CD44、CD133耦連miR-425裝載納米脂質(zhì)體對結(jié)直腸癌干細(xì)胞PDL-1表達(dá)的下調(diào)作用

賈良勇 許 娜 王興寧 李 慧

·基礎(chǔ)研究·

CD44、CD133耦連miR-425裝載納米脂質(zhì)體對結(jié)直腸癌干細(xì)胞PDL-1表達(dá)的下調(diào)作用

賈良勇 許 娜 王興寧 李 慧

目的探究CD44、CD133耦連miR-425裝載納米脂質(zhì)體對結(jié)直腸癌干細(xì)胞PDL-1表達(dá)的下調(diào)作用。方法

選擇結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116分選出CD44、CD133/1+細(xì)胞，進(jìn)行miR-425裝載納米脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，分為對照組(轉(zhuǎn)染control載體)、實驗組(轉(zhuǎn)染miR-425慢病毒載體)，空白組以納米脂質(zhì)體代替，測定干細(xì)胞生長狀態(tài)，檢測PDL-1表達(dá)水平。結(jié)果分選的CD 133/1+細(xì)胞呈圓形，12 h后開始貼壁生長，狀態(tài)良好。qRT-PCR檢測顯示實驗組的miR-425的相對表達(dá)水平為(182.44±22.19)，對照組與空白組分別為(1.84±1.11)和(1.67±0.98)，實驗組明顯高于對照組與空白組(P<0.05)。MTT檢測結(jié)果表明，與空白組(0.78±0.22)、對照組(0.81±0.17)比較，實驗組(0.24±0.15)的HCT116細(xì)胞生長速度明顯減慢(P<0.05)?？瞻捉M與對照組的細(xì)胞增殖率分別為(0.48±0.14)與(0.51±0.18)，都明顯高于實驗組的(0.30±0.11)。Western blot檢測分析顯示實驗組、對照組、空白組的PDL-1相對表達(dá)量分別為(0.33±0.13)、(0.76±0.21)和(0.82±0.15)，實驗組明顯低于對照組與空白組(P<0.05)。結(jié)論CD44、CD133耦連miR-425裝載納米脂質(zhì)體能抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞PDL-1的表達(dá)，從而顯著抑制干細(xì)胞的生長、增殖能力。

miR-425；納米脂質(zhì)體；結(jié)直腸癌；干細(xì)胞；PDL-1

結(jié)直腸癌是世界上常見的消化道惡性腫瘤之一，當(dāng)前在我國的發(fā)病人數(shù)越來越多[1]?，F(xiàn)代研究表明結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個由正常組織經(jīng)過良性病變逐步演變?yōu)閻盒阅[瘤的過程，也是一個多步驟、多因素參與的過程，伴隨著基因水平和表觀遺傳水平改變的累積[2-3]。干細(xì)胞是一類能夠自我更新并具有多向分化潛能的早期未分化細(xì)胞，CD133分子是結(jié)腸癌干細(xì)胞的重要標(biāo)記分子，CD44也可能是結(jié)腸癌干細(xì)胞的標(biāo)記，并且部分CD133+細(xì)胞不表達(dá)CD44，因此CD44可作為CD133+細(xì)胞進(jìn)一步純化的分子標(biāo)記[4-5]。miRNA 是一類長度為21～25個核苷酸組成的非編碼單鏈小分子RNA，可抑制靶mRNA 翻譯，對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后翻譯和表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)生物體的各種生物學(xué)行為[6-7]。多數(shù)結(jié)直腸癌經(jīng)歷了正常腸組織、良性息肉、腺瘤、惡性腫瘤的演變過程，這一過程也伴隨多種miRNA表達(dá)的異常變化[8-9]。細(xì)胞程式死亡-配體1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)也是人類體內(nèi)的一種蛋白質(zhì)，由CD274基因編碼，可以傳導(dǎo)抑制性的信號，減少淋巴結(jié)CD8+ T細(xì)胞的增生[10]。本文探究了CD44、CD133耦連miR-425裝載納米脂質(zhì)體對結(jié)直腸癌干細(xì)胞PDL-1表達(dá)的下調(diào)作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究標(biāo)本

研究時間為2016年1月至2016年12月，人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)細(xì)胞所需的DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)等購自GIBCO公司，PE標(biāo)記CD44、CD133鼠抗人單克隆抗體(PE-AC133，Miltenyi Biotec)，RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，引物由上海生工合成，cDNA合成試劑盒和Real-time PCR試劑均購自Sigma公司，miR-425慢病毒載體及其對照載體、納米脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。所有溶液均由滅菌去離子水配制，細(xì)胞株經(jīng)檢測，無支原體污染。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

