長(zhǎng)鏈非編碼RNA-尿路上皮癌相關(guān)分子1在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義

劉珊珊，張國(guó)勝，潘靜

（1.濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 262500；2.山東省濰坊市益都中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 濰坊 262500）

長(zhǎng)鏈非編碼RNA-尿路上皮癌相關(guān)分子1在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義

劉珊珊1，張國(guó)勝1，潘靜2

（1.濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 262500；2.山東省濰坊市益都中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 濰坊 262500）

目的檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）-尿路上皮癌相關(guān)分子（UCA1）在宮頸癌組織中的表達(dá)，探討UCA1與宮頸癌臨床病理特征、術(shù)后生存率及預(yù)后間的關(guān)系。方法利用lncRNA芯片篩選宮頸癌及癌旁組織中差異表達(dá)的lncRNAs；利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)宮頸癌組織及配對(duì)癌旁組織中UCA1的表達(dá)；利用Spearman秩相關(guān)分析UCA1與宮頸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系；利用生存分析曲線UCA1與宮頸癌患者術(shù)后5年生存率的關(guān)系；利用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析UCA1與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果UCA1在宮頸癌表達(dá)水平高于癌旁組織；UCA1的表達(dá)與宮頸癌FIGO分期相關(guān)（P=0.015）；UCA1高表達(dá)的宮頸癌患者術(shù)后5年生存率低于低表達(dá)的患者，UCA1表達(dá)及FIGO分期為宮頸癌患者獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。結(jié)論UCA1在宮頸癌中表達(dá)升高，并與宮頸癌患者生存及預(yù)后密切相關(guān)。

尿路上皮癌相關(guān)分子；宮頸癌；預(yù)后；生存

全球每年因?qū)m頸癌而死亡的患者數(shù)高達(dá)53萬(wàn)， 死亡人數(shù)位居?jì)D科腫瘤的第2位[1]。放射治療、化學(xué)治療和根治性切除術(shù)已成為了宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案[2]。然而，宮頸癌患者術(shù)后預(yù)后差異仍非常顯著，且臨床上缺乏有效的判斷患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。因此，更深入的理解宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制、鑒定有效的治療靶點(diǎn)及預(yù)后判斷分子標(biāo)志物對(duì)宮頸癌患者的個(gè)體化治療及提高整體生存率意義重大。

隨著基因芯片及基因測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，越來(lái)越多的非編碼RNA已被證實(shí)在疾病的診斷及治療中具有重要的作用。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在過(guò)去被認(rèn)為是基因組RNA中的“轉(zhuǎn)錄噪聲”，近年來(lái)也被證實(shí)，可在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[3]。H19[4]、MALAT1[5]和HOTAIR[6]也被證實(shí)在中的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。有研究報(bào)道，TUG1[7]、MEG3[8]和ANRIL等[9]lncRNAs可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。然而，尿路上皮癌相關(guān)分子1（urothelial can cer associated 1，UCA1）在宮頸癌中表達(dá)及臨床相關(guān)性尚無(wú)研究報(bào)道。本研究通過(guò)基因芯片篩選出UCA1在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，并證實(shí)UCA1的表達(dá)與宮頸癌患者生存及預(yù)后密切相關(guān)。本研究有助于鑒定新的宮頸癌治療分子靶點(diǎn)及預(yù)后判斷標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床標(biāo)本選取2007年12月-2010年12月于本研究所用宮頸癌組織及癌旁組織，入組患者在濰坊市益都中心醫(yī)院婦產(chǎn)科確診為宮頸癌并行根治性切除術(shù)。同一患者腫瘤組織及配對(duì)癌旁組織切除后，立刻儲(chǔ)存于液氮之中，備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。所有入組患者均親自簽署知情同意書(shū)，同意其標(biāo)本用于本項(xiàng)研究?；颊呷虢M前均未接受放化療，且無(wú)其他器官重大疾病史。術(shù)后生存資料采用電話方式進(jìn)行回訪，回訪時(shí)間以患者死亡或本研究截止之日。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器RNA提取試劑RNAiso reagent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（購(gòu)自日本TaKaRa公司）。宮頸癌組織及癌旁組織間lncRNA表達(dá)譜差異委托上海伯豪公司行l(wèi)ncRNA芯片檢測(cè)。4℃高速離心機(jī)（購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司），置入-80℃冰箱冷凍保存（購(gòu)自青島海爾公司）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取研磨組織至粉末狀，加入適量的RNAiso reagent，再研磨直至裂解液呈透明狀，將勻漿轉(zhuǎn)移至離心管，12 000 r/min，4℃離心5 min。向上清液中加入1/5體積RNAiso reagent的氯仿，震蕩至溶液呈乳白狀，再次12 000 r/min，4℃離心15 min。離心后溶液分為3層，即無(wú)色的上清液、中間白色蛋白層及下層有機(jī)層。吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，加入等體積異丙醇，12 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清液，加入500μl 75%的乙醇，再次12000r/min，4℃離心5 min。所得沉淀即為RNA，加入200 μl去離子水，置入-80℃冰箱冷凍儲(chǔ)存。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄取總 RNA 2 μl，加入10 mmol/L dNTP，Oligo（dT）（0.5 μg/μl）各 1 μl。70℃ 5 min，冰上放置2 min。加入 10×Buffer 2μl，RNase抑制劑 1 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μl。混勻后 42℃ 60 min，80℃5 min。所得產(chǎn)物即為cDNA模板。

