減數(shù)分裂期雄性大菱鲆孕激素及受體基因的表達(dá)分析

豐程程, 柳意樊, 安 皓, 徐世宏, 王彥豐, 宋宗誠(chéng), 劉清華, 李 軍

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減數(shù)分裂期雄性大菱鲆孕激素及受體基因的表達(dá)分析

豐程程1, 2, 3, 柳意樊1, 3, 安 皓1, 2, 3, 徐世宏1, 3, 王彥豐1, 3, 宋宗誠(chéng)4, 劉清華1, 3, 李 軍1, 3

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237; 4. 山東威海圣航水產(chǎn)科技有限公司, 山東 威海 264200)

為研究孕激素在大菱鲆()精原細(xì)胞增殖到減數(shù)分裂過程中的作用, 以6~22月齡的大菱鲆精巢為材料, 通過組織學(xué)方法和定量、基因確定精原細(xì)胞增殖期和減數(shù)分裂期的大菱鲆精巢發(fā)育過程。通過酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)檢測(cè)6~22月齡雄性大菱鲆血清中的孕酮(P4)和17α, 20β, 雙羥孕酮(DHP)含量變化, 利用qRT-PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)檢測(cè)孕酮核受體()和膜受體()在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。結(jié)果表明孕激素在精原細(xì)胞增殖期高表達(dá), 開始出現(xiàn)初級(jí)精母細(xì)胞時(shí)降低, 在精子細(xì)胞數(shù)量增加時(shí)表達(dá)量再次升高, 在精子細(xì)胞變態(tài)形成精子時(shí)降低。在減數(shù)分裂初期定位于精巢中的sertoli細(xì)胞, 在精原細(xì)胞增殖至減數(shù)分裂期表達(dá)量逐漸增加, 出現(xiàn)精子后顯著降低;在精原細(xì)胞增殖和初級(jí)精母細(xì)胞增加時(shí)表達(dá)量都很低, 在精子細(xì)胞不斷增加時(shí)顯著增加。推測(cè)在精原細(xì)胞增殖和減數(shù)分裂階段孕激素可能主要通過調(diào)節(jié)的表達(dá)量來促進(jìn)精巢發(fā)育, 而在減數(shù)分裂II期和都發(fā)揮作用在精子細(xì)胞變態(tài)成熟時(shí), 主要是發(fā)揮作用。

大菱鲆(); 減數(shù)分裂; 孕激素;;

低等脊椎動(dòng)物中, 雌魚生殖細(xì)胞先增殖進(jìn)入減數(shù)分裂階段, 而雄魚處于有絲分裂阻滯, 晚于雌魚再進(jìn)入減數(shù)分裂期[1]。減數(shù)分裂進(jìn)程一旦出錯(cuò), 精子發(fā)生就會(huì)停滯并最終導(dǎo)致不育。因此, 確保雄魚生殖細(xì)胞減數(shù)分裂正常進(jìn)行是魚類繁殖的必要條件。早期研究認(rèn)為, 孕激素在雄魚最后的精子成熟和排放過程中發(fā)揮重要作用[2]。但最近的研究表明, 孕激素的活性成分之一 ——17α, 20β-雙羥孕酮(DHP)在魚類減數(shù)分裂起始階段必不可少, 在日本鰻鱺()、尼羅羅非魚()和斑馬魚()中, DHP誘導(dǎo)精原細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂起始階段[3-5]。另外, 孕激素的生物活性受孕激素受體調(diào)控, 受體主要包括核受體()和膜受體()兩大類。孕激素與核受體如(progesterone receptor)結(jié)合后移動(dòng)到胞核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄, 在胞質(zhì)中還可以激活相關(guān)信號(hào)通路, 共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化[6-7]。而膜受體如(membrane progestin receptor alpha)與孕酮特異性結(jié)合, 通過激活G蛋白調(diào)控下游的腺苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷酸腺苷(AC-cAMP)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路來介導(dǎo)孕酮對(duì)精子運(yùn)動(dòng)的激活[8]。

