檢測應(yīng)用情況盡管方案未統(tǒng)一，MFC在MM的 MRD中的檢測研究依然較多，具有重要的臨床價值。早在2002年，就有Rawstron AC和San MJF兩個課題組分別研究MFC在傳統(tǒng)化療后MM患者的MRD監(jiān)測中的臨床意義[17-18]。之后有研究通過MFC檢測229例新發(fā)MM移植后的MRD，再次證明了MFC檢測的MRD是最有價值的預(yù)后評判方法[19]。來自英國醫(yī)學(xué)研究會一項臨床試驗中，MM患者造血干細胞移植后100 d檢測MRD為陰性時，其無進展生存期(progression-free survival，PFS)和總生存期(overall survival，OS)均顯著提高[20]。一項來自歐洲骨髓瘤臨床試驗研究報告提示高危組患者經(jīng)過治療達到MFC檢測MRD陰性，其預(yù)后與標(biāo)危組患者類似[21]。在一項臨床Ⅱ期試驗中，研究者同樣證明了七色流式在MM患者MRD監(jiān)測中的應(yīng)用價值[22]，反映四色以上的MFC對MRD的檢測更加靈敏。對于高敏感度的MRD檢測方法如MFC、PCR和NGS的選擇方面，Paiva B 等[23]研究認為三者敏感度均較高，但MFC的應(yīng)用范圍更廣，相對廉價，所需時間短，效率高。2014年兩個研究均對比了MFC和PCR在MM患者MRD檢測中的有效性，兩者結(jié)果有較好的相關(guān)性[24-25]。就應(yīng)用范圍而言，MFC相對于NGS更適合進行MM患者的MRD檢測，但也有相當(dāng)多的研究顯示，MFC的敏感度在多數(shù)情況下低于PCR和NGS[26-27]，且MFC和NGS均存在未能標(biāo)準(zhǔn)化問題[28]。 最近的一項臨床試驗研究介紹了新一代流式技術(shù)(Next Generation flow, NGF)及相應(yīng)新的分析軟件，通過檢測110份達到非常好的部分緩解(VGPR)或CR的 MM患者骨髓樣本，對比其與傳統(tǒng)八色流式檢測結(jié)果，有25%的樣本在傳統(tǒng)八色MFC中為MRD陰性，而NGF測得MRD為陽性，如果治療后能夠達到NGF檢測MRD陰性的患者可以有更佳的PFS[29]，提出NGF檢測在敏感度上有很大進步。

3.3MFC的優(yōu)缺點及技術(shù)進展MFC在檢測MM患者骨髓標(biāo)本的過程中有明顯優(yōu)勢：(1)可以通過多種抗體組合鑒定出目的細胞；(2)可以短時間檢測大量細胞；(3)可以對不同細胞群進行定量并對明確其相關(guān)抗原表達水平；(4)可以檢測細胞表面抗原也可以檢測細胞內(nèi)抗原；(5)對患者骨髓中紅系，B系，髓系或其他細胞比例有直觀的檢測結(jié)果。但也有不少研究提出基于MFC的MM MRD檢測也有其缺陷：(1)MFC可能忽略部分原始程度較高、表型未曾明確但有發(fā)展成病理性漿細胞潛力的干細胞[30]，這些表型不成熟而缺乏某些抗原難以檢出，從而導(dǎo)致假陰性；(2)分析MFC數(shù)據(jù)需要大量專業(yè)知識和經(jīng)驗；(3)傳統(tǒng)流式的敏感度依然小于PCR和NGS；(4)目前MFC檢測MRD方案未能標(biāo)準(zhǔn)化。最近有研究表明MM患者骨髓內(nèi)原始程度較高的這類干細胞數(shù)量極少，多超出檢測范圍[31]，對檢測結(jié)果不造成可觀的影響。MFC分析對檢測人員的經(jīng)驗性要求較高，使得不同實驗人員的檢測結(jié)果可能出現(xiàn)差異。新的計算機工具、軟件或分析方法不斷面世，使其有更高的可操作性和同行一致性[32]，相對于傳統(tǒng)的四色MFC，現(xiàn)在多數(shù)實驗室正在更多地使用八色甚至十色的MFC，其敏感度有了一定提高。而對于標(biāo)準(zhǔn)化的問題，一方面國際骨髓瘤基金會開展的黑天鵝計劃正對其標(biāo)準(zhǔn)化進行相關(guān)研究和制定，另一方面，NGF在相關(guān)研究中對漿細胞的鑒定顯得更易標(biāo)準(zhǔn)化，相對于傳統(tǒng)MFC表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢。

4 小結(jié)

MM的MRD檢測方法多樣，MFC作為一種高效、高通量、高靈敏的技術(shù)已在全世界范圍內(nèi)多家機構(gòu)得到應(yīng)用，其針對患者治療后體內(nèi)正常及克隆性漿細胞的檢測，可以一定程度上彌補傳統(tǒng)檢測方法的不足。近年隨著技術(shù)發(fā)展，八色及十色的MFC逐漸替代四色以下的儀器，使其在實驗室檢測中更加便捷高效，靈敏度更高。但目前國內(nèi)外基于MFC的MRD檢測還沒有完全標(biāo)準(zhǔn)化，要想全面用于MM患者治療后病情評估及危險度分層，仍需要加強國內(nèi)外各實驗室交流，積極進行技術(shù)革新，對相關(guān)檢測指標(biāo)如抗體及檢測時間點的選擇進行統(tǒng)一，現(xiàn)已有相關(guān)機構(gòu)進行此類研究，相信在不久的將來，MM基于MFC的MRD檢測能夠在MM患者治療中得到更加有效的應(yīng)用。

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