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    棕櫚酸對轉(zhuǎn)化生長因子β1刺激的肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡及Caspase-12蛋白表達(dá)的影響*

    2017-12-27 18:52:48李雅楠閆宇王銘劉芳肖永紅
    關(guān)鍵詞:星狀棕櫚內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

    李雅楠 ,閆宇 ,王銘 ,劉芳 ,肖永紅

    (華北理工大學(xué) 1.公共衛(wèi)生學(xué)院,2.臨床醫(yī)學(xué)院,河北 唐山 063000)

    棕櫚酸對轉(zhuǎn)化生長因子β1刺激的肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡及Caspase-12蛋白表達(dá)的影響*

    李雅楠 1,閆宇 2,王銘 1,劉芳 1,肖永紅 1

    (華北理工大學(xué) 1.公共衛(wèi)生學(xué)院,2.臨床醫(yī)學(xué)院,河北 唐山 063000)

    目的研究棕櫚酸對轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)刺激的肝星狀細(xì)胞(HSC)增殖、凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(caspase-12)蛋白表達(dá)的影響。方法將液氮保存下的肝星狀細(xì)胞株,于37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行復(fù)蘇傳代培養(yǎng),同步化后將細(xì)胞分為5組:空白組、TGF-β1(5 ng/ml)組、TGF-β1+低、中、高劑量棕櫚酸組,即5 ng/ml TGF-β1刺激24 h,再分別加入50、100及200 μmol/L不同劑量棕櫚酸作用24 h后,用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率、免疫細(xì)胞化學(xué)法測定Caspase-12蛋白表達(dá)。結(jié)果不同濃度棕櫚酸均能抑制細(xì)胞增殖(P<0.05),且隨著劑量的增加,細(xì)胞相對增殖率(RGR)降低,低、中、高劑量組分別為76.56%、60.93%和34.37%,組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。透視電鏡發(fā)現(xiàn),不同劑量棕櫚酸組出現(xiàn)細(xì)胞核變小,細(xì)胞出現(xiàn)大量線粒體空泡,染色質(zhì)邊集等典型凋亡表現(xiàn)??瞻捉M、TGF-β1組、TGF-β1+低、中、高劑量棕櫚酸組凋亡率分別為(3.32±0.29)%、(1.70±0.14)%、(7.26±0.46)%、(11.24±0.52)%及(15.55±0.31)%,組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);隨著棕櫚酸劑量的增加,細(xì)胞Caspase-12蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。結(jié)論棕櫚酸能抑制細(xì)胞增殖,增加Caspase-12蛋白表達(dá),促進(jìn)HSC凋亡。

    肝星狀細(xì)胞;棕櫚酸;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(caspase-12)

    肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是對慢性肝損傷的愈合反應(yīng),為一個可逆的過程[1]。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝臟分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrixc,ECM)的主要細(xì)胞,HSC 激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞是HF發(fā)生、發(fā)展的核心環(huán)節(jié)[2]。而轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta-1,TGF-β1)可以激活HSC并增加多種促纖維化因子的表達(dá),在肝纖維化中起重要作用[3]。如何逆轉(zhuǎn)HF的進(jìn)程是抗HF研究的重點之一。近年來,針對誘導(dǎo)活化的HSC凋亡成為研發(fā)抗HF藥物的熱點。棕櫚酸是一種動植體內(nèi)常見的高級飽和脂肪酸,有研究報道[4],棕櫚酸刺激巨噬細(xì)胞的脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(A-FABP)表達(dá)增加,可引起巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡,從而發(fā)揮促動脈粥樣硬化作用。亦有研究報道[5-6],棕櫚酸通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡,且呈濃度和時間依賴性降低成骨細(xì)胞增殖活性,增加細(xì)胞凋亡,增高細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和基因的表達(dá),但其具體機制目前尚不明確。本研究用棕櫚酸作用于經(jīng)TGF-β1刺激的HSC,觀察細(xì)胞增殖、凋亡及ERS標(biāo)志性蛋白Caspase-12的變化,旨在從ERS途徑探討棕櫚酸對HSC凋亡的影響,以為HF的治療提供新的靶點。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞株

    表型為活化的HSC株,從四氯化碳刺激的大鼠肝細(xì)胞中分離并獲得永生性。

    1.1.1 藥品與試劑棕櫚酸(購自北京百威靈公司),二甲基亞砜(DMSO)、青霉素及鏈霉素混合液(雙抗)(美國Sigma公司生產(chǎn)),胎牛血、DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液及含體積分?jǐn)?shù)0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶(購自美國BI公司),TGF-β1(批號:PHG9204,購自美國Gibco公司),辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國Arigo公司),兔抗鼠Caspase-12一抗(武漢博士德有限公司),F(xiàn)ITC Annexin V Apoptosis Detection Kit Ι(購自美國BD公司)。

