酸奶中高抗氧化活性乳酸菌的篩選及性能研究*

孫志華

(山西省分析科學(xué)研究院， 山西 太原 030006)

酸奶中高抗氧化活性乳酸菌的篩選及性能研究*

孫志華

(山西省分析科學(xué)研究院， 山西 太原 030006)

從三元酸牛奶和伊利全脂調(diào)味酸牛乳樣品中分別分離篩選出乳酸菌菌株B2和C12， 采用革蘭氏染色法觀察其形態(tài)， 并用過氧化氫酶對其鑒定， 考察了兩菌株的自由基清除能力、 抗脂質(zhì)過氧化性能和亞鐵離子螯合能力. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 濃度為108mL-1的菌懸液清除羥自由基能力強(qiáng)于同體積的濃度為1 mmo1/L抗壞血酸； B2和C12對二苯基苦基苯肼自由基清除率分別為21.51%和22.35%， 對超氧陰離子自由基清除率分別為24.86%和27.07%； 抗脂質(zhì)過氧化力分別為20.11%和19.8%， 對亞鐵離子的螯合能力強(qiáng)于蒙牛原味酸牛奶對照普通菌株A4.

乳酸菌； 抗氧化活性； 自由基清除； 抗脂質(zhì)過氧化性； 亞鐵離子螯合； 酸奶

生命有機(jī)體活動(dòng)中生物氧化是一個(gè)至關(guān)重要的過程， 氧化過程會產(chǎn)生自由基， 但是過多的自由基會與磷脂結(jié)合攻擊生物膜， 會使氨基酸殘基突變引起蛋白質(zhì)變性， 會使核酸被修飾從而引起DNA破壞， 最終將導(dǎo)致腫瘤、 動(dòng)脈粥樣硬化、 關(guān)節(jié)炎、 肺氣腫、 肝硬化等疾病的發(fā)生[1-3]. 為了減少氧化損傷， 各種合成的抗氧化劑如叔丁基羥基茴香醚、 2， 6-二叔丁基對甲酚、 特丁基對苯二酚和丁羥甲苯被廣泛使用[4]， 然而， 這些合成的抗氧化劑會造成肝損害， 并有致癌特性[5]， 因此需要尋找低廉、 安全無毒的天然抗氧化劑[6]， 從而保護(hù)人體自由基， 這對延緩多種慢性疾病具有非常重要的意義.

乳酸菌因其抗氧化活性近幾年被人們廣泛接受， 它具有降低膽固醇、 抗癌、 增強(qiáng)免疫力、 延緩衰老等作用[7-8]. 乳酸菌的來源廣泛， 如乳制品、 泡菜、 發(fā)酵豆制品等[9-11]， 其中， 從酸奶中獲得乳酸菌最廉價(jià)易得. 乳酸菌抗氧化機(jī)理的研究是其作為新型抗氧化劑工業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ).

本研究對從酸奶中分離、 篩選出活性較強(qiáng)的乳酸菌進(jìn)行抗脂質(zhì)過氧化率、 二苯基苦基苯肼自由基清除率、 超氧陰離子自由基清除率、 羥自由基清除率、 亞鐵離子鰲合率的測定， 以確定分離得到乳酸菌的抗氧化活性， 以期為乳酸菌在抗氧化性方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

蒙牛原味酸牛奶(A)， 三元酸牛奶(B)， 伊利全脂調(diào)味酸牛乳(C)均從超市購得.

過氧化氫， 二苯基苦基苯肼自由基， 三氯乙酸， 硫代巴比妥酸， 丁基化羥基甲苯， 二乙三胺五乙酸， 三羥甲基氨基甲烷， 抗壞血酸(Vc)， 均為分析純, 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

溴甲酚綠(BCG)牛乳營養(yǎng)培養(yǎng)基， MRS液體培養(yǎng)基， 半固體MRS培養(yǎng)基.

