金納米粒子動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展

周寶青，占忠旭，黃 楠，李 凡，許恒毅

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

金納米粒子動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展

周寶青，占忠旭，黃 楠，李 凡，許恒毅*

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

動(dòng)態(tài)光散射(Dynamic light scattering，DLS)作為顆粒粒徑分析方法，具有免分離、易操作、檢測(cè)成本低、數(shù)據(jù)易處理等優(yōu)點(diǎn)；功能化的金納米粒子除具有本身粒子屬性外，還能特異性識(shí)別待檢物，明顯放大檢測(cè)物光散射信號(hào)，可通過(guò)DLS技術(shù)快速、特異、靈敏檢測(cè)目標(biāo)物。該文綜述了金納米粒子DLS技術(shù)在目標(biāo)物分析與檢測(cè)中應(yīng)用的研究進(jìn)展，并對(duì)動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)在應(yīng)用過(guò)程存在的問(wèn)題進(jìn)行了討論，旨在為其實(shí)際應(yīng)用提供一定參考。

金納米粒子；動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)；檢出限；樣本檢測(cè)；綜述

動(dòng)態(tài)光散射(Dynamic light scattering，DLS)是一種常規(guī)的分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于粒子粒徑大小及分布情況的分析[1]。自1970年起，該方法已作為一種實(shí)用的分析方法應(yīng)用于目標(biāo)物分析和檢測(cè)[2]。商業(yè)化的常規(guī)DLS檢測(cè)設(shè)備雖然具有易于操作、檢測(cè)成本低、數(shù)據(jù)處理容易等優(yōu)點(diǎn)[3],但存在檢測(cè)靈敏度低、特異性差等缺點(diǎn)，限制了其在實(shí)際樣品檢測(cè)中的應(yīng)用。納米材料(金、銀、量子點(diǎn)等)作為理想的光散射增強(qiáng)劑，經(jīng)過(guò)修飾后能顯著增強(qiáng)DLS信號(hào)[4-5],其中金納米粒子(AuNPs)因其特殊的物理化學(xué)性質(zhì)(高摩爾消光系數(shù)、表面增強(qiáng)拉曼散射等)和良好的生物相容性得到越來(lái)越多研究者的青睞[6]。通過(guò)靜電吸附、Au—S或Au—N鍵等作用，蛋白質(zhì)、核酸、無(wú)機(jī)物等可穩(wěn)定修飾在AuNPs表面構(gòu)建功能化金探針，將其與DLS技術(shù)結(jié)合，應(yīng)用于樣品檢測(cè)，具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。本文綜述了基于AuNPs的DLS技術(shù)的檢測(cè)原理及其在樣品檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展，并對(duì)其存在的問(wèn)題進(jìn)行了討論，旨在為實(shí)際應(yīng)用提供參考。

圖1 動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)裝置圖Fig.1 The experimental equipment of DLS

1 動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測(cè)量顆粒直徑的原理

DLS技術(shù)又稱時(shí)間相關(guān)的光散射技術(shù)[7]，是一種實(shí)時(shí)監(jiān)控待檢物散射光強(qiáng)度變化的技術(shù)。由于待檢物溶液中的分子不停地做布朗運(yùn)動(dòng)，其粒子散射光的相位發(fā)生變動(dòng)，導(dǎo)致散射光強(qiáng)度在時(shí)間上表現(xiàn)為在平均光強(qiáng)附近的隨機(jī)波動(dòng)。研究表明，粒子散射光強(qiáng)度的漲幅頻率與其粒徑相關(guān)，粒徑越大，漲落越慢[8]。因此，通過(guò)測(cè)量散射光強(qiáng)度的漲落變化或頻移情況，可同時(shí)獲得顆粒粒徑的相關(guān)動(dòng)態(tài)參數(shù)，進(jìn)而計(jì)算出粒子的粒徑，其測(cè)量范圍為1 nm～5 μm[8]。圖1為動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)裝置圖，其基本流程為：在固定散射角下，聚焦后的激光照射樣品池中的顆粒，顆粒發(fā)出的散射光通過(guò)光探測(cè)器輸出相應(yīng)光信號(hào)，經(jīng)過(guò)放大/甄別器和相關(guān)器處理，得到顆粒光強(qiáng)自相關(guān)函數(shù)，最后經(jīng)計(jì)算機(jī)處理即可獲得顆粒水化粒徑及其分布情況。

