I群禽腺病毒檢測方法研究進展

殷國政，段世豪，司振書，李玉保

(聊城大學農(nóng)學院，山東聊城 252000)

Ⅰ 群禽腺病毒(Fowl adenovirus group I,FAV-I)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，在禽群中分布廣泛。Ⅰ群禽腺病毒具有共同的群抗原，其根據(jù)分子結構可將血清型分為 A、B、C、D、E 5個種，基于交叉中和試驗和限制性內切酶酶切分析，又分為A(血清1型)、B(血清5型)、C(血清4、10型)、D(血清2、3、9、11型)、E(血清6、7、8a、8b型)等12個血清型[1]。其中，雞腺病毒1型，又名雞胚致死孤兒病毒(chicken embryo lethal orphan virus,CELO)，引致鵪鶉支氣管炎；雞腺病毒4型，可引起雞心包積液與包涵體肝炎綜合征(hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)；雞腺病毒8型，可引致雞包涵體肝炎(inclusion body hepatitis,IBH)。Ⅰ群禽腺病毒通過候鳥水禽等傳播于世界各地，難以控制，并且可以與其他病毒混合感染，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。綜述國內外I群禽腺病毒的分離培養(yǎng)、形態(tài)學檢測、血清學檢測及分子生物學檢測方法，以促進對該類病毒感染進行及時確診和有效防控。

1 病毒的分離培養(yǎng)

對該病毒進行分離培養(yǎng)，可采取家禽的肝臟等組織、口腔拭子或泄殖腔拭子，處理后接種雞胚或細胞。

1.1雞胚培養(yǎng)禽腺病毒的培養(yǎng)方法主要有雞胚培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)2種，雞胚培養(yǎng)通過將處理好的病料組織研磨液，接種到9～11日齡SPF雞胚的卵黃囊、尿囊膜和尿囊腔中，進行增殖培養(yǎng)；邱麗葉等[2]將 FAV分別接種到 SPF雞胚的卵黃囊、尿囊膜和尿囊腔中，并利用熒光定量 PCR方法測定雞胚組織中FAV的病毒含量，結果發(fā)現(xiàn)不同接種途徑對 FAV在肝臟、尿囊膜和尿囊液中的病毒增殖情況影響較大，其中經(jīng)卵黃囊途徑接種的 SPF雞胚， FAV增殖能力最強。

1.2細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)是通過將 FAV接種到原代腎細胞或雞肝癌細胞中，待細胞變性、形態(tài)變圓、脫落，當細胞核內出現(xiàn)明顯的包涵體等細胞病變時，將細胞液回收備用[3]。 趙莉等[4]用不同濃度的血清培養(yǎng)細胞，并以不同接種比例傳代。對最佳感染復數(shù)下的細胞病變和病毒增殖情況以及病毒接種濃度與蝕斑形成數(shù)量之間的關系進行研究。確定了雞肝癌細胞的最佳培養(yǎng)條件： 采用10%FBS的培養(yǎng)基，以1∶5比例傳代培養(yǎng)；病毒的接種濃度可以直接影響蝕斑形成數(shù)量，并且呈線性相關關系，所以雞肝癌細胞適合腺病毒培養(yǎng)。周斌等[5]分別用雞胚成纖維細胞和雞胚腎細胞培養(yǎng)禽腺病毒江蘇分離株，發(fā)現(xiàn)雞胚成纖維細胞接種病毒后沒有出現(xiàn)病變。雞胚腎細胞感染病毒后則表現(xiàn)出很強的聚集性，細胞呈團狀或束狀、脫落等標志性病變。

2 病毒形態(tài)學檢測

在雞胚傳代培養(yǎng)中選擇有明顯病變的雞胚進行取料，研磨，凍融離心(3 000 r/min，20 min)，收取上清液，放置在銅網(wǎng)上用2%磷鎢酸負染，再置于透射電鏡下觀察，觀察到球形、無囊膜、呈二十面體對稱的典型腺病毒， 直徑70～80 nm，可判定為陽性感染[6]； 或取尿囊液，先離心(10 000 r/min，10 min)取上清， 再離心(13 000 r/min，1 h)去上清，留取100 μ L懸濁液，混勻后再使用磷鎢酸染色，吸干液體，利用透射電鏡觀察病毒形態(tài)結構是否符合腺病毒的病原特征[7]。

3 血清學檢測

3.1病毒中和試驗中和試驗是一種以測定病毒的感染性為基礎的特異性和敏感性都很高的血清學檢測方法，在外界環(huán)境下，病毒可以和相應的特異性抗體結合，從而失去其感染能力。Calnek等[8]通過對FAV不同血清型毒株進行中和試驗研究，根據(jù)不同血清型的敏感性不同，建立一種可以準確測定I群禽腺病毒的血清學檢測方法。

