2種真菌漆酶降解桉葉木質(zhì)素的比較

劉梓韜，王繼坤，王麗，曹庸，郭麗瓊，曹素芳，趙力超,2*

1(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642)2(廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510640)3(澳優(yōu)乳業(yè)(中國(guó))有限公司，湖南 長(zhǎng)沙，410200)

2種真菌漆酶降解桉葉木質(zhì)素的比較

劉梓韜1，王繼坤1，王麗1，曹庸1，郭麗瓊1，曹素芳3，趙力超1,2*

1(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642)2(廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510640)3(澳優(yōu)乳業(yè)(中國(guó))有限公司，湖南 長(zhǎng)沙，410200)

從菌株對(duì)桉葉殘?jiān)慕到狻⒓兠概c桉葉木質(zhì)素吸附和降解以及底物和產(chǎn)物變化3個(gè)角度，比較研究了木霉LaTr01和靈芝TR6產(chǎn)真菌漆酶降解桉葉木質(zhì)素的差異。研究結(jié)果表明，殘?jiān)举|(zhì)素的降解程度與菌株產(chǎn)漆酶的能力緊密相關(guān)，菌株在以桉葉殘?jiān)鼮榈孜锏墓虘B(tài)發(fā)酵過(guò)程中，靈芝TR6產(chǎn)漆酶酶活較高，但木霉LaTr01具有表達(dá)量大、胞外分泌率高、產(chǎn)酶速度快等特點(diǎn)；兩種純化真菌漆酶在精制桉葉木質(zhì)素上的吸附更貼近非均勻表面兩階段多層吸附，符合Sips吸附模型，靈芝TR6被桉葉木質(zhì)素吸附量較多，酶解效果就更明顯；底物光譜分析和產(chǎn)物GC-MS法檢測(cè)表明，兩種漆酶對(duì)木質(zhì)素降解后底物的官能團(tuán)在種類上沒(méi)有變化，數(shù)量上有一定的差異，降解途徑都是側(cè)鏈氧化去甲基化和芳香環(huán)骨架斷裂。兩真菌漆酶降解桉葉木質(zhì)素的差異性主要體現(xiàn)分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的與底物易接近性，從而進(jìn)一步導(dǎo)致降解酶解率、產(chǎn)物種類和數(shù)量的差異。

桉葉木質(zhì)素；漆酶；木霉；靈芝；酶解差異

桉樹(Eucalyptusspp.)為桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)樹種的統(tǒng)稱，是全球三大著名速生造林樹種(桉、松、楊)之一，也是我國(guó)華南地區(qū)最主要的紙漿用材[1]，我國(guó)種植面積已逾200萬(wàn)hm2[2]。桉葉是桉木加工過(guò)程中大量存在的副產(chǎn)品，含有桉葉油、黃酮、有機(jī)酸、鞣質(zhì)及酚、蛋白質(zhì)等有效成分[3-6]。目前對(duì)其的利用主要集中在桉葉精油的開發(fā)提取上[7]，對(duì)其他成分的應(yīng)用開發(fā)研究較少。本課題組前期對(duì)桉葉中的多酚種質(zhì)資源進(jìn)行了研究[8]，分離提取出抗氧化活性較強(qiáng)的桉葉多酚。經(jīng)檢測(cè)，提取精油和桉葉多酚后的桉葉殘?jiān)羞€含有大量的木質(zhì)素，如果最終的木質(zhì)素殘?jiān)材芗右岳?，就能?shí)現(xiàn)桉葉資源的整體再利用。