大菱鲆() 為原產(chǎn)于歐洲沿海的冷水性鲆科魚類, 自1992年引進(jìn)中國(guó)后, 成為重要海水養(yǎng)殖良種之一, 其工廠化養(yǎng)殖取得重大經(jīng)濟(jì)效益, 是中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)一個(gè)新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)[9]。然而大菱鲆生長(zhǎng)期長(zhǎng), 精巢發(fā)育緩慢, 排精量低已經(jīng)成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。如何促進(jìn)精巢中精原細(xì)胞快速增殖并進(jìn)入減數(shù)分裂是確保精子發(fā)生正常進(jìn)行, 提高產(chǎn)精量的必要條件。本實(shí)驗(yàn)以6~22月齡的雄性大菱鲆為研究對(duì)象, 觀察大菱鲆精巢從精原細(xì)胞增殖到減數(shù)分裂的發(fā)育過程。檢測(cè)大菱鲆血清中的孕酮(P4)和DHP含量變化以及不同時(shí)期的精巢中和的時(shí)空表達(dá)模式。由此推測(cè)孕激素及其受體在精原細(xì)胞增殖到減數(shù)分裂階段發(fā)揮的作用, 為進(jìn)一步闡明孕激素及相應(yīng)受體的相關(guān)生理功能提供理論依據(jù), 同時(shí)也為深入了解孕激素在魚類生殖周期調(diào)控中的生物學(xué)功能提供重要參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料取自山東省威海市圣航水產(chǎn)科技有限公司和山東省煙臺(tái)市東方海洋科技股份有限公司, 養(yǎng)殖水溫17℃。取月齡分別為6月齡(體質(zhì)量17.2 g± 5.5 g)、10月齡(體質(zhì)量54.2 g±10.7 g)、12月齡(體質(zhì)量119.5 g±19.7 g)、14月齡(體質(zhì)量232.2 g±30.2 g)、16月齡(體質(zhì)量416.7 g±54.3 g)、20月齡(體質(zhì)量818 g± 69.3 g)、22月齡(體質(zhì)量972.5 g±53.3 g)的成魚, 每個(gè)時(shí)期取5~20尾。將魚麻醉后, 測(cè)量全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、體質(zhì)量和性腺質(zhì)量。尾部靜脈抽取血液, 4 000 r/min離心10 min取上清用于激素測(cè)定。取組織樣品(心、腦、垂體、肝、腸、胃、腎、脾、肌、鰓、精巢和卵巢)投入液氮, –80℃保存, 用于后續(xù)RNA提取。精巢樣品取一半分別固定于波恩氏液和4%多聚甲醛(PFA)中, 用于組織學(xué)觀察和原位雜交。

1.2 血清激素水平測(cè)定

所取的不同月齡的雄魚血清通過ELISA方法測(cè)定血清中P4和DHP的含量(pg/mL)。所用試劑盒為美國(guó)TSZ公司的Fish Progesterone(P)ELISA Kit和Fish 17α, 20βOH-PROG ELISA Kit。

1.3 組織學(xué)觀察

精巢在波恩氏液中固定22 h, 然后轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存。固定的樣品梯度酒精脫水, 二甲苯透明, 常規(guī)石蠟包埋, 做連續(xù)切片, 厚度為3μm, 蘇木精-伊紅染色(HE), 顯微鏡觀察(Nikon E200), 并拍照記錄。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

通過熒光定量PCR研究和在大菱鲆成體各組織及不同月齡性腺中的表達(dá)模式。選用上海飛捷總RNA抽提試劑盒提取總RNA, 根據(jù)Nanodrop 2000 測(cè)定的RNA濃度, 按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。以合成的cDNA為模板,(ubiquitin)和(radial spoke protein 4)為內(nèi)參, 擴(kuò)增參數(shù)如下: 95℃30 s; 95℃10 s, 55℃30 s循環(huán)40圈。熒光定量引物見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用引物及序列

