丹紅注射液對動脈粥樣硬化小鼠主動脈斑塊的干預(yù)作用及基因組DNA甲基化水平和甲基化轉(zhuǎn)移酶的影響

張穎 周明學(xué) 李思耐 任攀 劉衛(wèi)紅 尚菊菊 劉紅旭

摘要 目的：研究丹紅注射液對高脂喂養(yǎng)的ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠動脈粥樣硬化（As）斑塊的干預(yù)作用及基因組DNA甲基化水平和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的影響。方法：將40只8周齡雄性ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)6周后隨機(jī)分為模型組、阿托伐他汀鈣片（商品名：立普妥）（陽性對照組）、丹紅注射液低劑量組和高劑量組（n=10），給予藥物腹腔注射6周后。檢測其血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。行HE染色，圖像分析測量小鼠主動脈As斑塊面積。采用高效液相色譜（HPLC）法檢測小鼠血清基因組甲基化水平，采用ELISA法檢測各組小鼠血清DNMTs水平。免疫組化染色，圖像分析測量小鼠主動脈As斑塊內(nèi)DNMT1的表達(dá)。結(jié)果：與模型組相比，丹紅注射液高劑量和低劑量組小鼠血清TG水平明顯降低（P<0.01）、丹紅注射液高劑量組LDL-C水平明顯降低（P<0.01），丹紅注射液低劑量組HDL-C水平明顯升高（P<0.05），丹紅注射液高劑量組小鼠動脈粥樣硬化指數(shù)顯著降低（P<0.01）。丹紅注射液高劑量和低劑量組小鼠血清基因組甲基化和DNMTs水平顯著降低（P<0.01）。丹紅注射液與模型組相比，丹紅注射液組As小鼠的校正后主動脈As斑塊面積顯著降低，以及斑塊內(nèi)DNMT1表達(dá)顯著降低（P<0.01）。結(jié)論：丹紅注射液可降低As小鼠血脂水平，減少As斑塊面積，其機(jī)制可能與降低As小鼠血清基因組甲基化水平和整體DNMTs水平和抑制As小鼠主動脈斑塊DNMT1表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 動脈粥樣硬化；丹紅注射液；DNA甲基化；血脂異常；DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1

Abstract Objective：To study the effects of Danhong Injection on atherosclerotic plaque and the levels of the global genomic DNA methylation and DNMTs in ApoE knockout （ApoE-/-） mice fed with a high fat diet.Methods：Forty 8 week-old male ApoE-/-mice were fed with a high fat diet for 6 weeks were randomly divided into the control group，the Lipitor （positive control group），the Danhong injection low-dose group （DHI-L group），and the Danhong injection high-dose group （DHI-H group），then were intraperitoneally injected corresponding medicine for 6 weeks，n=10.The levels of total cholesterol （TC），triglyceride （TG），low density lipoprotein cholesterol （LDL-C），and high density lipoprotein cholesterol （HDL-C） in serum were detected.HE staining was used to measure the area of As plaque of mice.Immuno-histochemical staining and image analysis were used to measure the expressions of DNMT1 in the Atherosclerosis （As） plaques of mice.Results：Compared with the control group，the TG levels in serum of the mice in the DHI-L group and DHI-H group were significantly decreased （P<0.01），and the LDL-C levels on DHI-H group were significantly decreased （P<0.01）.Besides，the HDL-C levels in DHI-L group were significantly increased （P<0.05）.The atherosclerosis indexes of the mice in DHI-H group were significantly decreased （P<0.01）.The levels of global genomic DNA methylation and the DNMTs in serum of the mice on the DHI-L group and DHI-H group were significantly decreased （P<0.01）.Compared with the control group，the atherosclerotic plaque areas of the mice on the DHI-L group and DHI-H group were significantly reduced （P<0.01），and the expressions of DNMT1 on the DHI-L group and DHI-H group were significantly reduced （P<0.01）.Conclusion：Danhong Injection can reduce the blood lipid level and the plaque area of As mice.The mechanism can be related to the reduction of levels of global genomic DNA methylation and the DNMTs in serum and the inhibition of DNMT1 expression in the aortic plaques of As mice.