2 金納米粒子動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)在目標(biāo)物分析與檢測(cè)中的應(yīng)用

AuNPs-DLS技術(shù)是利用功能化AuNPs探針特異性捕獲目標(biāo)物，AuNPs發(fā)生聚集導(dǎo)致其粒徑變化，采用DLS技術(shù)實(shí)時(shí)、靈敏、分析其變化情況，從而定量檢測(cè)目標(biāo)物[11]。

根據(jù)AuNPs探針聚合方式的不同，基于AuNPs-DLS技術(shù)建立的常見(jiàn)檢測(cè)方法主要可分為直接聚合法與間接聚合法兩類。直接聚合法是利用功能化修飾AuNPs探針特異性識(shí)別目標(biāo)物聚集，結(jié)合DLS進(jìn)行分析的檢測(cè)方法，主要利用的聚合方式包括抗原抗體反應(yīng)、堿基互補(bǔ)配對(duì)、核酸適配子特異性識(shí)別等。該類方法檢測(cè)時(shí)間短、特異性好、靈敏度高，廣泛用于蛋白質(zhì)[12]、核酸[13]和食源性致病菌[14]的檢測(cè)。間接聚合法是指通過(guò)目標(biāo)物所帶電荷破壞AuNPs之間的靜電平衡導(dǎo)致AuNPs聚集，結(jié)合DLS進(jìn)行間接分析的方法，其主要利用的聚合方式為靜電相互作用。相比直接聚合法，該類方法檢測(cè)時(shí)間更短、成本更低，主要用于環(huán)境中重金屬離子的檢測(cè)[15]，但其檢測(cè)靈敏度較低、特異性較差。圖2歸納了近年來(lái)功能化金納米粒子不同聚合方式結(jié)合DLS技術(shù)在目標(biāo)物檢測(cè)中應(yīng)用的原理，表1總結(jié)了AuNPs-DLS技術(shù)在樣品檢測(cè)中的應(yīng)用。

圖2 功能化金納米粒子的聚合方式Fig.2 The aggregation methods of functionalized AuNPsA.antigen-antibody reaction(基于抗原-抗體反應(yīng))；B.complementary base pairing(基于堿基互補(bǔ)配對(duì));C.aptamer specific recognition(基于核酸適配子特異性識(shí)別);D.electrostatic interaction(基于靜電相互作用)

表1 AuNPs-DLS技術(shù)在不同樣本檢測(cè)中的應(yīng)用Table 1 The application of AuNPs-DLS technology for the detection of different samples

(續(xù)表1)

MethodApplicationCombinationAdvantageDisadvantageTargetLimitofdetectionReferenceDNA修飾的AuNPs-DLS技術(shù)堿基互補(bǔ)配對(duì)特異性、重復(fù)性好，靈敏度高等DNA修飾不穩(wěn)定、目標(biāo)物結(jié)合不可控單鏈DNA0 1pmol/L[18]雙鏈DNA593fmol/L[19]核酸適配子功能化AuNPs-DLS技術(shù)核酸適配子特異性識(shí)別與目標(biāo)物結(jié)合效率高、特異性好、受環(huán)境影響小特異性核酸適配子篩選復(fù)雜、探針合成不穩(wěn)定腺苷7nmol/L[20]三聚氰胺2 0mg/mL[21]間接聚合法基于靜電相互作用AuNPs-DLS技術(shù)靜電相互作用操作簡(jiǎn)單、無(wú)需修飾、檢測(cè)靈敏度高特異性較差、受環(huán)境影響因素較大Hg2+0 43nmol/L[22]Pb2+6 2pmol/L[23]