1.5 切片原位雜交

用梯度乙醇脫水4%PFA固定的精巢樣品, 透蠟處理, 石蠟包埋切片, 切片厚度為3 μm。切片脫蠟復(fù)水, 4%PFA15 min固定, PBST洗滌3次, 每次5 min, 蛋白酶K(10 μg/mL)37oC消化15 min, 再用PBST洗滌3次, 每次5 min。65℃預(yù)雜交2 h, 終質(zhì)量濃度為1 ng/μL的探針80℃變性 10 min后滴加在切片上, 200 μL/片, 封口膜覆蓋, 65℃孵育過夜。第二天洗滌, 室溫2% blocking buffer 封閉2 h, 熒光抗體孵育過夜。第三天再洗滌, 封閉, 地高辛抗體孵育過夜。第四天洗滌, 用NTMT稀釋NBT/BCIP后避光顯色, 待樣品達(dá)到理想色度后, 用PBST洗滌3次, 每次5 min, 終止顯色, 50%甘油封片, 拍照觀察。原位探針引物見表1, 根據(jù)設(shè)計(jì)的引物從精巢cDNA中擴(kuò)增/目的條帶, 膠回收連接到PGEM-T easy 載體, 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài), 挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。選取含正確插入方向的單克隆, 提取質(zhì)粒, 酶切純化, 用T7和SP6RNA轉(zhuǎn)錄酶分別合成/a反義和正義探針。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

激素和基因的表達(dá)變化以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示, 每組數(shù)據(jù)包括3個(gè)平行樣品。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用spss17.0進(jìn)行單因素方差分析LSD法, 檢驗(yàn)水平均為<0.05。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察

通過組織學(xué)切片觀察大菱鲆6月齡~22月齡的精巢發(fā)育過程。在6月齡~10月齡階段, 大菱鲆精巢中的生殖細(xì)胞全部為精原細(xì)胞(圖1a, 1b)。從12月齡開始, 隨魚體生長(zhǎng), 精巢中逐漸觀察到初級(jí)精母細(xì)胞(圖 1c), 之后初級(jí)精母細(xì)胞占總生殖細(xì)胞的比例逐漸增加。在16月齡的精巢中觀察到大量的初級(jí)精母細(xì)胞和少量精子細(xì)胞(圖1e), 之后精子細(xì)胞的數(shù)量不斷增加(圖 1f), 在22月齡時(shí), 出現(xiàn)少量精子混雜在精子細(xì)胞中(圖1g)。

圖1 大菱鲆6~22月齡精巢發(fā)育形態(tài)特征

a. 6月齡, 精原細(xì)胞; b. 10月齡, 精原細(xì)胞; c. 12月齡, 主要類型為精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞; d. 14月齡, 主要類型為精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞; e. 16月齡, 主要類型為初級(jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞; f. 20月齡, 主要類型為初級(jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞; g. 22月齡, 主要類型為初級(jí)精母細(xì)胞, 精子細(xì)胞和精子; SG. 精原細(xì)胞; PS. 初級(jí)精母細(xì)胞; ST. 精子細(xì)胞; SP. 精子

a. 6 mah, spermatogonia; b. 10 mah, spermatogonia; c. 12 mah, the major types include spermatogonia and primary spermatocytes; d.14 mah, the major types include spermatogonia and primary spermatocytes; e. 16 mah, the major types include primary spermatocytes and spermatids; f. 20 mah, the major types include primary spermatocytes and spermatids; g. 22 mah, the major types include primary spermatocytes, spermatids and sperm; SG. Spermatogonia; PS. primary spermatocytes; ST. spermatids; SP. sperm

2.2 激素含量變化

P4和DHP在6月齡時(shí)高表達(dá), 之后在12~14月齡初級(jí)精母細(xì)胞增加時(shí)表達(dá)量逐漸降低, 在14月齡時(shí)表達(dá)量最低, 之后在出現(xiàn)大量精子細(xì)胞的16~20月齡階段表達(dá)量顯著升高, 隨精子細(xì)胞變態(tài)形成精子P4和DHP的表達(dá)量再次顯著降低(圖2)。

圖2 6~22月齡雄性大菱鲆血清中P4和DHP的含量

a. P4; b. DHP; 每組數(shù)據(jù)為3個(gè)平行樣的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差; 標(biāo)注的不同字母表明具有顯著性的差異(< 0.05)

a. progesterone (P4); b. 17α, 20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one(DHP); the concentrations of steroids levels are represented as means ± SEM of three independent samples; Different letters above histograms indicate significant difference (< 0.05)

