紅景天苷對(duì)缺氧誘導(dǎo)培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

朱 寧， 張 喆， 劉 莉， 陳彥紅， 邸雪琴

(1.保定市第一中心醫(yī)院，河北 保定 071000;2.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河北 保定 071000;3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定 071000)

心血管疾病作為臨床上的常見病、多發(fā)病，無(wú)論是發(fā)病率還是死亡率均居各類疾病之首，并已成為目前嚴(yán)重威脅人類健康的最主要疾病之一。常見的心血管疾病如心絞痛、心肌梗死、缺血性心臟病等心臟病患者不可避免的最終結(jié)局就是充血性心力衰竭，而這些疾病往往共同的病理生理基礎(chǔ)均是心肌缺血［1］。因此，對(duì)心血管疾病心肌損傷的病理生理機(jī)制及藥物治療靶點(diǎn)的研究成為當(dāng)今心血管疾病的研究熱點(diǎn)。紅景天苷 (Salidroside)是常用的藏醫(yī)中藥紅景天的有效萃取物之一［2］，紅景天是治療高原病的常用藥材，中醫(yī)傳統(tǒng)理論認(rèn)為其具有固本扶正、益氣活血之功效，用來(lái)治療咳血、肺炎、咳嗽與高原缺氧反應(yīng)等疾病，并認(rèn)為其滋補(bǔ)強(qiáng)身作用在已知補(bǔ)益藥中罕見的，因此紅景天享有“東方神草”、“黃金植物”的美譽(yù)，是繼人參、刺五加之后我國(guó)發(fā)現(xiàn)的第3種重要的保健藥用資源。紅景天苷作為其主要有效成分，研究已顯示其具有抗缺氧、抗衰老、提高腦力及體力機(jī)能等方面作用，本實(shí)驗(yàn)采用N2飽和缺氧培養(yǎng)基制備心肌細(xì)胞缺氧損傷模型，觀察紅景天苷對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品及儀器 出生1～2 d健康SD大鼠 (北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，99%紅景天苷粉劑 (上海英軒生化試劑有限公司)，胎牛血清 (上海微科生化試劑有限公司)，胰蛋白酶 (華美生物公司)，DMEM干粉 (Gibco公司)，SOD檢測(cè)試劑盒 (南京建成生物工程研究所)，MDA檢測(cè)試劑盒 (南京建成生物工程研究所)，CO2孵箱 (北京吉諾思科貿(mào)有限公司)，SW-CJ-2FD型凈化工作臺(tái) (蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，SHZ—82恒溫水浴振蕩器 (北京凱幕生物技術(shù)有限公司)，F(xiàn)A21045N型電子天平 (上海精密科學(xué)儀器有限公司)，VIS—7220可見光分光光度計(jì) (北京瑞利分析儀器公司)，TS100型倒置顯微鏡 (日本Olympus公司)，Sunris吸光酶標(biāo)儀 (瑞士 SUNRIS公司)，JYD—250超聲波細(xì)胞粉碎儀 (上海京工實(shí)業(yè)有限公司)，M185706熒光分光光度計(jì) (北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)，6、24、96孔板 (Costar公司)。

1.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 以Harary的方法為基礎(chǔ)略加改動(dòng)，無(wú)菌條件下取出生后1～2 d SD乳鼠心室若干，采用0.08%胰酶消化3～4次，并收集上清液，最后加入含15%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基以終止消化并制成細(xì)胞懸液，放入37℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，根據(jù)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間的不同，采用差速貼壁55 min，以5×105/mL接種至25 mL培養(yǎng)瓶中，24 h后更換培養(yǎng)液，同時(shí)小心洗去除未貼壁細(xì)胞，再經(jīng)24～48 h，待心肌細(xì)胞大部分伸展開，連成一片，同步搏動(dòng)時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 缺氧損傷模型的制備 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的培養(yǎng)心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基倒掉，以預(yù)先飽和純氮?dú)?(99.99%)30 min的N2飽和缺氧培養(yǎng)基沖洗兩次，取N2飽和缺氧培養(yǎng)基3 mL加入培養(yǎng)皿中，同時(shí)向皿內(nèi)充氮?dú)?0 s置換瓶?jī)?nèi)空氣，置于37℃CO2培養(yǎng)箱備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與處理 心肌細(xì)胞培養(yǎng)72 h換無(wú)血清培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h后經(jīng)不同處理后置于37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h:①正常對(duì)照組:正常培養(yǎng)基培養(yǎng);②缺氧模型組:N2飽和缺氧培養(yǎng)基培養(yǎng);③紅景天苷低、中、高劑量組:N2飽和缺氧培養(yǎng)基同時(shí)加10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L紅景天苷共培養(yǎng)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 MDA水平 具體方法參照超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5.2 SOD活性 具體方法參照超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5.3 SERCA活性 將心肌細(xì)胞超聲裂解后，每組取勻漿液10 μL依次置于6孔板中，每孔加入80 μL反應(yīng)液 (20 mmol/L HEPES，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L MgCl2，0.01‰TritonX-100，0.8 mmol/L CaCl2，100 mmol/L KCl)，在37 ℃恒溫水浴箱預(yù)溫10 min。每孔再分別加入100 mmol/L對(duì)硝基苯磷酸 (pNPP)10 μL，37℃恒溫水浴箱中反應(yīng)30 min;最后加入含55 mmol/L EDTA和500 mmol/L Tris的冷緩沖液1 mL終止反應(yīng);在波長(zhǎng)410 nm下，測(cè)定所有樣本的吸光度，根據(jù)測(cè)得的對(duì)硝基苯酚 (PNP)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣本中PNP的生成量。