2.1 直接聚合

2.1.1基于抗原-抗體反應(yīng)作為一種高效、特異的生物學(xué)捕獲方式，抗原抗體反應(yīng)廣泛應(yīng)用于生物傳感器檢測(cè)方法中。通常，功能化探針通過(guò)抗原抗體反應(yīng)特異性識(shí)別目標(biāo)物并發(fā)生聚集，利用DLS技術(shù)可定量檢測(cè)[24]?；诳乖贵w反應(yīng)聚合方式的AuNPs-DLS檢測(cè)方法因高效、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用在臨床診斷、疾病預(yù)防、食源性致病菌檢測(cè)等方面。Liu等[16]首先合成了抗體包被的不同形狀A(yù)uNPs探針，構(gòu)建一步均相雙抗夾心模式特異捕獲前列腺特異抗原，結(jié)合DLS技術(shù)實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，該方法無(wú)需分離、樣品用量少，檢出限為0.5 ng/mL。為了進(jìn)一步提高前列腺特異抗原的檢測(cè)靈敏度，Li等[17]通過(guò)逐步偶聯(lián)法分別將聚乙二醇、二氧化錳及抗前列腺結(jié)合抗體修飾到AuNPs表面，形成“Ab2-MnO2-pGNPs”聚合物探針，與目標(biāo)抗原特異性結(jié)合后固定在96孔板中，利用DLS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，其檢出限為1 fmol/L，相比之前的檢測(cè)方法，其靈敏度提高了4個(gè)數(shù)量級(jí)。Huang等[14]首次建立了基于免疫磁富集和多抗修飾AuNPs探針的DLS技術(shù)定量檢測(cè)食源性致病菌的方法。該方法檢測(cè)時(shí)間短，能特異性捕獲生菜中的單增李斯特菌，回收率為74.4%～123.4%，在實(shí)際加標(biāo)樣品中的檢出限為22 CFU/g。

2.1.2基于堿基互補(bǔ)配對(duì)DNA是一類帶有遺傳信息的生物大分子，DNA之間嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行組裝形成功能化結(jié)構(gòu)。在核酸檢測(cè)過(guò)程中，基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則設(shè)計(jì)的核酸修飾的AuNPs探針，能特異識(shí)別1個(gè)堿基錯(cuò)配，利用DLS技術(shù)分析AuNPs探針聚集后粒徑的微小變化，可達(dá)到快速、靈敏、特異的檢測(cè)目的。Du等[18]合成了多種單鏈DNA(Single-stranded DNA，ssDNA)修飾的金探針，當(dāng)目標(biāo)DNA存在時(shí)，功能化金探針特異捕獲目標(biāo)DNA發(fā)生聚集，結(jié)合DLS技術(shù)分析，可實(shí)現(xiàn)一步均相檢測(cè)靶DNA的目的，其檢測(cè)時(shí)間短(10 min)，最低檢出限為0.1 pmol/L。Dai等[25]首次利用大粒徑AuNPs探針結(jié)合DLS技術(shù)檢測(cè)靶DNA，最低檢出限達(dá)1 pmol/L，相比傳統(tǒng)的比色法靈敏度提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)。有研究報(bào)道，基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，ssDNA除了能形成雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)以外，一些特殊堿基序列構(gòu)成的DNA單鏈還能形成類似于“麻花狀”的三螺旋結(jié)構(gòu)[26-27]。基于三螺旋結(jié)構(gòu)DNA的金探針聚合反應(yīng)是以Double-stranded DNA(dsDNA)為骨架所形成，相比ssDNA，其dsDNA具有制備簡(jiǎn)單、保存過(guò)程中不易降解等優(yōu)點(diǎn)?；谶@種特殊的三螺旋堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，Miao等[19]利用只含“G-A”堿基組合的特殊ssDNA合成具有兩種不同ssDNA修飾的AuNPs探針，當(dāng)靶DNA存在時(shí)，通過(guò)這種特殊堿基結(jié)合方式捕獲靶DNA形成聚合物，利用DLS技術(shù)定量檢測(cè)dsDNA分子。該檢測(cè)方法可特異性識(shí)別1個(gè)堿基錯(cuò)配，其靈敏度高，檢出限為593 fmol/L。