2.3 組織表達(dá)模式分析

對(duì)和在10月齡大菱鲆不同組織中的表達(dá)結(jié)果分析顯示,在垂體和精巢中表達(dá)量顯著高于其他組織, 其次是卵巢, 在其他組織中的表達(dá)量都非常低(圖3a)。在腦中表達(dá)量顯著高于其他組織。其次是垂體和眼, 在其他組織中的表達(dá)量都非常低(圖3b)。

2.4 pgr, mPRα, sycp3, amh在不同時(shí)期性腺中的表達(dá)

在6月齡精原細(xì)胞增殖期就已經(jīng)表達(dá), 之后持續(xù)顯著上升, 在20月齡精巢中主要細(xì)胞類型為精子細(xì)胞時(shí)表達(dá)量最高, 在22月齡出現(xiàn)少量精子時(shí)期顯著降低(圖4a)。在6~14月齡階段主要細(xì)胞類型為精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞時(shí)表達(dá)量較低, 在16月齡出現(xiàn)大量初級(jí)精母細(xì)胞和少量精子細(xì)胞時(shí)顯著升高, 16~22月齡階段略有降低, 但仍顯著高于6~14月齡階段(圖4b)。在6月齡就已經(jīng)開始表達(dá), 之后持續(xù)升高, 在16月齡出現(xiàn)大量初級(jí)精母細(xì)胞和少量精子細(xì)胞時(shí)表達(dá)量顯著升高, 隨精子細(xì)胞數(shù)量增加,相對(duì)表達(dá)量略有下降, 在22月齡出現(xiàn)少量精子時(shí)期時(shí)表達(dá)量最高(圖4c)。的表達(dá)量從6月齡開始持續(xù)升高, 在14月齡出現(xiàn)少量初級(jí)精母細(xì)胞時(shí)達(dá)到最高峰, 顯著高于其他時(shí)期。之后隨精子細(xì)胞數(shù)量的不斷增加,的表達(dá)量顯著下降, 在之后的16~22月齡階段持續(xù)低表達(dá)(圖4d)。

圖3 Real-Time PCR檢測(cè)在10月齡大菱鲆不同組織中pgr和mPRαmRNA的表達(dá)

B. 腦; P. 垂體; G. 鰓; H. 心臟; L. 肝臟; S. 脾; K. 腎; ST. 胃; I. 腸; T. 精巢; O. 卵巢; E. 眼; M. 肌肉; SK. 皮膚。實(shí)驗(yàn)使用10月齡雄魚為材料, 設(shè)3次重復(fù)。數(shù)值代表mRNA的相對(duì)表達(dá)量。3次重復(fù)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差展示。通過單因素方差分析, 不同字母表明具有顯著性差異(<0.05)

B. brain; P. pituitary; G. gill: H. heart; L. liver; S. spleen; K. kidney; ST. stomach; I. intestines; T. testis; O. ovary; E. eye; M. muscle; SK. skin; Relative mRNA level represents the mean ± SEM of three independent samples. Different letters indicate significant difference ofand mPRα mRNA levels (< 0.05)

圖4 Real-Time PCR檢測(cè)pgr, mPRα, sycp3和amh在6~22月齡性腺中的表達(dá)水平

相對(duì)表達(dá)量為3個(gè)平行樣的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。圖上標(biāo)注的不同字母表明具有顯著性的差異(<0.05)

Relative mRNA levels are represented as mean ± SEM of multiple independent samples. Different letters indicate significant difference of,,andmRNA levels (< 0.05)

2.5 pgr, mPRα在減數(shù)分裂期大菱鲆精巢上的定位

通過原位雜交技術(shù)定位和在16月齡的精巢中的分布, 在精巢邊緣位置在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)(圖5b),沒有檢測(cè)到信號(hào)(圖5c)。該位置的精巢中主要細(xì)胞類型為精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞(圖5a)。圖5d和5e分別為和的對(duì)照組。