    1.1.2 儀器3111細(xì)胞孵育箱(美國Thermo公司),F(xiàn)ACScalibur流式細(xì)胞儀(美國貝帝公司),AC24S1生物安全柜(新加坡ESCO公司),TS100F倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司),Universal HoodⅡ凝膠成像分析儀,7500透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將存放于液氮中的細(xì)胞復(fù)蘇傳代培養(yǎng)于含有6%胎牛血清、1%雙抗(100 u/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)DMEM 高糖培養(yǎng)基中,在37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中進(jìn)行孵育。當(dāng)細(xì)胞長滿密度達(dá)到80%時,胰蛋白酶進(jìn)行傳代并接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。

    1.2.2 細(xì)胞分組及處理空白組,TGF-β1組,TGF-β1+低、中、高劑量棕櫚酸組??瞻捉M加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,TGF-β1組加入5 ng/ml TGF-β1作用細(xì)胞48 h,TGF-β1+低、中、高劑量棕櫚酸組先用5 ng/ml TGF-β1作用細(xì)胞24 h,再分別加入50、100及200 μmol/L棕櫚酸,培養(yǎng)24 h后檢測各項指標(biāo)的改變。

    1.2.3 MTT比色法檢測HSC增殖 [7]細(xì)胞經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)后,以2.5×104個/孔的密度接種于96孔板中,每孔200 μl細(xì)胞懸液,每組設(shè)置5個復(fù)孔并在37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行孵育48 h,在培養(yǎng)結(jié)束前,每孔加入20 μl MTT避光孵育4 h,4 h之后棄去上清液,加入200 μl DMSO,避光震蕩10 min后酶標(biāo)儀490 nm波長處讀取光密度值(OD),計算細(xì)胞相對增殖率(relative growth rate,RGR)RGR= 實驗組OD490/對照組OD490×100%。

    1.2.4 透視電子顯微鏡觀察HSC超微結(jié)構(gòu)的改變[8]將細(xì)胞處理后進(jìn)行消化、離心,預(yù)冷的PBS洗3遍,戊二醛4℃固定過夜。然后用PBS緩沖液洗2 h,鋨酸固定1.5 h,PBS再次清洗2 h,然后依次經(jīng)過酒精(30%、50%、70%、90%、100%)脫水,樹脂包埋,AOE型鉆石切片機進(jìn)行超薄切片,枸櫞酸鉛,醋酸鈾雙染,透視電子顯微鏡觀察HSC細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的改變。

    1.2.5 AV/PI雙染檢測HSC凋亡[9]細(xì)胞經(jīng)過處理后,預(yù)冷PBS清洗3遍,胰蛋白酶進(jìn)行消化,離心,沉淀細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,預(yù)冷PBS再次清洗3遍;預(yù)留1/3空白組細(xì)胞,不加任何染料,作為陰性對照組,剩下細(xì)胞加入1×Binding buffer 195 μl+5 μl An-nexin V,輕輕吹打進(jìn)行混勻,避光孵育30 min,離心沉淀細(xì)胞,棄上清液,加入1×Binding buffer 195μl+5 μl PI,輕輕吹打混勻,之后流式細(xì)胞儀檢測。

    1.2.6 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測HSC內(nèi)Caspase-12蛋白表達(dá)[9]取對數(shù)生長期的細(xì)胞,胰蛋白酶消化,接種在帶有玻片的6孔板內(nèi),按照各處理組操作完成后,將培養(yǎng)板孔中的蓋玻片取出,PBS沖洗2次,用4%多聚甲醛固定,按SP法試劑盒操作方法進(jìn)行Caspase-12蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色,DAB顯色后,顯微鏡下觀察后攝片。結(jié)果判定:以胞漿棕黃色為陽性表達(dá)。

    圖像分析:將染色后的細(xì)胞爬片經(jīng)Image-pro plus專業(yè)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析,200倍視野下每組圖片隨機選取6個視野,取其積分光密度值作為Caspase-12蛋白表達(dá)。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 細(xì)胞增殖情況