1.2.3 qRT-PCR加入 125 μl的 20×SYBR溶液至1.0 ml 2.5×Real Master Mix中，所得溶液作為試劑A。實(shí)驗(yàn)采用20 μl體系，內(nèi)還有9 μl試劑A，1 μl 20×ROX Reference Dye，1μl正向引物，1 μl反向引物，cDNA 模板 2 μl，6 μl去離子水。qRT-PCR 的反應(yīng)條件 為：95℃ 2 min；95℃ 20 s，60℃ 20s，72℃ 30s，共循環(huán)35個(gè)。UCA1正向引物：5'-CTCTCCATTGGGTTCACCATTC-3'；反向引物：5'-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3'；U6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACG CTTCACGAAYYYGCGT-3'。計(jì)算公式為：UCA1相對(duì)表達(dá)量：2-ΔΔCt=2-[（CtUCA1-CtU6）待測(cè)樣本-（CtUCA1-CtU6）校準(zhǔn)樣本]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用配對(duì)設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)分析宮頸癌組織與癌旁組織間UCA1的表達(dá)水平差異，采用Spearman秩相關(guān)分析UCA1表達(dá)水平與宮頸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線及Log-rank檢驗(yàn)分析UCA1表達(dá)水平與宮頸癌患者生存周期間的關(guān)系，采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析UCA1的表達(dá)水平與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α入=0.050，α出=0.100，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌及癌旁組織中差異表達(dá)的lncRNAs

提取5例宮頸癌及同一患者配對(duì)癌旁組織標(biāo)本的RNA，利用LncRNA芯片檢測(cè)在宮頸癌組織及癌旁組織中差異表達(dá)的lncRNAs。經(jīng)數(shù)據(jù)分析后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，在宮頸癌中有21個(gè)上調(diào)、63個(gè)下調(diào)的lncRNA。取上調(diào)和下調(diào)的30個(gè)lncRNAs制備熱圖，結(jié)果顯示UCA1在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，而在癌旁組織中表達(dá)下調(diào)（見(jiàn)圖1），提示UCA1可能參與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控。

圖1 宮頸癌組織及癌旁組織中差異表達(dá)的lncRNAs

2.2 UCA1在宮頸癌和癌旁組織中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，71例癌旁組織中UCA1的相對(duì)表達(dá)量為（0.914±0.751），71例宮頸癌組織中UCA1的相對(duì)表達(dá)量為（6.137±2.984），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.194，P=0.015），見(jiàn)圖 2。宮頸癌組織中UCA1的表達(dá)水平高于癌旁組織。