圖5 pgr和mPRα在16月齡大菱鲆精巢中的定位

SG. 精原細(xì)胞; PS. 初級(jí)精母細(xì)胞; Ser. 間質(zhì)細(xì)胞

SG. Spermatogonia; PS. primary spermatocytes; Ser. sertoli cells

3 討論

低等脊椎動(dòng)物中, 雌魚生殖細(xì)胞先增殖進(jìn)入減數(shù)分裂階段, 而雄魚處于有絲分裂阻滯[1], 如尼羅羅非魚雌魚孵化后35 d進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅰ期, 而雄魚在孵化后85 d進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅰ期; 雌性黑鯛魚孵化后120 d進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅰ期, 而雄魚在孵化后150 d出現(xiàn)少量進(jìn)入減數(shù)分裂階段的生殖細(xì)胞。減數(shù)分裂Ⅰ期是一個(gè)相當(dāng)特殊的過程, 包括同源染色體的配對(duì)、聯(lián)會(huì)和同源染色體重組。之后初級(jí)精母細(xì)胞分裂為兩個(gè)子細(xì)胞, 重新生成的細(xì)胞緊接著發(fā)生第二次分裂。

減數(shù)分裂進(jìn)程一旦出錯(cuò), 精子發(fā)生就會(huì)停滯并最終導(dǎo)致不育。通過組織切片觀察表明大菱鲆在6~10月齡階段為精原細(xì)胞增殖期, 大菱鲆精巢中的生殖細(xì)胞類型只有精原細(xì)胞, 精原細(xì)胞不斷增殖, 之后在12~14月齡階段逐漸出現(xiàn)初級(jí)精母細(xì)胞, 表明精巢從精原細(xì)胞增殖期開始進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅰ期。在16~20月齡階段, 初級(jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞為主要的生殖細(xì)胞類型, 精原細(xì)胞僅在精巢邊緣存在, 表明精巢開始進(jìn)入第二次減數(shù)分裂階段。在22月齡的精巢中可以觀察到精子細(xì)胞占主導(dǎo)地位, 并出現(xiàn)少量精子混雜在精子細(xì)胞中。基因編碼的蛋白主要表達(dá)在初級(jí)精母細(xì)胞中, 是第一次減數(shù)分裂偶線期同源染色體配對(duì)過程中聯(lián)會(huì)復(fù)合體的主要結(jié)構(gòu)蛋白, 因此可以作為減數(shù)分裂Ⅰ期的標(biāo)記基因。本實(shí)驗(yàn)中, 在6月齡的大菱鲆精巢中已經(jīng)開始低表達(dá), 但在組織切片中沒有觀察到精母細(xì)胞, 雖然此時(shí)精巢中的精原細(xì)胞還沒有開始減數(shù)分裂, 但是已經(jīng)開始表達(dá), 推測(cè)的表達(dá)可能開始于精原細(xì)胞增殖期。在6~14月齡期間的表達(dá)量持續(xù)增加, 表明隨月齡增加, 精巢發(fā)育, 越來越多的精原細(xì)胞發(fā)育成初級(jí)精母細(xì)胞, 這也和組織切片觀察到的吻合, 在16和22月齡時(shí)高表達(dá), 表明雖然在這兩個(gè)時(shí)期主要細(xì)胞類型分別為精子細(xì)胞和精子, 但在精巢邊緣仍有精原細(xì)胞源源不斷的發(fā)育成初級(jí)精母細(xì)胞。在6~14月齡階段持續(xù)升高, 在之后的16~22月齡階段顯著降低。由此表明,在大菱鲆精原細(xì)胞增殖期和減數(shù)分裂起始階段顯著高表達(dá), 在進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅱ期后表達(dá)量顯著降低。推測(cè)促進(jìn)精原細(xì)胞增殖并發(fā)育成初級(jí)精母細(xì)胞, 而精子細(xì)胞和精子對(duì)的表達(dá)起抑制作用。(Anti-Mullerianhormone)是一類以多肽形式存在的細(xì)胞生長(zhǎng)因子, 是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P超家族(TGF-P)的分泌型糖蛋白。哺乳動(dòng)物睪丸sertoli細(xì)胞分泌的引起繆勒氏管退化。雖然硬骨魚類并不存在繆勒氏管, 但是仍存在基因的表達(dá)。在銀漢魚()和尼羅羅非魚中認(rèn)為是雄性性別決定的必要基因[10-11]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與半滑舌鰨()上的研究結(jié)果類似, 在半滑舌鰨中,在孵化后70 d之前表達(dá)量低, 在70 d時(shí)達(dá)到最高峰, 而在8月齡生精期的表達(dá)量下降[12]。同樣, 在青鳉()和日本牙鲆()中,主要在未成熟的精巢中表達(dá), 在精子發(fā)生前停止表達(dá), 如果持續(xù)表達(dá)則會(huì)抑制精子發(fā)生過程[13-14]。在尼羅羅非魚魚中,在5~180 日齡的精巢的sertoli細(xì)胞和葉邊細(xì)胞中持續(xù)高表達(dá)。敲除銀漢魚和尼羅羅非魚中位于Y 染色體上的復(fù)制基因, 會(huì)導(dǎo)致雄性XY型胚胎個(gè)體朝卵巢方向發(fā)育[10-11]。另外,是sertoli細(xì)胞的起源基因[15], 大菱鲆的表達(dá)量在14月齡后顯著降低, 也表明在進(jìn)入減數(shù)分裂后, sertoli細(xì)胞占精巢總細(xì)胞的比例顯著降低。