    經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示,各組OD值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=195.25,P=0.000),TGF-β1組與空白組比較OD值增高(P<0.05);不同濃度棕櫚酸均抑制細(xì)胞增殖(P<0.05),且隨著劑量的增加,細(xì)胞RGR降低,低、中、高劑量棕櫚酸組,組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    2.2 HSC細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的改變

    空白組細(xì)胞體積較大,輪廓不規(guī)則,伸展性好,周緣伸出密集不規(guī)則的樹枝狀偽足。胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)可見正常微絨毛、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體和細(xì)胞核(見圖1A);TGF-β1組和空白組無差異,有完整的細(xì)胞器,細(xì)胞核處于分裂相,染色質(zhì)分布均勻(見圖1B);TGF-β1+低劑量棕櫚酸組,細(xì)胞表面微絨毛消失,表面平滑,胞漿收縮(見圖1C);TGF-β1+中劑量棕櫚酸組染色質(zhì)凝集、濃縮(見圖1D);TGF-β1+高劑量棕櫚酸組染色質(zhì)密度增加,沿核膜邊集,厚薄不均,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡,細(xì)胞核變小等典型細(xì)胞凋亡特征(見圖1E)。

    2.3 各處理組細(xì)胞間凋亡率

    流式細(xì)胞儀檢測各處理肝星狀細(xì)胞凋亡散點圖,見圖2。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示,不同處理組間細(xì)胞凋亡率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=707.27,P=0.000),TGF-β1組凋亡率低于空白組(P<0.05);隨著棕櫚酸劑量加大,細(xì)胞凋亡率增加。見表2。

    2.4 HSC內(nèi)Caspase-12蛋白表達(dá)

    不同處理組HSC免疫組織化學(xué)結(jié)果見圖3。與空白組比較,TGF-β1組HSC的細(xì)胞漿染色深淺不明顯(見圖3B);低、中、高劑量棕櫚酸細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色,且隨著劑量的增加,細(xì)胞漿棕黃色逐漸加深(見圖3C~E)。與空白組比較,TGF-β1組Caspase-12蛋白表達(dá)未見差異(P>0.05),不同劑量棕櫚酸使HSC中Caspase-12蛋白表達(dá)增強(P<0.05)。見表3。

    表1 不同處理組HSC吸光度的改變 (n=5,±s)

    表1 不同處理組HSC吸光度的改變 (n=5,±s)

    注:1)與空白組比較,P<0.05;2)與 TGF-β1組比較,P<0.05;3)與TGF-β1+低劑量棕櫚酸組比較,P<0.05;4)與TGF-β1+中劑量棕櫚酸組比較,P<0.05

    空白組 1.28±0.13 100.00 TGF-β1組 1.85±0.111) 144.00 TGF-β1+棕櫚酸組低0.98±0.081)2) 76.56 195.25 0.000中0.78 ±0.041)2)3) 60.93高0.44 ±0.031)2)3)4) 34.37

    圖1 透視電子顯微鏡下各處理組細(xì)胞的形態(tài)變化

    圖2 不同處理組HSC凋亡散點圖

    表2 不同處理組HSC凋亡率的改變 (n=3,%,±s)

    表2 不同處理組HSC凋亡率的改變 (n=3,%,±s)

    注:1)與空白組比較,P<0.05;2)與 TGF-β1組比較,P<0.05;3)與TGF-β1+低劑量棕櫚酸組比較,P<0.05;4)與TGF-β1+中劑量棕櫚酸組比較,P<0.05

    空白組 3.32±0.29 TGF-β1組 1.70±0.141)TGF-β1+棕櫚酸組低7.26±0.461)2) 707.27 0.000中11.24±0.521)2)3)高15.55±0.311)2)3)4)

    圖3 各處理組細(xì)胞中Caspase-12蛋白的表達(dá)(免疫組織化學(xué))

    表3 各組HSC中Caspase-12蛋白表達(dá) (n=6,±s)

    表3 各組HSC中Caspase-12蛋白表達(dá) (n=6,±s)

    注:1)與空白組比較,P<0.05;2)與 TGF-β1組比較,P<0.05;3)與TGF-β1+低劑量棕櫚酸組比較,P<0.05

    空白組 4 827.12±116.10 TGF-β1組 4 845.49±131.27 TGF-β1+棕櫚酸組低6 545.90±205.891) 517.52 0.000中8 352.85±212.461)2)高9 619.55±114.641)2)3)