HCT116細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為高糖型DMEM，含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素。以0.02%EDTA-2Na和0.25%胰蛋白酶1∶1混合液消化傳代，每3天傳動帶1次，每天更換培養(yǎng)液1次。以同型對照PE熒光強(qiáng)度為本底熒光，將此區(qū)域設(shè)定為CD44、CD133/1+細(xì)胞的門，計算百分比，從而分選出CD44、CD133/1+細(xì)胞與CD44、CD133/1-細(xì)胞。

1.3 miR-425轉(zhuǎn)染

將miR-425和control離心用RNase-free H2O溶解到20 μM濃度。將6×104的CD44、CD133/1+接種到12孔板中，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞生長密度達(dá)到60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分為對照組(轉(zhuǎn)染control載體)、實驗組(轉(zhuǎn)染miR-425慢病毒載體)，空白組以納米脂質(zhì)體代替。

1.4 細(xì)胞活力測定

轉(zhuǎn)染后的HCT116細(xì)胞生長至70%～80%時消化細(xì)胞，接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按20 μL/孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸去上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min后490 nm測定吸光度值，測定細(xì)胞活力，實驗重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞增殖能力測定

將轉(zhuǎn)染后的HCT116細(xì)胞以700個/孔接種于直徑3.5 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每2～4 d換液1次。培養(yǎng)10 d后終止培養(yǎng)。PBS清洗1次后加入4%的多聚甲醛固定15 min，然后棄去固定液，加適量0.1%的結(jié)晶紫染色10 min，肉眼進(jìn)行計數(shù)。

1.6 PDL-1表達(dá)檢測

轉(zhuǎn)染后的HCT116細(xì)胞生長密度在90%左右時，收獲細(xì)胞，裂解液分離總蛋白，采用Western blot法檢測PDL-1蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 CD133/1+細(xì)胞檢測

流式細(xì)胞儀可檢測HCT116細(xì)胞CD133/1+細(xì)胞的存在，比例占0.3%。分選的CD 133/1+細(xì)胞呈圓形，12 h后開始貼壁生長，狀態(tài)良好。

2.2 miR-425表達(dá)水平對比

轉(zhuǎn)染后進(jìn)行qRT-PCR檢測，實驗組的miR-425 的相對表達(dá)水平為(182.44±22.19)，對照組與空白組分別為(1.84±1.11)和(1.67±0.98)，實驗組明顯高于對照組與空白組(F=78.104，P<0.05)。

2.3 生長能力對比

MTT檢測結(jié)果表明，與空白組(0.78±0.22)及對照組(0.81±0.17)比較，實驗組(0.24±0.15)的HCT116細(xì)胞生長能力明顯減弱(P<0.05)。

2.4 增殖能力對比

結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，空白組與對照組的細(xì)胞增殖率分別為(0.48±0.14)與(0.51±0.18)，都明顯高于實驗組的(0.30±0.11)。見圖1。

圖1 CD133/1+細(xì)胞增殖能力的結(jié)晶紫染色檢測(×200)

2.5 PDL-1表達(dá)水平檢測

Western blot檢測分析顯示實驗組、對照組、空白組的PDL-1相對表達(dá)量分別為(0.33±0.13)、(0.76±0.21)和(0.82±0.15)，實驗組明顯低于對照組與空白組(P<0.05)。

3 討論

當(dāng)前由于各種因素的影響，我國結(jié)直腸癌患者越來越多，對其的研究也逐漸深入。干細(xì)胞是器官發(fā)生過程中早期分子活動的研究工具，已成為近年來醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點[11]。CD44、CD133分子是結(jié)直腸癌干細(xì)胞的重要標(biāo)記分子，CD44、CD133分子的表達(dá)是判斷結(jié)直腸癌患者生存期的獨立因素[12]。有研究表明，分離純化的CD133+細(xì)胞移植小鼠后，能在小鼠體內(nèi)有效形成新的腫瘤，而CD133-細(xì)胞則不能在小鼠體內(nèi)形成新的腫瘤[13]。CD44、CD133分子的表達(dá)有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，也存在具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制[14]。

miRNA 作為一個廣泛存在的可對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的分子，長度大約為22 bp，在維持干細(xì)胞特性方面發(fā)揮了重要作用[15]。miRNAs是保持造血干細(xì)胞內(nèi)干細(xì)胞數(shù)目和特征不變的關(guān)鍵分子之一，miR-200c在乳腺干細(xì)胞的表達(dá)下調(diào)，恢復(fù)miR-200c 的表達(dá)，可明顯抑制乳腺干細(xì)胞的增殖能力。miR-21 在 CD133/1+細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào)，其可能通過調(diào)節(jié)某些致癌基因而發(fā)揮腫瘤生成的作用[16]。