Key Words Atherosclerosis； Danhong injection； Dyslipidemia； DNA methyltransferase 1； Peroxisome proliferator activated receptor gamma

中圖分類號：R285；R543.1+2；R242文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.003

丹紅注射液主要由活血化瘀中藥丹參和紅花組成，具有活血和血、通脈舒絡(luò)的作用。臨床上廣泛應(yīng)用于動脈粥樣硬化（As）性心腦血管疾病的治療，具有抗炎、抗血栓、調(diào)節(jié)血脂、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)等藥理作用。新近研究表明，As性心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展與DNA甲基化為代表的表觀遺傳學(xué)機(jī)制密切相關(guān)[1]，而DNA甲基化是參與As形成發(fā)展的重要機(jī)制[2]。但目前從表觀遺傳學(xué)角度研究丹紅注射液干預(yù)As及其相關(guān)心腦血管病的研究尚未見報道。新近研究表明，巨噬細(xì)胞中的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）被抑制可調(diào)控小鼠的慢性炎性反應(yīng)和As的進(jìn)展[3]。因此，本研究以高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠為觀察對象，探討丹紅注射液對高脂喂養(yǎng)的ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠As斑塊的干預(yù)作用，并通過檢測斑塊內(nèi)DNMT1的表達(dá)，來研究丹紅注射液抗As的可能DNA甲基化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 6～8周齡ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J），8周齡，體重18～20 g，購自北京維通利華實(shí)驗技術(shù)有限公司，40只，高脂飼養(yǎng)6周。

1.1.2 藥物 阿托伐他汀鈣片（商品名：立普妥），購買于上海輝瑞制藥公司，批號H20051408。丹紅注射液，商品名倍通，批號16071028，購買于山東丹紅制藥有限公司。

1.1.3 試劑與儀器 血清總膽固醇（TC）檢測試劑盒（批號7007210506）、血清三酰甘油（TG）檢測試劑盒（批號7006210506）、血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）檢測試劑盒（批號7021220605）、血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測試劑盒（批號7020210506），均購自英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司。小鼠血清DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）檢測試劑盒購于美國R&D公司（CK-E433652M）。DNMT1抗體（貨號ab13537）購自Abcam公司。血生化指標(biāo)檢測采用日本奧林巴斯株式會社全自動生化儀（AU480）。美國Image-ProPlus Version 5.0（IPP）圖像分析軟件。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 所有小鼠隨機(jī)分為模型組、阿托伐他汀鈣片（商品名：立普妥））組（陽性對照組）3.34 mg/kg、丹紅注射液高劑量組6 mL/kg，和丹紅注射液低劑量組3 mL/kg，n=10。