    3 討論

    傳統(tǒng)觀點認(rèn)為,HF形成過程中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞是HSC。TGF-β1刺激HSC可作為體外的HF模型,可以用于進(jìn)行HSC基因表達(dá)調(diào)控、抗纖維化藥物作用及纖維化發(fā)生機制等研究[3]。促進(jìn)活化的HSC凋亡,有助于逆轉(zhuǎn)HF。棕櫚酸是一種在生物體內(nèi)廣泛存在的飽和脂肪酸,又稱十六烷酸。有結(jié)果表明,棕櫚酸對βTC6細(xì)胞增殖率及胰島素的合成有抑制作用,并且呈時間-劑量依賴性作用,證實棕櫚酸對βTC6細(xì)胞的毒性損傷作用[10]。本研究用不同劑量棕櫚酸作用于經(jīng)TGF-β1刺激的HSC,MTT結(jié)果顯示,低、中、高劑量棕櫚酸增殖率依次降低,說明棕櫚酸明顯抑制HSC增殖。

    PARK等[11]發(fā)現(xiàn),HSC經(jīng)棕櫚酸處理后其線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較對照組疏松,當(dāng)加入Caspase、p53或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑能使細(xì)胞增殖水平恢復(fù)。表明棕櫚酸能抑制細(xì)胞增殖可能與細(xì)胞凋亡、自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)[5],棕櫚酸可誘導(dǎo)包括成骨細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與棕櫚酸誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡過程。

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)在棕櫚酸誘導(dǎo)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胰島細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮重要作用[12-14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是繼死亡受體活化和線粒體損傷之后第3條介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中ERS有1條特有Caspase-12途徑,Caspase-12與其他的Caspases一樣以無活性的酶原形式存在。ERS引起Caspase-12激活,激活的Caspase-12切割并激活Caspase-9,活化的Caspase-9激活Caspase-3等效應(yīng)Caspases,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。BITKO等[15]研究發(fā)現(xiàn),由呼吸道合胞病毒引起的A549人肺上皮細(xì)胞凋亡與Caspase-12活化及ERS有關(guān)。本實驗通過免疫組織細(xì)胞化學(xué)檢測法發(fā)現(xiàn),低、中、高劑量棕櫚酸上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Caspase-12表達(dá)水平。

    研究結(jié)果表明,棕櫚酸能抑制細(xì)胞增殖,增加Caspase-12蛋白表達(dá),促進(jìn)HSC凋亡。用棕櫚酸干預(yù)可能為抗纖維化的治療帶來了新的提示。

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    Effect of palmitic acid on caspase-12 and proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells*

    Ya-nan Li1,Yu Yan2,Ming Wang1,Fang Liu1,Yong-hong Xiao1
    (1.College of Public Health,2.College of Clinical Medicine,North China University of Science and Technology;Tangshan,Hebei 063000,China)

    ObjectiveTo investigate the effect of palmitic acid (PA)on caspase-12 and proliferation and apoptosis in rat hepatic stellate cells (HSCs)when stimulated by transforming growth factor-β1(TGF-β1).MethodsHSCs were randomly divided into five groups:Sham group,TGF-β1group,TGF-β1+low PA group,TGF-β1+middle PA group and TGF-β1+high PA group.HSCs were stimulated by TGF-β1(5 ng/ml)for 24 hours followed by co-incubation with PA under different doses(50,100,and 200 umol/L).No intervention was performed in Sham group.Cell proliferation was detected by MTT;morphological manifestations of cells were obtained by transmission electronmicroscope;apoptosis rate was determined by flow cytometry;expression levels of caspase-12 was measured by Immunohistochemistry.ResultsCellular proliferation was significantly inhibited with PA treatment in a dose dependent manner(P<0.05).Transmission electronmicroscope showed typical apoptotic features such as small nuclei,large numbers of mitochondria vacuoles and obvious edge sets of DNA.Treatment of PA dramatically increased apoptosis rate when compared with TGF-β1group[(7.26±0.46)%vs(1.70±0.14)%,P<0.05;(11.24±0.52)%vs(1.70±0.14)%,P<0.05;(15.55±0.31)%vs(1.70±0.14)%,P<0.05].Expression of caspase-12 protein increased significantly with PA in dose dependent manner (P<0.05).ConclusionPA inhibits cellular proliferation through promoting caspase-12 mediated apoptosis in HSCs.

    hepatic stellate cell;palmitic acid;proliferation;apoptosis;caspase-12

    R575.5

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2017.30.003

    1005-8982(2017)30-0015-06

    2017-07-08

    河北省自然科學(xué)基金資助項目(No:H2015209043)

    肖永紅,E-mail:kycxyh@tom.com;Tel:0315-8805226

    (王榮兵 編輯)

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