3.2瓊脂凝膠沉淀試驗瓊脂凝膠沉淀試驗(agar gel precipitation， AGPT)在禽腺病毒抗體的檢測試驗中被廣泛應用，這種檢測方法成本低，并且非常便捷，但是相較其他檢測方法其敏感性較低，通常在瓊脂凝膠擴散時，禽腺病毒的抗原和抗體需孵育2～3 d，才會出現(xiàn)沉淀線[9]。AGPT對多種血清型混合感染的商品雞的腺病毒檢測比較敏感，但對SPF雞群感染的腺病毒的敏感性較低[10]。國紀壘等[11]采用雙向瓊脂擴散試驗，對分離毒株進行血清學鑒定。4株病毒均與陽性血清出現(xiàn)沉淀線。智海東等[12]使用禽腺病毒 Ⅰ型 CELOV 株研制瓊脂擴散的標準抗原，通過檢測該抗原的效價和特異性，并對試驗感染雞抗體的變化以及現(xiàn)有血清樣本進行檢測。結果表明，該抗原特異性高，不與其他病毒陽性血清反應，而且可與1∶8稀釋的禽腺病毒Ⅰ型陽性血清反應。

3.3酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)技術可以對FAV I抗體進行精確測定，能更確切地反映病毒感染雞群的情況。ELISA技術原理是先將抗原或抗體置于酶標板上，使其與酶標板底部固定物結合，并保持活性，然后再加入抗體或抗原使其結合，形成抗原抗體復合物，再用酶標記的第二抗原與其結合，形成具有免疫學活性和酶的活性的復合物，加入可以與酶產(chǎn)生帶色產(chǎn)物的底物，使其顯色。產(chǎn)物的量與顏色呈正相關，因此，可以根據(jù)產(chǎn)物的顏色及酶標儀的測定結果對受檢樣品進行定性或定量分析。Calnek等[8]通過純化10個不同血清型毒株，制作包被抗原，建立ELISA方法檢測禽腺病毒抗體。Dawson等[13]建立能夠快速檢測出自然感染的FAV-I 抗體及CEL0株抗體的ELISA方法。 Saifuddin等[14]建立可以檢測出感染低于100 TCID50/mL的 FAd病毒的組織或血液中抗原的 ELISA方法，文艷玲[15]將 Hexon表達的抗原蛋白作為包被抗原，建立檢測 FAV- I抗體的間接 ELISA方法， 其對免疫的 SPF及血清中的抗體敏感性很高。Marek等[16]運用六鄰體表達的重組蛋白作為包被抗原，建立了一種檢測FAdV的ELISA方法和斑點ELISA方法，該ELISA方法陽性檢出率良好。羅思思等[1]用五鄰體表達且純化的重組原核蛋白作為包被抗原，建立了一種快速檢測FAV-I抗體的間接ELISA方法。

4 分子生物學檢測

4.1聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應(polymerase chain Reaction，PCR)是一種利用PCR 儀擴增特定DNA片段的一種分子生物學技術。謝芝勛[17]建立對3個群的FAVI檢測的PCR方法，該方法的敏感性為100 ng；Raue等[18]在保守區(qū)利用根據(jù)hexon基因的4個變異區(qū)設計了特異性引物H1/H2和H3/H4，PCR擴增了FAVI的12個血清型的病毒DNA，均擴出目的片段，但是不能從EDS和HEV的病毒DNA中擴增出任何片段；Xie等[19]建立了對3個群16個不同血清型毒株檢測的PCR方法，敏感性是100 ng，并對21個野毒分離株進行檢測，利用分子雜交技術來提高檢測的敏感性；李天芝等[20]根據(jù) Gen Bank 收錄的Ⅰ群禽腺病毒的hexon基因保守序列，設計引物，并建立檢測Ⅰ群禽腺病毒PCR方法，然后對它的特異性、敏感性進行研究，對Ⅰ群禽腺病毒檢測的靈敏性為1 pg總DNA量。