圖2 宮頸癌組織及癌旁組織中UCA1的相對(duì)表達(dá)水平

2.3 UCA1與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)宮頸癌組織中UCA1表達(dá)的均數(shù)6.137，將UCA1表達(dá)水平高于6.137的患者作為UCA1高表達(dá)組，將UCA1表達(dá)水平低于6.137的患者作為UCA1低表達(dá)組，利用Speraman秩相關(guān)分析UCA1表達(dá)水平與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，UCA1的表達(dá)水平與宮頸癌FIGO分期密切相關(guān)，隨著FIGO分期的進(jìn)展，UCA1的表達(dá)逐漸升高（r=0.614，P=0.015），見(jiàn)表1。而UCA1表達(dá)水平與宮頸癌的其他臨床病理特征，包括年齡、HPV狀態(tài)、腫瘤類型及組織分化程度均無(wú)相關(guān)性（見(jiàn)表1）。提示UCA1的表達(dá)與宮頸癌的病情進(jìn)展呈正相關(guān)。

表1 UCA1的表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4 UCA1與宮頸癌術(shù)后5年生存率的關(guān)系

生存曲線結(jié)果顯示，UCA1的表達(dá)與宮頸癌患者術(shù)后5年總體生存率（Log-rank檢驗(yàn)：P=0.008，見(jiàn)圖3A）及無(wú)進(jìn)展生存率（Log-rank檢驗(yàn)：P=0.021，見(jiàn)圖3B）密切相關(guān)，UCA1高表達(dá)組的宮頸癌患者術(shù)后5年生存率及無(wú)進(jìn)展生存率低于UCA1低表達(dá)組。

2.5 UCA1與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系

Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型多因素分析結(jié)果顯示，UCA1高表達(dá)組宮頸癌患者術(shù)后總體生存風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)為3.791（95%CI：1.984，10.314，P=0.019），UCA1 高表達(dá)組宮頸癌患者術(shù)后無(wú)進(jìn)展生存風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)為2.715（95%CI：1.613，5.187，P=0.032）。UCA1 為宮頸癌患者術(shù)后總體生存預(yù)后及無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。此外，F(xiàn)IGO分期也被證實(shí)為宮頸癌患者術(shù)后總體生存預(yù)后（＾HR=4.185，95%CI：2.145，13.314，P=0.008）及無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后（＾HR=5.134，95%CI：2.114，7.875，P=0.011）的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。而其他病理特征與宮頸癌患者術(shù)后預(yù)后無(wú)關(guān)。見(jiàn)表2、3。

圖3 UCA1的表達(dá)與宮頸癌患者術(shù)后生存率的關(guān)系

表2 UCA1的表達(dá)與宮頸癌術(shù)后總體生存預(yù)后的關(guān)系

表3 UCA1的表達(dá)與宮頸癌術(shù)后無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后的關(guān)系

3 討論

LncRNA為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，一系列研究結(jié)果表明lncRNA的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。與編碼蛋白的mRNA不同，大多數(shù)lncRNAs的表達(dá)具有極高的組織特異性。YANG等的研究顯示，lncRNA PVT1在宮頸癌患者血清中表達(dá)異常升高，并與患者的腫瘤體積及臨床分期密切相關(guān)，且可作為宮頸癌早期診斷的分子標(biāo)志物[10]。CAO等的研究顯示，lncRNA-SPRY4-IT1在宮頸癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，且可作為判斷宮頸癌患者生存及預(yù)后的獨(dú)立分子標(biāo)志物[11]。lncRNA在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，然而，僅僅少數(shù)的lncRNAs得到較為充分的研究，大多數(shù)lncRNAs在宮頸癌中的表達(dá)及功能尚未得到充分研究。