目前眾多木質(zhì)素再利用方法中，生物降解法具有處理成本低、條件溫和、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，是具有應(yīng)用潛力的一種方法[9]。在自然界中，木質(zhì)素完全降解需要真菌、細(xì)菌和其他微生物群落共同作用，其中真菌起著主要作用[10]。真菌降解木質(zhì)素通過(guò)分泌木質(zhì)素降解酶，如漆酶(Laccase)，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LiP)及錳過(guò)氧化物酶(MnP)，并在氧分子的共同作用下完成酶解[11]。其中真菌漆酶作為一種多功能氧化還原酶，能夠催化木質(zhì)素等多種化合物的氧化降解反應(yīng)[12]，具有更大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前漆酶主要用擔(dān)子菌中的白腐菌生產(chǎn)[13]，但隨著研究的深入和應(yīng)用的需要，其他漆酶高產(chǎn)菌株不斷被挖掘。課題組前期篩選出2株產(chǎn)漆酶真菌，1株為靈芝(Ganodermalucidum)TR6，優(yōu)化后菌株產(chǎn)漆酶最高活性可達(dá)11 000 U/L[14]與其他常用漆酶生產(chǎn)菌株(糙皮側(cè)耳類)相比，漆酶活性有了較大幅度提高，同時(shí)該菌株具有較高的食藥用價(jià)值。另1株為華南地區(qū)土壤中分離得到的產(chǎn)漆酶的小型絲狀真菌，鑒定為棘孢木霉(Trichodermaasperellum)LaTr01，該菌酶活可達(dá)480.556 U/L[15]，比靈芝TR6低，但其具有表達(dá)量大、胞外分泌率高、產(chǎn)酶速度快等優(yōu)點(diǎn)。

雖然漆酶降解木質(zhì)素的機(jī)理已經(jīng)很清晰，但漆酶對(duì)不同的底物的降解能力并不一致，針對(duì)桉葉木質(zhì)素的分解能力尚未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)不同漆酶在同一種底物上的降解差異性研究也不夠系統(tǒng)。課題組比較了兩種真菌靈芝TR6和木霉LaTr01在桉葉殘?jiān)系纳L(zhǎng)和利用能力，同時(shí)將菌株分泌的漆酶純化，研究?jī)煞N真菌漆酶與桉葉木質(zhì)素的吸附特性和降解特性，并對(duì)降解產(chǎn)物的種類和數(shù)量進(jìn)行分析。課題組一方面試圖解釋真菌漆酶降解木質(zhì)素的差異性所在，對(duì)漆酶降解理論體系提供新的數(shù)據(jù)，另一方面為推動(dòng)木質(zhì)素降解產(chǎn)物工業(yè)化生產(chǎn)和桉葉加工廢棄物的綜合利用打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桉葉殘?jiān)∽哉n題組利用廣林9號(hào)桉樹葉提取桉葉精油、桉葉多酚后剩余殘?jiān)?，其中木質(zhì)素含量為30.15%，纖維素含量為41.09%，半纖維素含量為24.05%；木霉LaTr01號(hào)菌株，由課題組研究人員自華南地區(qū)的菜地、草地、樹木園、湖邊淤泥中及湖邊枯木堆中篩選獲得；靈芝TR6號(hào)菌株，由課題組研究人員從熱帶地區(qū)多株木腐真菌中篩選獲得。

木霉LaTr01和靈芝TR6產(chǎn)漆酶，由課題組經(jīng)過(guò)鹽析、超濾和分級(jí)柱層析獲得，比活力分別為32.16 U/mg和65.38 U/mg。木霉LaTr01產(chǎn)漆酶表觀分子量為69.2 kDa，降解木質(zhì)素?zé)o需誘導(dǎo)劑，最適作用條件為pH5.0、50 ℃；靈芝TR6產(chǎn)漆酶表觀分子量為62.6 kDa，0.05 mmol/L ABTS為最佳誘導(dǎo)劑，含誘導(dǎo)劑最適作用條件為pH4.6、50 ℃。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限公司；雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)，上海古朵生物科技有限公司；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；JY92-2D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-3010系列紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津；VERTEX70型傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)BRUKE公司；7890A-5975氣相質(zhì)譜連用，安捷倫。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 桉葉木質(zhì)素的提取

將干燥后的桉葉殘?jiān)诔叵掠枚趿h(huán)-水(體積比9∶1)溶劑連續(xù)抽提4 h，反復(fù)提取3次，使原料中木質(zhì)素和可溶性物質(zhì)全部被提取出來(lái)。然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在真空條件下于40 ℃下將溶劑蒸干，得到粗制二氧六環(huán)木質(zhì)素。所得到的粗木質(zhì)素按Lundquist 液-液提純方法進(jìn)行精制[16-17],該方法得到部分水解的、極少縮合的木質(zhì)素，可作為結(jié)構(gòu)研究用[18]。