潔凈工作臺： VD-B20， 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司， 智能生化培養(yǎng)箱： SHX， 上海華連醫(yī)療器械有限公司， 光學(xué)顯微鏡： XSZ-3GB， 北京格拉威爾科技有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗氧化乳酸菌的篩選

1) 分離

將用無菌PBS緩沖液逐級稀釋的3種酸奶樣品涂布在BCG牛乳培養(yǎng)基平板上， 30 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后， 將顏色變化明顯的典型菌落挑選出來， 采用劃線分離純化， 革蘭氏染色， 鏡檢， 將G+菌株再次接種于半固體MRS培養(yǎng)基上， 于4 ℃保藏備用.

2) 篩選

按1%的接種量分別接入含不同濃度(0.4%, 0.7%, 1.0%)過氧化氫的MRS液體培養(yǎng)基， 置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 取菌液時(shí)間間隔為2 h， 取液后用分光光度計(jì)測其光密度(OD)值， 得到在不同起始過氧化氫濃度下每個(gè)菌株的生長趨勢， 以篩選得到高過氧化氫耐受性的乳酸菌.

3) 富集

將篩選所得菌株體積分?jǐn)?shù)為10%的接種量接于MRS液體培養(yǎng)基中， 恒溫30 ℃培養(yǎng).

1.2.2 高抗氧化活性乳酸菌的鑒定

1) 乳酸菌細(xì)胞形態(tài)鑒定

將菌種接種到MRS培養(yǎng)基中生長到對數(shù)期， 革蘭氏染色， 光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)、 大小.

2) 過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)

在生長于平板上的菌落上加一滴雙氧水(3%)， 觀察有無氣泡產(chǎn)生， 若有氣泡產(chǎn)生， 表明過氧化氫酶為陽性.

1.2.3 乳酸菌活細(xì)胞(IC)的制備

將培養(yǎng)液用離心機(jī)(4 000 r/min)離心 15 min， 收集菌體并洗滌， 用無菌PBS緩沖液配制混懸液， 使其菌數(shù)為108mL-1.

1.2.4 抗氧化活性的測定

1) 羥自由基(HO·)清除能力的測定

取2.6 mmol/L鄰-菲羅琳1 mL， 依次加入pH 7.4的PBS 1 mL， 蒸餾水1 mL， 充分混勻后， 加入2.5 mmol/L FeSO41 mL， 混勻后加20 mmol/L H2O21 mL， 混合液中分別加入 0.5， 1， 1.5， 2.0， 2.5 mL乳酸菌IC和1 mmo1/L的抗壞血酸， 在37 ℃水浴 1.5 h 后于536 nm處測定其吸光度A， 以PBS為對照， 按式(1)計(jì)算羥自由基清除率.

式中：As為樣品的吸光值；Ap為水浴后樣品的吸光值；Ab為PBS的吸光值.

2) 二苯基苦基苯肼自由基(DPPH)清除能力的測定

將1 mL乳酸菌IC加入至 1 mL的0.2 mmol/L DPPH自由基甲醇溶液， 無光室溫下反應(yīng)0.5 h， 離心， 上清液于517 nm處測吸光度A， 按式(2)計(jì)算得DPPH自由基清除率.

式中：As為樣品的吸光值；Ab為PBS的吸光值.

式中：A00為溶液中不加樣品和鄰苯三酚的吸光度；A01為溶液中加入了鄰苯三酚的吸光度；A10為溶液中不含鄰苯三酚的吸光度；A11為溶液中加入了樣品和鄰苯三酚的吸光度.

4) 抗脂質(zhì)過氧化作用的測定

在1 mL乳酸菌中加入1 mL亞油酸和0.5 mL pH=7.4 PBS緩沖液的混合液， 再加入一定量硫酸和過氧化氫進(jìn)行催化氧化， 于37 ℃反應(yīng)12 h. 再將0.2 mL的4%三氯乙酸， 2 mL的0.8% 硫代巴比妥酸， 0.2 mL的0.4%丁基化羥基甲苯加入至混合液中， 100 ℃反應(yīng)30 min， 冷卻后離心收集上清液， 在532 nm下測吸光值A(chǔ)， 以PBS為對照， 按照式(4)計(jì)算抗脂質(zhì)過氧化率.