1.5.4 細(xì)胞內(nèi) ［Ca2+］i用含15%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)至3～5×105cells/mL，加入Fura-2/AM，終濃度為5 μmol/L，避光、振搖30 r/min、孵育30 min;1 000 r/min離心5 min，棄上清，用HEPES緩沖液沖洗兩遍。每組取細(xì)胞懸液1 mL置入熒光光度計(jì)檢測(cè)小室中，發(fā)射波長(zhǎng)500 nm，激發(fā)波長(zhǎng)380 nm和340 nm。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析 (One-Way ANOVA)，按統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)定P＜0.05有顯著性差異。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 16.0軟件計(jì)算分析。

2 結(jié)果

2.1 MDA水平 與正常對(duì)照組比較，缺氧模型組心肌細(xì)胞MDA水平明顯增高 (P＜0.05)，說(shuō)明缺氧的心肌細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)明顯;與缺氧模型組比較，紅景天苷低劑量、中劑量、高劑量組心肌細(xì)胞MDA水平均降低 (P＜0.05)，且隨著藥物劑量的增加，MDA的降低呈一定的劑量依賴趨勢(shì)，見表1。

表1 各組心肌細(xì)胞MDA水平與SOD活性的比較(x ± s，n=8)

2.2 SOD活性 與正常對(duì)照組比較，缺氧模型組心肌細(xì)胞SOD活性明顯降低 (P＜0.01)，說(shuō)明缺氧時(shí)心肌細(xì)胞氧自由基清除系統(tǒng)功能下降;與缺氧模型組比較，紅景天苷低劑量組SOD活性有增高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)，紅景天苷中、高劑量組心肌細(xì)胞SOD活性明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05)，見表1。

2.3 SERCA活性 與正常對(duì)照組比較，缺氧模型組心肌細(xì)胞內(nèi)SERCA活性明顯降低65%(P＜0.05)，說(shuō)明缺氧時(shí)心肌細(xì)胞SERCA活性下降，肌漿網(wǎng)攝取Ca2+能力低下;與缺氧模型組比較，紅景天苷低劑量組SERCA活性有所升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)，紅景天苷中、高劑量組心肌細(xì)胞SERCA活性明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05)，提示SERCA活性的增高可能是紅景天苷減輕缺氧心肌鈣超載的機(jī)制之一，見表2。

表2 各組心肌細(xì)胞 SERCA活性和 ［Ca2+］i濃度比較(±s，n=8)

注:與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與缺氧模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 劑量/(mg·mL-1)SERCA活性(μmol·min-1·g-1pro)細(xì)胞游離Ca2+濃度/(nmol·L-1)正常對(duì)照組 —2.03±0.15 163.81±4.94缺氧模型組 — 0.69±0.02* 289.81±13.69＊＊紅景天苷低劑量組 10 0.89±0.03 200.64±6.15紅景天苷中劑量組 50 1.34±0.16# 181.82±7.64##紅景天苷高劑量組 100 1.57±0.10# 180.35±4.50##

2.4 細(xì)胞游離Ca2+濃度 與正常對(duì)照組比較，缺氧模型組心肌細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i明顯升高了77%(P＜0.01)，說(shuō)明缺氧時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi) ［Ca2+］i濃度增高，存在鈣超載;與缺氧模型組比較，紅景天苷低劑量組［Ca2+］i有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)，紅景天苷中、高劑量組心肌細(xì)胞［Ca2+］i濃度均明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.01)，但兩劑量組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。