1.3.2 桉葉木質(zhì)素1H-NMR分析

稱取15 mg樣品溶于0.5 mL DMSO-d6中，在DRX500型超導(dǎo)核磁共振波譜儀上進(jìn)行1H-NMR測(cè)定。

1.3.3 漆酶活力的測(cè)定

參考韓君莉的方法[14]并加以改進(jìn)。以0.5 mmol/L ABTS作為反應(yīng)底物，在pH4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉體系中，加入適量的酶液，50 ℃反應(yīng)5 min。在紫外分光光度計(jì)測(cè)定420 nm處反映吸光值的變化，取其線性部分，計(jì)算漆酶的酶活力。定義每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol的底物所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.3.4 兩菌株對(duì)桉葉殘?jiān)慕到獠町?/p>

稱取一定量100目桉葉殘?jiān)?，加入無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液(其中Cu2+為1.0 mmol/L)使其充分濕潤(rùn)，滅菌后接入菌株(靈芝TR6體系額外添加誘導(dǎo)劑ABTS 0.05 mmol/L)。在溫度為36 ℃、濕度為80%條件下培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間測(cè)殘?jiān)心举|(zhì)素的量和單位殘?jiān)衅崦傅幕盍?。降解率D渣%按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：D渣%為桉葉殘?jiān)心举|(zhì)素降解率；M0為桉葉殘?jiān)谐跏寄举|(zhì)素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；M1為降解一段時(shí)間后桉葉殘?jiān)心举|(zhì)素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.5 兩種漆酶在桉葉木質(zhì)素上的吸附及降解差異

1.3.5.1 漆酶的吸附動(dòng)力學(xué)

參考趙力超的方法并加以改進(jìn)[19]。取1 g精制的桉葉木質(zhì)素，加入100 mL pH4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液浸沒(méi)，在4 ℃的冰箱中放置12 h，使木質(zhì)素充分潤(rùn)脹，達(dá)到最大表面積。分組加入過(guò)量的等蛋白質(zhì)質(zhì)量(20 mg)的兩種純化漆酶(靈芝TR6漆酶反應(yīng)體系含誘導(dǎo)劑ABTS 0.05 mmol/L)。在4 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min下吸附，測(cè)定不同時(shí)間(0、5、10、20、30、60、120、180 min)體系中上清液酶活?？瞻淄喜僮鳎患游絼?。吸附量按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：Γ，單位底物對(duì)酶蛋白的吸附量， mg/g；C0、C1分別是吸附前后酶液的酶活， U/mL；V為體系總體積，mL；m，體系中固體桉葉木質(zhì)素質(zhì)量，g；v，所取酶液的體積，mL；SA為酶的比活力，U/mg。

1.3.5.2 漆酶的吸附等溫線及等溫線模型

操作步驟同上，根據(jù)吸附動(dòng)力學(xué)結(jié)果設(shè)定等溫吸附時(shí)間，測(cè)定不同加酶量(1、2、4、6、8、10、12、16、20 mg)體系中上清液酶活。吸附量按公式(2)計(jì)算。繪制吸附等溫線，根據(jù)吸附等溫線的形狀和數(shù)據(jù)，用Freundlich吸附模型(3)、Langmuir單層吸附模型(4)和Sips吸附模型(Langmuir模型改進(jìn)型)(5)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。數(shù)據(jù)采用Origin軟件處理。

(3)

(4)

(5)

式中：Γe平衡吸附量，mg/g；Γmax為飽和吸附量，mg/g；Ce為單位酶質(zhì)量濃度，mg/L；b，吸附作用平衡常數(shù)；n，吸附劑的不均一性。

1.3.5.3 漆酶的酶解動(dòng)力學(xué)

參考趙力超的方法并加以改進(jìn)[19]。用100 mL pH4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液體系浸泡1 g精制的桉葉木質(zhì)素，在4 ℃的冰箱中放置12 h，使桉葉木質(zhì)素充分潤(rùn)脹，達(dá)到最大表面積。加入15 mg純化漆酶(靈芝TR6漆酶體系含誘導(dǎo)劑ABTS 0.05 mmol/L)。在50 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min條件下反應(yīng)一定時(shí)間(0、10、20、30、60、100、140、180 min)，研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)降解率的影響。反應(yīng)前后在280 nm下測(cè)定吸光值，木質(zhì)素的降解率D木%按照公式(6)計(jì)算：