在本研究中，為了解 miR-21對 CD133/1+卵巢癌干細(xì)胞增殖生物學(xué)功能的影響，我們利用脂質(zhì)體 2000 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，將化學(xué)合成的 miR-21 寡核苷酸轉(zhuǎn)染 CD133/1+卵巢癌干細(xì)胞，同時設(shè)立空白組及轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的陰性對照組，分別檢測 miR-21 寡核苷酸誘導(dǎo)的增殖情況。本研究實驗選取HCT116細(xì)胞作為研究對象，通過CD44、CD133耦連選擇干細(xì)胞，通過慢病毒納米脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染表達(dá)miR-425，qRT-PCR驗證了HCT116細(xì)胞在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-425后，miR-425表達(dá)升高。同時HCT116細(xì)胞的生長速度下降、增殖能力下降，表明miR-425能抑制HCT116細(xì)胞的生長與增殖。

實驗證實miRNA對靶基因表達(dá)調(diào)控的異常，導(dǎo)致和(或)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，CD44、CD133表達(dá)不僅僅局限于結(jié)腸或結(jié)腸癌干細(xì)胞表面，并且在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌組織中，CD44、CD133細(xì)胞都具有腫瘤干細(xì)胞特性[17-19]。PD1(programmed death-1)最初是在凋亡的T細(xì)胞雜交瘤中得到的，PD-1有2個配體，分別是PDL-1(B7-H1)和PDL-2(B7-DC)。PDL-1蛋白廣泛表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞(APCs)、活化T、B細(xì)胞、胎盤滋養(yǎng)層、心肌內(nèi)皮、巨噬細(xì)胞，在免疫應(yīng)答的負(fù)性調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用[20]。在腫瘤細(xì)胞中，PDL-1蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)狀況，有利于腫瘤的發(fā)生和生長，誘導(dǎo)抗腫瘤T細(xì)胞的凋亡[21]。本研究中Western blot檢測分析顯示實驗組、對照組、空白組的PDL-1相對表達(dá)量分別為(0.33±0.13)、(0.76±0.21)和(0.82±0.15)，實驗組明顯低于對照組與空白組(P<0.05)，表明miR-425能抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞PDL-1的表達(dá)。

總之，CD44、CD133耦連miR-425裝載納米脂質(zhì)體能抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞PDL-1的表達(dá)，從而顯著抑制干細(xì)胞的生長、增殖能力。

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CD44,CD133CoupledwithmiR-425LoadedNanoLiposomeonPDL-1DownRegulatedRoleintheColorectalCancerStemCells

JIALiangyong,XUNa,WANGXingning,etal.

AffiliatedHospitalofYan'anUniversity,Yan’an,716000

ObjectiveTo investigate the PDL-1 down regulated role of CD44,CD133 coupled with miR-425 loaded nano liposome in the colorectal cancer stem cells.MethodsThe colorectal cancer cell line HCT116 were selected for CD44,CD133/1+ cells,and were given the miR-425 loaded nano liposome transfection,the cells were divided into the control group (transfected with control vector) and the experimental group (transfected with miR-425lentivirus vector),the blank group was the nano liposome,and detected the cell growth and the expression level of PDL-1.ResultsThe CD 133/1+ cells were round and grew well after 12 h.qRT-PCR test showed that the relative expression level of miR-425 in the experimental group was (182.44±22.19),while the control group and the blank group were (1.84±1.11) and (1.67±0.98) respectively,the experimental group were higher than that of the control group and the blank group (P<0.05).The results of MTT showed that compared with the blank group (0.78±0.22) and the control group (0.81±0.17),the growth rate of HCT116 cells (0.24±0.15) were significantly slower in the experimental group (P<0.05).Compared with the experimental group,the cell proliferation rate of the blank group(0.48±0.14)and the control group(0.51±0.18)were significantly higher than that of the experimental group(0.30±0.11).Western blot analysis showed that the relative expression of PDL-1 in the experimental group,the control group and the blank group was 0.33±0.13,0.76±0.21 and 0.82±0.15 respectively,the experimental group were significantly lower than the control group and the blank group (P<0.05).ConclusionCD44 and CD133 coupled with miR-425 can inhibit the expression of PDL-1 in colorectal cancer stem cells,which can significantly inhibit the growth and proliferation of stem cells.

MiR-425;Nano liposome;Colorectal cancer;Stem cell;PDL-1

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1741～1744)

716000 延安大學(xué)附屬醫(yī)院

李 慧

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.11.001

R735.3+5；R735.3+7

A

1001-5930(2017)11-1741-04

2017-05-09

2017-07-10)

(編輯：甘艷)