式中：As為樣品的吸光值；Ab為PBS的吸光值.

5) 亞鐵離子(Fe2+)鰲合能力的測定

將1 mL乳酸菌IC加入至由0.1mL硫酸亞鐵(0.4%)、 0.1 mL抗壞血酸(1%)和1 mL氫氧化鈉(0.2 moL/L)組成的混合液中， 37 ℃水浴20 min. 三氯乙酸沉淀蛋白， 3 000 r/min離心10 min， 吸取0.2 mL上清液， 加入2 mL鄰-菲羅琳(0.1%)靜置10 min， 于510 nm處測定吸光值.

2 結(jié)果與討論

2.1 抗氧化乳酸菌的分離、 篩選、 富集及鑒定

將10-2濃度的三元酸牛奶(B)和伊利全脂調(diào)味酸牛乳(C)涂布在分離培養(yǎng)基上， 顏色由藍(lán)紫色變成了綠色， 挑選疏密有致的菌落接種于斜面培養(yǎng)， 經(jīng)過反復(fù)劃線分離， 并通過過氧化氫篩選與革蘭氏染色得到2株具有抗過氧化氫的菌株， 編號B2和C12， 其在顯微鏡下的形態(tài)見圖 1. 從圖中可以看出， 這兩種菌株的菌體形態(tài)基本一致. 后將這兩菌株進(jìn)行富集培養(yǎng). 另外， 從蒙牛原味酸牛奶中獲得A4菌株.

圖 1 兩株乳酸菌在顯微鏡下的菌體形貌(30×100倍)Fig.1 Microscope morphology of the two lactic acid bacteria (30×100)

由圖 1 可以看出， 經(jīng)革蘭氏染色后， 兩株菌均成革蘭氏陽性， 短棒狀. 將一滴3%的H2O2分別滴加至B2和C12菌落上， 結(jié)果顯示， 兩個(gè)菌落均無氣泡產(chǎn)生， 表明其都屬過氧化氫酶陰性. 由以上的鑒定結(jié)果可以初步斷定菌株B2和C12為乳酸菌.

2.2 乳酸菌的抗氧化性能

2.2.1 羥自由基(HO·)的清除能力

羥自由基是一種氧化性很強(qiáng)的自由基， 能夠降解DNA、 損傷生物膜和糖類分子， 是導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和人體多種細(xì)胞損傷的最主要的自由基[12]. 因此， 對羥基自由基的清除能力是抗氧化性能的一個(gè)主要指標(biāo). 圖2顯示了抗氧化活性較強(qiáng)的不同濃度的活細(xì)胞B2和C12菌株以及抗壞血酸(陽性對照)對HO·的清除作用.

圖 2 菌體加入量對羥自由基的清除能力曲線Fig.2 Scavenging capacity curves of lactic acid bacteria to hydroxyl free radicals

從圖 2 中可以看出， 在相同濃度下， 隨著加入菌體體積的增加， 乳酸菌對羥自由基的清除率也在相應(yīng)的增大. 在加入菌體體積為2.5 mL時(shí)， B2菌株的羥自由基清除率為61.4%， 高于Vc(49.5%). 這主要是由于在乳酸菌細(xì)胞內(nèi)存在著針對Cu2+和Fe2+的天然螯合物質(zhì)， 這些物質(zhì)能夠螯合Cu2+和Fe2+， 從而減少羥自由基的產(chǎn)生[13].

2.2.2 二苯基苦基苯肼自由基(DPPH)清除能力

B2和C12菌株對DPPH自由基的清除率見圖 3.

圖 3 B2和C12乳酸菌對DPPH的清除率Fig.3 DPHH scavenging ratio of B2 and C12 lactic acid bacteria

DPPH分光測定法用來評價(jià)某種物質(zhì)的抗氧化能力， 是篩選和評價(jià)抗氧化效果的一種常用的有效方法. 由圖 3 可以看出， B2和C12兩菌株對DPPH自由基都有很高的清除能力， 其中菌株C12清除率較高， 為22.35%， 這可能是因?yàn)槿樗峋a(chǎn)生的胞外多糖具有DPPH自由基的清除活性[14].