4.2實時熒光定量PCR實時熒光定量 PCR是在 PCR的反應基礎上加入熒光探針或熒光染料，利用產(chǎn)生的熒光信號實時監(jiān)測整個 PCR擴增過程，最后通過建立的標準曲線對監(jiān)測模板進行定量或定性分析的分子生物學技術。文艷玲等[21]利用的I群禽腺病毒的hexon基因保守序列設計了引物，并根據(jù)不同血清型毒株的保守序列不同建立檢測 I群禽腺病毒12個血清型的 SYBR Green I熒光 PCR方法；Marek等[16]為了對一株I群禽腺病毒進行鑒定分析，利用系統(tǒng)進化分析法和hexon基因L1區(qū)的高通量溶解曲線成功鑒定了這株腺病毒；Steer等[22]根據(jù)I群禽腺病毒的12個血清型的hexon基因進行高通量溶解曲線成功對不同血清型腺病毒進行鑒定。

4.3限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應技術限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技術，其基本原理是用設計的特異性 PCR引物擴增出目的基因，再利用不同等位基因的酶切位點分布不同，用限制性內切酶將擴增的 PCR 片段切割成大小不同的多個片段，再用瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。I群禽腺病毒有12個血清型，各血清型的基因組酶切位點不同，因此可利用此方法對其進行區(qū)分。Meulemans等[23]設計的hexonA/hexonB引物，利用PCR擴增出了12個血清型參考毒株的對應片段，并結合限制性內切核酸酶分析26株分離株的血清型；李海英等[24]利用3對基于Hexon全基因序列設計合成的引物分別對I群禽腺病毒的12種血清型毒株進行PCR擴增，通過限制性內切酶 Hae II 對擴增產(chǎn)物進行酶切，并進行序列測定和PCR-RFLP 分析，最后通過瓊脂糖凝膠電泳成功區(qū)分出12個不同的血清型。唐熠等[25]設計合成了一對根據(jù)I群禽腺病毒的 Hexon 保守基因序列的引物,通過對12種血清型的Hexon基因進行PCR擴增，并使用酶切技術可以對I群禽腺病毒的12個血清型進行分型。

4.4環(huán)介導等溫核酸擴增技術環(huán)介導等溫核酸擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是日本學者Notomi在2000年發(fā)明的一項恒溫核酸擴增新技術，該方法可通過肉眼(能否觀察到白色混濁沉淀判定)或在紫外線下(產(chǎn)物中加入SYBR Green I染料)判定結果。該檢測方法僅需一個水浴鍋即可完成反應，簡單快速，適合在現(xiàn)場與基層部門應用。唐熠等[26]根據(jù)I群禽腺病毒hexon基因保守區(qū)序列設計了一對特異性環(huán)介導等溫擴增引物，并建立一種敏感性可達101copies/pL適用于I群禽腺病毒的LAMP快速檢測方法。通過對建立的LAMP方法與常規(guī)PCR方法進行效果對比，檢出率分別為58.3%和37.5%。表明其建立的LAMP方法更加簡捷、靈敏、特異性高，適用于I群禽腺病毒感染的快速診斷。

4.5核酸探針技術核酸探針技術是根據(jù)堿基的互補配對的原則，用已知的帶有標記核酸序列與被檢測的目的序列互補結合，通過監(jiān)測標記信號來檢測目的基因。該方法特異性強，重復性高。董婷婷[27]制備了地高辛標記的I 群禽腺病毒血清 1、2、4、8和 12 型的核酸探針，而且之間無交叉反應，并應用于臨床樣本檢測。檢測結果發(fā)現(xiàn)，臨床上血清2型、4型和8型較為多發(fā)。朱后順[28]利用地高辛作為標記物，制備I群禽腺病毒核酸探針，臨床樣本進行檢測發(fā)現(xiàn)該探針能檢測出最低1pg的病毒，敏感性很高。王鳳龍等[29]用限制酶HindⅢ和EcoRI 對雞包涵體肝炎六鄰體蛋白基因片段重組質粒進行雙酶切，得到636 bp基因片段的重組質粒，用地高辛標記制備了雞包涵體肝炎病毒 DNA 探針。試驗表明該探針對該腺病毒具有良好的靈敏度和特異性，可用于雞包含體肝炎病毒的分子病理學研究和特異性診斷。

5 結語

近幾年，由I群禽腺病毒引起的雞包涵體肝炎及心包積液綜合征對我國養(yǎng)禽業(yè)造成很大危害，涉及山東、河南、河北、江蘇、湖北、海南、廣西等多個省市，不同品種、日齡的雞群均有報道。I群禽腺病毒有些毒株易與雞傳染性法氏囊病毒、傳染性貧血病毒及H9亞型禽流感病毒混合感染，危害嚴重。目前，在禽腺病毒的流行病學和診斷方面的研究雖已取得較大進展，但在研發(fā)特異性高、敏感性強的快速診斷方法以及高效疫苗等重要領域還需更加深入地研究。