(6)

式中：D木%，精制桉葉木質(zhì)素的降解率；A0、A1分別為降解前后精制桉葉木質(zhì)素的吸光值。

1.3.5.4 酶解前后桉葉木質(zhì)素紅外光譜

取1 mg酶解180 min后的樣品和100 mg KBr在干燥條件下混合均勻后研磨、壓片，在德國(guó)BRUKER VERTEX 70型傅里葉變換紅外光譜儀上進(jìn)行測(cè)試。掃描范圍：4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.3.5.5 酶解前后體系生成物分析

酶解產(chǎn)物用GC-MS法分析[20]。GC分析采用一級(jí)程序升溫，45 ℃停留4 min以3 ℃/min升溫至280 ℃，保持15 min進(jìn)樣口溫度為250 ℃，檢測(cè)器溫度為280 ℃，載氣為氦氣，流量1.0 mL/min，分流比為100∶1。MS測(cè)試電離源的電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，掃描范圍為15～500 u。利用儀器配套的分析軟件和NIST02質(zhì)譜庫(kù)及人工分析產(chǎn)物的組成并鑒定結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉葉木質(zhì)素1H-NMR分析

圖1 桉葉木質(zhì)素的1H-NMRFig.1 1H-NMR spectra acquired of Eucalyptus leaves lignin

表1 桉葉木質(zhì)素的1H-NMR峰譜主要?dú)w屬Table 1 The assignments of Eucalyptus leaves lignin main1H-NMR absorption peaks

2.2 兩菌株對(duì)桉葉殘?jiān)慕到獠町?/h3>

課題組利用自主研發(fā)的低溫連續(xù)相變萃取技術(shù)[19]，以廣林9號(hào)桉樹葉為原料，提取桉葉精油、桉葉多酚[21]，以提取后剩余的殘?jiān)鼮榈孜?，研究木霉LaTr01和靈芝TR6在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)漆酶規(guī)律和對(duì)底物中木質(zhì)素的降解規(guī)律，如圖2所示。

從產(chǎn)漆酶能力比較2種菌株(圖2右Y軸)：在木質(zhì)素含量30%左右的桉葉殘?jiān)腆w發(fā)酵培養(yǎng)基上，木霉LaTr01產(chǎn)漆酶的速度明顯快于靈芝TR6，在8 d達(dá)到峰值，靈芝TR6在21 d才達(dá)到峰值。但靈芝TR6的最大漆酶酶活為木霉LaTr01的1倍，能達(dá)到60 U/g。從對(duì)桉葉殘?jiān)慕到獗容^2種菌株(圖2左Y軸)：木霉LaTr01在8 d內(nèi)分解木質(zhì)素較快，此后降解速度趨緩，最大分解率為18.5%；靈芝TR6在16 d內(nèi)的降解速度較慢，在16～24 d內(nèi)快速上升，此后緩慢增加，最大分解率為31.3%。2菌株對(duì)桉葉殘?jiān)慕到饪炻徒到饴矢叩团c菌株產(chǎn)酶規(guī)律基本一致。

圖2 兩菌株產(chǎn)漆酶和降解木質(zhì)素隨時(shí)間變化規(guī)律Fig.2 The variation of Laccase production and lignin degradation with time in two strains

2.3 兩種漆酶在桉葉木質(zhì)素上的吸附等溫線

圖3為4 ℃下，木霉LaTr01和靈芝TR6產(chǎn)漆酶(已純化，比活力分別為32.16 U/mg和65.38 U/mg)在精制桉葉木質(zhì)素上的吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3 在4 ℃下，木霉LaTr01和靈芝TR6產(chǎn)漆酶在精制桉葉木質(zhì)素上的吸附動(dòng)力學(xué)Fig.3 Adsorption dynamics of LaTr01 and TR6 on refined Eucalyptus leaves lignin at 4 ℃

由圖3可見(jiàn)，兩種漆酶在精制桉葉木質(zhì)素上都能很快達(dá)到吸附平衡，均在40 min左右。在吸附體系中，純酶在溶液和單一吸附劑表面之間平衡分布是固定的，由吸附動(dòng)力學(xué)結(jié)果可以設(shè)定酶的等溫吸附實(shí)驗(yàn)時(shí)間為45 min。