圖 4 B2和C12菌株對超氧陰離子自由基的清除率Fig.4 Scavenging ratio of B2 and C12 bacteria to superoxide anion free radicals

2.2.4 抗脂質(zhì)過氧化能力

丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物， 它能夠破壞機(jī)體的生物大分子蛋白質(zhì)、 核酸等， 造成機(jī)體老化以及誘發(fā)多種疾病. 因此， MDA含量的測定， 能夠在一定程度上反映抗脂質(zhì)過氧化的能力， 是常用的一種脂質(zhì)過氧化的指標(biāo). B2和C12菌株的活細(xì)胞體抗脂質(zhì)過氧化的清除率如圖 5 所示.

圖 5 B2和C12菌株抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.5 Anti-lipid peroxidation of B2 and C12 bacteria

本實(shí)驗(yàn)對兩株抗氧化活性較強(qiáng)菌株B2和C12的抗脂質(zhì)過氧化率進(jìn)行3次測定， 得到B2和C12的抗脂質(zhì)過氧化清除率分別為20.11%和19.8%.

2.2.5 亞鐵離子(Fe2+)鰲合能力

Fe2+是在金屬離子中最典型的促氧化劑， 它促進(jìn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的進(jìn)行， 進(jìn)一步損害機(jī)體生物膜. 將菌株B2和C12以及對照普通菌株A4對Fe2+的螯合率分析以了解其抗氧化水平， 結(jié)果如圖 6 所示.

圖 6 三株菌對亞鐵離子的螯合能力Fig.6 Chelating capacity of three strain to ferrous ion

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出， 這3種菌株均對Fe2+有螯合能力， 但B2和C12菌株的螯合能力為52%和55%， 明顯高于普通對照菌株A4的螯合能力(30%).

3 結(jié) 論

從酸奶樣品中分離、 篩選， 并用革蘭氏染色和過氧化氫酶活性鑒定獲得2株具有高抗氧化活性的B2和C12乳酸菌菌株. 對B2和C12菌株進(jìn)行抗氧化活性測定得出， 這兩株乳酸菌活性細(xì)胞對羥自由基的抗氧化活性強(qiáng)于同體積的Vc； 對DPPH自由基的清除率性能較好， 都高于20%； C12菌株超氧陰離子自由基的清除能力高于B2； 兩株菌的抗脂質(zhì)過氧化能力都較高， 對亞鐵離子的螯合能力較高， 高于50%， 強(qiáng)于普通菌株A4. 本文研究結(jié)果希望對推動(dòng)綠色抗氧化劑研究提供一定理論基礎(chǔ).

[1] Pham-Huy L A, He H, Pham-Huy C. Free radicals, antioxidants in disease and health[J]. Journal of Biomedical Science, 2008, 4(2)： 89-96.

[2] Lobo V, Patil A, Phatak A, et al. Free radicals, antioxidants and functional foods： impact on human health[J]. Pharmacognosy Reviews, 2010, 4(8)： 118-126.

[3] Kin J E， Kim J， Lee K W， et al. Cancer chemopreventive effects of Lactic acied bacteria[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology， 2007， 17(8)： 1227-1235.

[4] 李浩峰， 李忠海， 王利兵， 等. 包裝材料中三種抗氧化劑的快速檢測[J]. 食品與機(jī)械， 2013， 29(1)： 88-91.

Li Haofeng， Li Zhonghai， Wang Libing， et al. Determination of three antioxidants existed in food and drug packaging materials using gas chromatography[J]. Food & Machinery， 2013， 29(1)： 88-91. (in Chinese)

[5] 徐琴， 湯志旭， 林洪， 等. 反相高效液相色譜-熒光法同時(shí)測定食品中叔丁基對苯二酚和叔丁基羥基茴香醚的含量[J]. 分析化學(xué)， 2008， 36(2)： 274.