2.1.3基于核酸適配子特異性識(shí)別核酸適配子是一類通過(guò)體外篩選技術(shù)(SELEX)經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選得到的一段與靶物質(zhì)有高親和力與特異性的寡核苷酸，不僅擁有類似單克隆抗體功能，而且具有成本低、熱穩(wěn)定性好、環(huán)境耐受能力強(qiáng)等特點(diǎn)[28]。近年來(lái)，基于核酸適配子特異識(shí)別的AuNPs探針結(jié)合DLS檢測(cè)技術(shù)因操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，主要用于疾病診斷、食品安全檢測(cè)[29]等領(lǐng)域。Yang等[20]首先合成“劈開(kāi)型”腺苷核酸適配子包被的AuNPs探針，功能化的AuNPs探針特異性捕獲腺苷受體形成腺苷-適配子聚合物，通過(guò)DLS技術(shù)分析聚合物的粒徑變化，定量檢測(cè)腺苷的濃度，檢出限為7 nmol/L，相比傳統(tǒng)的比色法，提高了5個(gè)數(shù)量級(jí)；與抗體功能化探針相比，該探針合成成本低、環(huán)境耐受能力強(qiáng)。Wu等[21]合成了含特定堿基序列的ssDNA功能化AuNPs探針，通過(guò)氫鍵的結(jié)合作用，該ssDNA上特定的胸腺嘧啶六聯(lián)體結(jié)構(gòu)與三聚氰胺單體分子特異性結(jié)合形成多聚體，利用DLS技術(shù)分析多聚物粒徑變化，從而快速、靈敏檢測(cè)三聚氰胺。該方法檢測(cè)三聚氰胺耐受環(huán)境(溫度、pH值、食品基質(zhì))的干擾，檢出限最低可達(dá)2.0 mg/mL。

2.2 間接聚合

靜電相互作用是維持膠體體系穩(wěn)定的主要作用，主要包括靜電引力和靜電斥力。均相膠體溶液中，粒子之間因表面所帶同性電荷相互排斥而保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。實(shí)際應(yīng)用中，未修飾的AuNPs探針處于高濃度鹽(NaCl)緩沖溶液中，其表面的電層被破壞，粒子之間的靜電斥力變?nèi)?，AuNPs探針之間發(fā)生聚合，而一些待檢目標(biāo)物具有穩(wěn)定AuNPs的作用，如ssDNA在伸展?fàn)顟B(tài)下通過(guò)Au—N鍵包被在AuNPs表面，使其保持良好的分散性[30]?；陟o電相互作用的AuNPs探針結(jié)合DLS技術(shù)因操作簡(jiǎn)單、無(wú)需修飾、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于重金屬離子的檢測(cè)。Xiong等[22]成功構(gòu)建了基于AuNPs探針DLS技術(shù)靈敏檢測(cè)Hg2+的生物傳感器。未經(jīng)修飾的AuNPs直接加入反應(yīng)體系，當(dāng)不存在Hg2+時(shí)，AuNPs由于ssDNA的保護(hù)作用保持穩(wěn)定狀態(tài)[5]；而Hg2+存在時(shí)，Hg2+與ssDNA發(fā)生特異性結(jié)合，其ssDNA構(gòu)象發(fā)生變化形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)、二聚體等，此時(shí)AuNPs探針裸露在高鹽溶液中發(fā)生明顯聚合，結(jié)合DLS技術(shù)分析聚合物的粒徑變化可定量檢測(cè)Hg2+。該方法無(wú)需合成功能化AuNPs探針，其最低檢出限為0.43 nmol/L。Miao等[23]利用Pb2+特異識(shí)別dsDNA發(fā)生聚合,同樣構(gòu)建了基于靜電相互作用AuNPs探針結(jié)合DLS技術(shù)一步檢測(cè)Pb2+的方法，該方法特異性好，能很好地應(yīng)用于實(shí)際水樣中Pb2+含量的檢測(cè)，最低檢出限達(dá)6.2 pmol/L，回收率為95.12%～104.76%。與傳統(tǒng)比色法相比[31]，該方法檢測(cè)靈敏度更高；相比電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)等定量分析方法[32-33]的檢測(cè)成本更低，操作更快速便捷。