通過(guò)lncRNA芯片篩選宮頸癌組織及癌旁組織中差異表達(dá)的lncRNAs，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-UCA1在宮頸癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，根據(jù)宮頸癌中UCA1的表達(dá)水平將患者分為UCA1高表達(dá)組及低表達(dá)組，結(jié)果顯示UCA1的表達(dá)與宮頸癌FIGO分期密切相關(guān)，UCA1高表達(dá)的宮頸癌患者術(shù)后5年生存率高于低表達(dá)的患者，UCA1表達(dá)及FIGO分期為宮頸癌患者獨(dú)立的預(yù)后判斷指標(biāo)。UCA1在胰腺癌[12]、結(jié)腸癌[13]及腦膠質(zhì)瘤[14]多種腫瘤中已證實(shí)發(fā)揮重要的作用。NI等的研究顯示，UCA1在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)，并與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤分期密切相關(guān)，并可作為結(jié)腸癌獨(dú)立的判斷預(yù)后的分子標(biāo)志物[15]。FANG等的研究顯示，UCA1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，此外，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的組織中UCA1的表達(dá)要高于原位腫瘤患者[16]。與既往研究結(jié)果相符，筆者的研究也證實(shí)UCA1在宮頸癌中可能作為癌基因發(fā)揮作用，并與腫瘤的分期密切相關(guān)。

近年來(lái)，有研究認(rèn)為UCA1可作為調(diào)控不同信號(hào)通路中關(guān)鍵分子而參與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展。YANG等的研究顯示，UCA1可通過(guò)PI3K/AKT而調(diào)控CRBE的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控膀胱癌細(xì)胞周期[17]。另有研究報(bào)道，UCA1可通過(guò) mTOR-STAT3/miR-143-HK2途徑而調(diào)控膀胱癌腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝水平[18]。此外，研究顯示在膀胱癌中miR-1可調(diào)控UCA1的表達(dá)[19]，提示microRNA和lncRNA間有著復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。因此，后續(xù)研究有必要進(jìn)一步深入研究UCA1在腫瘤中扮演癌基因的分子機(jī)制。

本研究通過(guò)lncRNA芯片及qRT-PCR技術(shù)篩選并證實(shí)長(zhǎng)鏈非編碼RNA-UCA1在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，并與宮頸癌患者的FIGO分期密切相關(guān)。更為重要的是，研究發(fā)現(xiàn)UCA1可作為判斷宮頸癌患者生存及預(yù)后的分子標(biāo)志物。本研究結(jié)果為鑒定宮頸癌診斷及治療的分子靶點(diǎn)奠定必要的基礎(chǔ)。

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Significance of long non-coding RNA urothelial cancer associated 1 in cervical cancer

Shan-shan Liu1,Guo-sheng Zhang1,Jing Pan2
(1.Weifang Nursing Vocational College,Weifang,Shandong 262500,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,Yidu Central Hospital of Weifang,Weifang,Shandong 262500,China)

ObjectiveTo investigate the expression level of long non-coding RNA (lncRNA)urothelial cancer associated 1 (UCA1)in cervical cancer,and evaluate its prognostic value in cervical cancer.MethodsCancer tissue as well as adjacent normal tissue from patients diagnosed with cervical cancer were harvested in this study.LncRNA arrays were performed to identify differentially expressed lncRNAs.Expression of UCA1 was measured by qRT-PCR.Spearman rank correlation analysis was performed to evaluate the association between UCA1 and clinical manifestation of cervical cancer patients.K-M survival analysis was utilized to determine correlation of UCA1 expression with 5-year survival.Cox's proportional hazards regression models were applied to analyze the relationships between UCA1 and prognosis of cervical cancer patients.ResultsUCA1 was upregulated in cervical cancer tissues compared with normal tissues.Expression of UCA1 was closely associated with FIGO stage of cervical cancer (P=0.015).Expression of UCA1 was negatively correlated with 5-years survival rate.UCA1 and FIGO stage were independent prognostic risk factor of cervical cancer.ConclusionUCA1 is upregulated in cervical cancer,and is negatively associated with outcome of cervical cancer.

UCA1;cervical cancer;prognosis;survival

R737.33

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.30.009

1005-8982（2017）30-0051-05

2017-05-23

（王榮兵 編輯）