1.2.2 給藥方法 丹紅注射液高劑量和低劑量分別選取臨床常用劑量和臨床常用劑量的1/2，并按成人與小鼠的給藥劑量換算系數(shù)折算成小鼠用量灌胃給藥[4]，1次/d，灌胃給藥6周。模型組給予等量的生理鹽水。高脂飼料配方為脂肪21%（wt/wt）、膽固醇0.15%的西方類型膳食飼料[5]。喂養(yǎng)12周。各組動物在喂養(yǎng)12周后，頸椎脫臼法處死，眶下靜脈叢取血，保留血清，無菌條件下取心臟，心臟用4%多聚甲醛固定。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 1）血脂檢測：采用氧化酶法和直接法檢測丹紅注射液對高脂喂養(yǎng)12周ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。動脈粥樣硬化指數(shù)（atherosclerosis index，AI）=（TC-HDL-C）/HDL-C。2）基因組DNA甲基化水平檢測：采用高效液相色譜法（HPLC）法檢測茶飲料對高脂喂養(yǎng)12周ApoE-/-小鼠血清DNA甲基化水平。3）整體DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶水平檢測：采用ELISA法檢測茶飲料對高脂喂養(yǎng)12周ApoE-/-小鼠血清DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）水平的影響。4）組織病理：a.小鼠心底部橫斷面連續(xù)切片，每隔50 μm連續(xù)取6張切片，切片厚5 μm。按Suzuki等[6]確立的方法，主動脈根部以主動脈瓣為標(biāo)志選取4個切面，分別為：升主動脈最近端橫截面，切面形態(tài)呈圓形；主動脈瓣起始橫截面；主動脈瓣附著部位，并有冠狀動脈開口；主動脈瓣完全出現(xiàn)并匯合在一起。我們在實(shí)驗中統(tǒng)一選取第四切面，分別進(jìn)行病理HE染色。b.IPP圖像軟件分析測量小鼠主動脈As斑塊面積，具體如下：測量管腔面積（Lumen Area，LA，mm2）、內(nèi)彈力膜圍繞面積（Internal Elastic Laminal Area.IELa，mm2），并計算斑塊面積、校正后斑塊面積。公式換算如下：斑塊面積（Plaque Area，PA，mm2）=IELa-LA；校正后斑塊面積=PA/IELa。5）免疫組化法檢測：免疫組化染色選取第三切面，采用兩步法測定斑塊內(nèi)DNMT1蛋白表達(dá)（抗體稀釋度為1∶100），每組均以PBS代替一抗作為陰性對照，在100倍鏡下每張切片選取5個不同的視野，對陽性區(qū)域累積面積進(jìn)行定量測定，最后求取斑塊內(nèi)陽性區(qū)域面積占斑塊面積的百分比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用（±s）形式表示，組間比較在方差齊時用方差分析，兩兩比較用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以P<0.01為差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠主動脈粥樣硬化模型的復(fù)制 高脂喂養(yǎng)12周后，ApoE-/-小鼠主動脈出現(xiàn)典型的As斑塊，主動脈管壁上可觀察到典型的富含膽固醇結(jié)晶的As斑塊，斑塊有成熟的纖維帽覆蓋（圖1B，黑箭頭所示），說明復(fù)制小鼠As模型成功。

2.2 丹紅注射液對高脂喂養(yǎng)12周ApoE-/-小鼠血脂和動脈粥樣硬化指數(shù)的影響 如圖2和圖3所示，與模型組相比，丹紅注射液高劑量和低劑量組小鼠血清TG水平明顯降低（P<0.01）、丹紅注射液高劑量組LDL-C水平明顯降低（P<0.01），丹紅注射液低劑量組HDL-C水平明顯升高（P<0.05），和丹紅注射液高劑量組小鼠動脈粥樣硬化指數(shù)（atherosclerosis index，AI）顯著降低（P<0.01），與陽性對照阿托伐他汀鈣片（商品名：立普妥）組相比，丹紅注射液高劑量和低劑量組小鼠血脂各指標(biāo)和AI均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 丹紅注射液對高脂喂養(yǎng)12周ApoE-/-小鼠校正后主動脈斑塊面積的影響 藥物干預(yù)6周后，經(jīng)HE染色和IPP圖像軟件分析結(jié)果顯示：與模型組相比，丹紅注射液高、低劑量組和阿托伐他汀鈣片（商品名：立普妥）組小鼠的校正后主動脈As斑塊面積均顯著降低（P<0.01），兩給藥組之間無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖4）。

2.4 丹紅注射液對高脂喂養(yǎng)12周ApoE-/-小鼠血清基因組DNA甲基化水平和DNMTs表達(dá)的影響 藥物干預(yù)6周后，處死采血后經(jīng)HPLC法檢測小鼠血清DNA甲基化水平和采用ELISA法檢測血清DNMTs水平。結(jié)果顯示：與模型組相比，阿托伐他汀鈣片（商品名：立普妥）組和丹紅注射液組小鼠血清DNA甲基化和DNMTs水平顯著降低（P<0.01），與陽性對照藥