3 總結(jié)與展望

AuNPs結(jié)合DLS技術(shù)的檢測(cè)方法具有操作便捷、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在臨床診斷、疾病預(yù)防、食源性致病菌檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。通過(guò)比較不同聚合方式AuNPs結(jié)合DLS技術(shù)在樣本檢測(cè)中的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，該方法在實(shí)際應(yīng)用中尚存在一些問(wèn)題，需要不斷研究和改進(jìn)：①盡管AuNPs結(jié)合DLS技術(shù)能靈敏檢測(cè)目標(biāo)物，但反應(yīng)體系中復(fù)雜基質(zhì)的存在易造成假陽(yáng)性結(jié)果，因此可結(jié)合一些富集手段(如免疫磁富集技術(shù))去除體系中的雜質(zhì)干擾，從而更加精確地檢測(cè)目標(biāo)物[34]；②目前報(bào)道的AuNPs結(jié)合DLS技術(shù)用于樣本的檢測(cè)均通過(guò)功能化金探針直接或間接捕獲待檢物，其檢測(cè)靈敏度受到一定的限制，可結(jié)合雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)、構(gòu)建人工模擬酶等信號(hào)放大方式進(jìn)一步提高靈敏度；③目前，AuNPs結(jié)合DLS的生物傳感器方法主要利用AuNPs作為捕獲探針載體，形式較為單一，有文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)合多種納米材料或金屬材料的檢測(cè)方法，其檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度能明顯增大[8]。因此，在今后的研究中，可以嘗試結(jié)合多種納米材料如磁珠、量子點(diǎn)[35]、銀納米粒子等用于樣品檢測(cè)的研究，從而實(shí)現(xiàn)超靈敏檢測(cè)。隨著檢測(cè)技術(shù)向快速簡(jiǎn)便、高靈敏度方向發(fā)展，基于AuNPs-DLS技術(shù)的生物傳感器方法必將得到更廣泛的關(guān)注與應(yīng)用。

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[35] Liu K L,Dong Y M,Su J X,Wang G L.J.Instrum.Anal.(劉康麗,董玉明,束軍仙,王光麗.分析測(cè)試學(xué)報(bào)),2014,33(8):899-904.

Research Progresses on Application of Dynamic Light Scattering with Gold Nanoparticles

ZHOU Bao-qing,ZHAN Zhong-xu,HUANG Nan,LI Fan,XU Heng-yi*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Dynamic light scattering(DLS),as a conventional analysis method by particle size,has the advantages of free separation,easy operation,low test costs and easy data processing etc.Functionalized AuNPs,in addition to thier own particle properties,could also specifically identify the target,significantly amplify the light scattering signals from the target,and ultimately achieve a fast,specific and sensitive detection on the target through the DLS technique.In this paper,research progresses on the application of DLS with gold nanoparticles in detection on the target were reviewed.Some problems in the application process of DLS technique were discussed,which was intended to provide some reference for its practical application.

AuNPs;dynamic light scattering;limit of detection;sample detection；review

2017-05-15；

2017-06-20

江西省青年科學(xué)家(井岡之星)培養(yǎng)對(duì)象項(xiàng)目(2014BCB23004)

*

許恒毅，博士，副研究員，研究方向:食品生物技術(shù)，Tel:0791-88304447-222-9520，E-mail:kidyxu@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.12.020

O433.4；G353.11

A

1004-4957(2017)12-1536-05