Xu Qin， Tang Zhixu， Lin Hong， et al. Simultaneous determination of tert-butyl hydroquinone and butylated hydroxyanisole in foods by high performance liquid chromatography with fluorimetric detection[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry， 2008， 36(2)： 274. (in Chinese)

[6] Ahire J J， Mokashe N U， Patil H J, et a1. Antioxidative potential of folate producing probiotic lactobacillus helveticus CD6[J]. Journal of Food Science and Technology， 2013， 50(1)： 26-34.

[7] 王瑞君. 降解膽固醇乳酸菌的篩選及中草藥與乳酸菌的協(xié)同作用[J]. 食品科學(xué)， 2013， 34(1)： 210-214.

Wang Ruijun. Sceening of cholesterol-lowering lactic acid bacteria and synergic effect with Chinese herbal medicines[J].Food Science， 2013， 34(1)： 210-214. (in Chinese)

[8] Chen Q， Kong B H， Sun Q X， et al. Antioxidant potential of a unique LAB culture isolated from Harbin dry sausage： In vitro and in a sausage model[J]. Meat Science， 2015， 110： 180-188.

[9] Luang-In V， Deeseenthum S. Exopolysaccharide-producing isolates from Thai milk kefir and their antioxidant activities[J]. Food Science and Technology， 2016， 73： 592-601.

[11] 張艷芳， 郭焱， 李昌任， 等. 發(fā)酵豆制品中乳酸菌分離及其鑒定和功能研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工， 2016(2)： 38-42.

Zhang Yanfang， Guo Yan， Li Changren， et al. Isolation of lactic acid bacteria showing probiotic activities from chinese traditional fermented foods[J]. Farm Products Processing, 2016(2)： 38-42. (in Chinese)

[12] Nimse S B， Pal D. Free radicals， natural antioxidants， and their reaction mechanisms[J]. RSC Advances， 2015, 5(35)： 27986-28006.

[13] Kullisaar T， Zilmer M， Mikelsaar M， et a1. Two antioxidative lactobacilli strains promising probiodcs[J]. Intemational Journal of Food Microbiology， 2002， 72(3)： 215-224.

[14] Xu R， Shang N， Li P. In vitro and in vivo antioxidant activity of exopolysaccharide Fractions from Bifidobacterium animalis RH[J]. Anaerobe， 2011， 17(5)： 226-231.

[15] Lee B J， Kim J S， Kang Y M， et a1. Antioxidant activity andγ-aminobutyric acid(GABA)content in sea tangle fermented by Lactobacillus brevis BJ20 isolated from traditional fermented foods[J]. Food Chemistry， 2010， 122(1)： 271-276.

ScreeningandPerformanceStudyofLacticAcidBacteriaPossessingHighAntioxidantActivityfromYogurt

SUN Zhi-hua

(Shanxi Academy of Analytical Sciences， Taiyuan 030006, China)

The Lactic acid bacteria were isolated and screened from sanyuan yogurt and yili whole milk yogurt, and strains of B2and C12were obtained respectively. The morphology was observed with gram staining method and the identification was performed by hydrogen peroxide enzyme. Free radical scavenging ability, anti-lipid peroxidation and the ferrous ion chelating power of the two strains were explored respectively. The experimental results indicate that the same volume of 108mL-1bacterial suspension shows higher hydroxyl radical scavenging ability than 1mmo1/L Vc. For B2and C12, 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH) radical scavenging rate are 21.51% and 22.35%, superoxide anion radical scavenging rate are 24.86% and 27.07% respectively, and superoxide anion radical scavenging rate are 24.86% and 27.07%, anti-lipid peroxidation ability are 20.11% and 19.8%. The chelating power of strains of B2and C12for ferrous ion is stronger than contrasted strain A4, which comes from mengniu pure yogurt.

lactic acid bacteria; antioxidant activity; radicals scavenging; anti-lipid peroxidation; ferrous ion chelating; yogurt

1673-3193(2017)03-0302-05

2016-10-15

孫志華(1975-)， 女， 助理研究員， 碩士， 主要從事分析檢測技術(shù)的研究 .

Q93-3

A

10.3969/j.issn.1673-3193.2017.03.010