3 討論

目前氧自由基 (oxygen free radicals)損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載是心血管疾病心肌損傷的發(fā)病機(jī)理中兩種最主要的學(xué)說(shuō)［3］。缺氧的心肌細(xì)胞損傷主要包括細(xì)胞膜、線粒體及溶酶體損傷三方面的改變［4］。細(xì)胞膜是細(xì)胞缺氧最早發(fā)生損傷的部位。缺氧時(shí)，細(xì)胞膜離子泵功能障礙、膜通透性增加、膜流動(dòng)性下降和膜受體功能障礙。許多致病因子作用會(huì)造成氧自由基蓄積引起脂質(zhì)過(guò)氧化物水平增高，進(jìn)一步損傷心肌細(xì)胞膜系統(tǒng)［5］。細(xì)胞膜通透性增加，Ca2+順濃度差進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，肌漿網(wǎng)攝鈣速度減慢或攝鈣量減少，出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，Ca2+進(jìn)入線粒體形成不溶性磷酸鈣，也會(huì)加重ATP生成不足，還可以增強(qiáng)Ca2+依賴性蛋白激酶的活性，促進(jìn)氧自由基生成，進(jìn)而加重自由基對(duì)細(xì)胞的損傷［6］。Ca2+超載可激活磷脂酶，分解膜磷脂，使溶酶體膜的穩(wěn)定性降低，通透性增高，嚴(yán)重時(shí)溶酶體膜可以破裂，溶酶體內(nèi)蛋白分解酶逸出引起細(xì)胞自溶，進(jìn)一步損傷細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜，溶酶體酶進(jìn)入血液循環(huán)可破壞多種組織，造成廣泛的細(xì)胞損傷［7］。

細(xì)胞內(nèi)外Ca2+穩(wěn)態(tài)的維持依賴于細(xì)胞膜Ca2+跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)Ca2+釋放與攝取的動(dòng)態(tài)平衡［8］。細(xì)胞膜Ca2+跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)主要依賴細(xì)胞膜Ca2+通道、質(zhì)膜鈣泵(即Ca2+-ATPase)以及Na+-Ca2+交換體。細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流的實(shí)現(xiàn)主要依賴于細(xì)胞膜上的Ca2+通道。目前研究認(rèn)為細(xì)胞膜上主要有4種特異性蛋白質(zhì)Ca2+通道［9］:滲透通道、機(jī)械門控式Ca2+通道、電壓依賴式Ca2+通道以及受體依賴式Ca2+通道。調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外Ca2+分布的另一個(gè)重要因素就是細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)對(duì)Ca2+的攝取與釋放。細(xì)胞器肌漿網(wǎng)富含大量Ca2+，被稱之為鈣庫(kù)。目前研究認(rèn)為，心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高90%由肌漿網(wǎng)釋放，肌漿網(wǎng)對(duì)Ca2+的釋放與攝取是引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的主要原因。肌漿網(wǎng)Ca2+釋放主要依賴IP3受體系統(tǒng)和RyR受體系統(tǒng)，兩者均屬于受體依賴式Ca2+通道［10］。當(dāng)心肌細(xì)胞興奮時(shí)，細(xì)胞膜上電壓依賴式L-型Ca2+通道開放，Ca2+順濃度差由細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但進(jìn)入的量很少不足以引起肌肉收縮，這些少量的Ca2+可以激活臨近肌漿網(wǎng)IP3、RyR受體通道，釋放大量Ca2+泵入胞漿，Ca2+濃度迅速升高10倍以上，大量增加的Ca2+與肌鈣蛋白C相互作用，肌鈣蛋白構(gòu)型改變，促使肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合觸發(fā)心肌收縮。心肌收縮后胞漿內(nèi)Ca2+的清除主要通過(guò)SERCA泵回到肌漿網(wǎng)或由細(xì)胞膜的Na+-Ca2+交換體排出細(xì)胞外，從而使胞漿內(nèi)Ca2+降低，心肌細(xì)胞舒張。SERCA的主要功能就是將胞漿內(nèi)Ca2+攝取入肌漿網(wǎng)。研究發(fā)現(xiàn)SERCA有多個(gè)異構(gòu)體，其中SERCA2主要在心肌細(xì)胞中表達(dá)［11］。

目前紅景天苷廣泛用于臨床治療心衰、心肌缺血患者，并可提高心肌細(xì)胞對(duì)外來(lái)有毒物質(zhì)免疫力。有資料證實(shí)，紅景天苷具有抗心律失常保護(hù)心肌作用，并能抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖與收縮。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示［12］，紅景天苷可以減少H2O2誘導(dǎo)體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)漏出量，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用，減輕心肌細(xì)胞凋亡。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)紅景天苷可以減少缺氧心肌細(xì)胞LDH漏出，并能抑制Ca2+與鈣調(diào)蛋白(Calmodulin，CaM)結(jié)合，來(lái)減輕鈣超載對(duì)細(xì)胞的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷可通過(guò)提高SERCA活性，增加肌漿網(wǎng)Ca2+攝取功能，減輕細(xì)胞鈣超載，提示這可能是紅景天苷對(duì)缺氧心肌細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制之一。

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