早期關(guān)于孕激素對(duì)硬骨魚精子發(fā)生的研究主要集中在促進(jìn)精子成熟排精和提高精子活力方面[2], 對(duì)孕激素通過孕酮受體對(duì)精原細(xì)胞增殖至減數(shù)分裂階段的調(diào)節(jié)機(jī)制研究的較少。目前在硬骨魚中得到兩種具有生物活性的孕激素: 17α,20β-雙羥孕酮(DHP)和17α,20β-21-三羥孕酮(20β-s), 而在已報(bào)到的硬骨魚減數(shù)分裂起始階段起作用的都是DHP[16-17]。本實(shí)驗(yàn)中, P4和DHP水平在精原細(xì)胞增殖期顯著高于減數(shù)分裂Ⅰ期。這和在斑馬魚, 大西洋鮭()和大西洋鱈魚()中DHP水平在減數(shù)分裂起始階段增高的結(jié)果相似[5, 18-19]。用DHP體內(nèi)處理斑馬魚, 誘導(dǎo)早期精原細(xì)胞增殖分化成后期的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞[15]。另外DHP體外處理日本鰻鱺()精巢會(huì)刺激精原細(xì)胞DNA復(fù)制和減數(shù)分裂起始[3]。這些都說明DHP參與于早期精子發(fā)生的調(diào)節(jié)過程。因此推測(cè)在大菱鲆中P4和DHP促進(jìn)精原細(xì)胞增殖和減數(shù)分裂起始。另外在減數(shù)分裂Ⅱ期, P4和DHP的表達(dá)量再次顯著升高, 這和在鮭科()魚類的研究中相似[2, 20], 因此推測(cè)P4和DHP在大菱鲆中促進(jìn)精子細(xì)胞變態(tài)成熟。

在斑馬魚、尼羅羅非魚、大西洋鱈魚等魚中已證明DHP是的天然配體[4, 6, 19]。在斑馬魚中DHP也可以和特異結(jié)合[21]。本實(shí)驗(yàn)中,的表達(dá)量在10月齡時(shí)就開始顯著升高, 之后持續(xù)升高, 至20月齡達(dá)到最高峰后顯著下降。表明從精原細(xì)胞增殖期就開始顯著增加, 之后表達(dá)量持續(xù)升高, 直至精巢進(jìn)入精子細(xì)胞變態(tài)成熟期, 才顯著降低。推測(cè)促進(jìn)精原細(xì)胞增殖和減數(shù)分裂。之前在斑馬魚、尼羅羅非魚、日本鰻鱺中的研究結(jié)果表明,僅在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂啟動(dòng)的關(guān)鍵時(shí)期出現(xiàn)顯著上升[3-4, 6], 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果延長(zhǎng)了發(fā)揮作用的時(shí)期, 推測(cè)孕激素通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)量促進(jìn)精原細(xì)胞增殖和減數(shù)分裂兩個(gè)階段。本實(shí)驗(yàn)中大菱鲆精巢中的表達(dá)量在6~14月齡階段較低, 之后顯著升高, 表明在精原細(xì)胞增殖期和減數(shù)分裂Ⅰ期表達(dá)量低, 在減數(shù)分裂Ⅱ期細(xì)胞類型主要為精子細(xì)胞和精子時(shí),的表達(dá)量顯著升高。之前的研究主要集中在在精子上的表達(dá)和作用[22], 在減數(shù)分裂期精巢中的表達(dá)還沒有研究。本實(shí)驗(yàn)定量在大菱鲆不同時(shí)期精巢中的表達(dá)水平, 推測(cè)在精子發(fā)生早期不發(fā)揮作用, 在減數(shù)分裂Ⅱ期和精子變態(tài)成熟階段作為主要的孕酮受體發(fā)揮重要作用。