2.5 丹紅注射液對高脂喂養(yǎng)12周ApoE-/-小鼠主動脈斑塊內(nèi)DNMT1表達(dá)的影響 藥物干預(yù)6周后，經(jīng)免疫組化染色和IPP圖像軟件分析結(jié)果顯示：與模型組相比，阿托伐他汀鈣片（商品名：立普妥）組和丹紅注射液低劑量、高劑量組小鼠主動脈As斑塊DNMT1表達(dá)顯著降低（P<0.01），兩給藥組之間無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖6）。

3 討論

丹紅注射液臨床上廣泛應(yīng)用于動脈粥樣硬化（As）性心腦血管疾病的治療，具有抗炎、抗血栓、調(diào)節(jié)血脂、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)等藥理作用。新近研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化是導(dǎo)致As和脂代謝紊亂發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[7]。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，丹紅注射液可降低血脂和動脈粥樣硬化指數(shù)（AI），減小As斑塊面積，其機(jī)制可能與降低主動脈斑塊內(nèi)DNMT1表達(dá)有關(guān)。

我們的研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，丹紅注射液可在不同程度上改善高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠的血脂水平，并且明顯降低AI。此外，病理實(shí)驗結(jié)果表明，丹紅注射液可明顯降低As小鼠的主動脈斑塊面積，與既往研究結(jié)果相一致[8]。

As是一種由多個基因及環(huán)境因素相互作用所致的常見復(fù)雜性疾病，其發(fā)病機(jī)制根本在于一系列基因的功能或表達(dá)水平的改變?，F(xiàn)有研究表明，DNA甲基化異常是As發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。Sharma等[9]用隊列研究的方法研究了137例造影證實(shí)的冠心病患者和150例健康人外周血淋巴細(xì)胞的基因組甲基化水平，發(fā)現(xiàn)冠心病患者淋巴細(xì)胞基因組甲基化水平明顯高于健康人。Zaina等[10]高通量微陣序列技術(shù)比較了人主動脈粥樣硬化組織和正常主動脈組織所有的基因甲基化水平，發(fā)現(xiàn)粥樣硬化組織許多基因位點(diǎn)呈高甲基化水平，并給出了粥樣硬化組織高甲基化基因位點(diǎn)圖譜。我們的研究結(jié)果顯示，經(jīng)HPLC法檢測，丹紅注射液可顯著降低As小鼠血清基因組DNA甲基化水平，經(jīng)ELISA法檢測，丹紅注射液可顯著降低As小鼠血清DNMTs水平，說明干預(yù)DNA甲基化可能是丹紅注射液抗As的作用機(jī)制之一。

DNA甲基化包括從頭甲基化和維持甲基化2種類型。催化和維持甲基化的酶被稱為甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT），主要包括DNMT1，DNMT2，DNMT3三種。DNMT1的作用主要是在DNA復(fù)制時維持甲基化[11]。DNMT3可以分為DNMT3A，DNMT3B和DNMT3L三種，DNMT3A和DNMT3B的作用主要是介導(dǎo)DNA的從頭甲基化[12]?；蛐陆芯勘砻?，巨噬細(xì)胞中的DNMT1被抑制可調(diào)控小鼠的慢性炎性反應(yīng)和As的進(jìn)展[3]。本研究結(jié)果顯示，丹紅注射液可明顯抑制高脂喂養(yǎng)12周的ApoE-/-小鼠主動脈As斑塊內(nèi)DNMT1的表達(dá)，說明DNMT1可能是丹紅注射液抗As甲基化機(jī)制的重要靶點(diǎn)。

綜上所述，丹紅注射液可明顯降低As小鼠血脂水平，減少As斑塊面積，發(fā)揮抗As作用，其機(jī)制可能與降低As小鼠血清基因組甲基化水平和整體DNMTs水平和抑制As小鼠主動脈斑塊DNMT1表達(dá)有關(guān)。

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