定位結(jié)果表明, 在精巢中的生殖細(xì)胞類型主要為精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞時(shí),在sertoli 細(xì)胞上表達(dá), 這和尼羅羅非魚上的結(jié)果相似[4]。而沒有明顯信號(hào), 結(jié)合熒光定量結(jié)果推測(cè)可能是由于這個(gè)階段的表達(dá)量很低, 所以沒有檢測(cè)到明顯信號(hào)。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Progestin actions and expression analysis of progestin receptors in the meiotic in male turbot ()

FENG Cheng-cheng1, 2, 3, LIU Yi-fan1, 3, AN Hao1, 2, 3, XU Shi-hong1, 3, WANG Yan-feng1, 3, SONG Zong-cheng4, LIU Qing-hua1, 3, LI Jun1, 3

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266237, China; 4.Weihai Shenghang Aquatic Science and Technology Co., LTD, Weihai 264200, China)

To explore the function of progestin during spermatogonial proliferation and meiosis, we used histological methods to investigate the gonadal development process of the male turbot () 6 to 22 months of age. We detected the expression ofandvia the real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR). Using enzyme-linked immunosorbent (ELISA) technology, qRT-PCR, and in-situ hybridization, we detected the serum P4 and DHP levels and the expression patterns of the nuclear progesterone receptor () and membrane progestin receptor alpha () during different development periods. The results reveal that the P4 and DHP levels were high during spermatogonial proliferation and meiosis Ⅱ. Theexpression was high from spermatogonial proliferation to meiosis I, whereas theexpression was high during meiosis Ⅱ and spermiogenesis. Our in-situ hybridization results indicatemRNA to be predominantly located in the Sertoli cells that were in contact with the proliferating spermatogonia and primary spermatocyte and that themRNA was undetectable. Taken together, our data indicate theexpression to be involved in mediating the progestin stimulation of spermatogonia proliferation and meiosis, whereas theplays an important role in meiosis Ⅱ and spermiogenesis.

; meiosis; progestin;;

[National Science Foundation of China, No. 31472264, 31572602; The Scientific and Technological Innovation Project Financially Supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, No.2015ASKJ02, 2015ASKJ02-03-03; Modern Agro-Industry Technology Research System, No.nycytx-50; Youth Innovation Promotion Association CAS and Chinese Academy of Science and Technology Service Network Planning, No.KFJ-EW-STS-060]; Project from the National Infrastructure of Fishery Germplasm Resource, No.2016DKA30470]

Feb. 27, 2017

Q256

A

1000-3096(2017)08-0091-08

10.11759//hykx20170227002

2017-02-27;

2017-03-29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31472264, 31572602); 鰲山科技創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目(2015ASKJ02, 2015ASKJ02-03-03)資助; 鲆鰈類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(nycytx-50); 中國(guó)科學(xué)院青促會(huì)項(xiàng)目(KFJ-EW-STS- 060); 國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)運(yùn)行項(xiàng)目(2016DKA30470)

豐程程(1989-), 女, 博士研究生, 主要從事海水魚類增養(yǎng)殖與生物技術(shù)研究, 電話: 15610052087, E-mail: fcc19891026@163.com;李軍,通信作者, E-mail: junli@qdio.ac.cn; 劉清華, 通信作者, E-mail: qinghualiu@qdio.ac.cn