圖4 在4 ℃下，木霉LaTr01和靈芝TR6產(chǎn)漆酶在精制桉葉木質(zhì)素上吸附45 min時(shí)的吸附等溫線Fig.4 Adsorption isotherms of LaTr01 and TR6 on refined Eucalyptus leaves lignin for 45 min at 4 ℃

由圖4可知，4 ℃吸附45 min條件下，兩條吸附等溫線均符合“S”型吸附等溫線特征。當(dāng)平衡液酶量較小時(shí)，吸附量隨著平衡液酶量的增加而緩慢增大；當(dāng)平衡液酶量繼續(xù)增加，吸附量會(huì)急劇增加；當(dāng)平衡液酶量達(dá)到某一值時(shí)，吸附量增加開始變緩。桉葉木質(zhì)素對(duì)靈芝TR6產(chǎn)漆酶吸附量較高。

2.4 兩種漆酶與桉葉木質(zhì)素間的等溫線模型

根據(jù)圖3等溫線形態(tài)，“S”型特征首先排除Freundlich吸附模型，用Origin軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Langmuir和Sips吸附模型擬合，結(jié)果如表2所示。從R2來(lái)看，Sips吸附模型比Langmuir單分子層吸附模型更符合試驗(yàn)結(jié)果，按該模型繪制的回歸曲線見(jiàn)圖4中的實(shí)線。

表2 按照公式(4)和公式(5)計(jì)算的吸附等溫線模擬參數(shù)Table 2 Simulation parameters of the adsorption isotherms calculated from the formula(4) and the formula(5)

2.5 兩種真菌漆酶對(duì)桉葉木質(zhì)素的酶解差異

兩種真菌漆酶對(duì)桉葉木質(zhì)素降解率隨時(shí)間變化的曲線如圖5所示。在前80 min內(nèi)，降解率隨著時(shí)間的增加而迅速升高，隨后變緩。靈芝TR6漆酶對(duì)木質(zhì)素的降解率較高，最后穩(wěn)定在33.98%左右，木霉LaTr01漆酶降解率穩(wěn)定在22.99%左右。

圖5 木霉LaTr01和靈芝TR6產(chǎn)漆酶在精制桉葉木質(zhì)素上的酶解動(dòng)力學(xué)Fig.5 Enzymolysis kinetics of LaTr01 and TR6 on refined Eucalyptus leaves lignin

EL1:桉葉木質(zhì)素； EL2:LaTr01酶解后的桉葉木質(zhì)素；EL3:TR6酶解后的桉葉木質(zhì)素圖6 紅外光譜圖Fig.6 IR Spectrum

表3 主要紅外吸收譜帶歸屬Table 3 The assignments of main IR absorption peaks

在24 h條件下比較2種真菌漆酶對(duì)桉葉木質(zhì)素降解的差異，GC-M分析結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，空白組出現(xiàn)1,2,3-丙三羧酸及少量的丙酸、十八酸、棕櫚酸等物質(zhì)，與文獻(xiàn)中報(bào)道的情況吻合，表明木質(zhì)素確實(shí)發(fā)生了降解。HERNANDEZ等[22-23]研究發(fā)現(xiàn)在木質(zhì)素的對(duì)照組出現(xiàn)小分子的醛類和酸類物質(zhì)，認(rèn)為是木質(zhì)素被空氣中的氧氣氧化所致。靈芝TR6降解桉葉木質(zhì)素的產(chǎn)物中含量較高的是丙酸和丙二酸，分別為12.33%和19.67%，丙二酸、乙酰乙酸、丁二酸、丁酸、十四烷酸、L-脯氨酸等都是新生成的物質(zhì)；木霉LaTr01降解桉葉木質(zhì)素的產(chǎn)物中出現(xiàn)了丙二酸、丁二酸等新物質(zhì)，丙酸含量略有增加，其余成分變化不大。

表4 木霉LaTr01和靈芝TR6產(chǎn)漆酶桉葉木質(zhì)素的產(chǎn)物GC-MS檢測(cè)結(jié)果Table 4 Analysis results of Eucalyptus leaves Lignin after enzymatic hydrolysis by LaTr01 and TR6 by GC-MS

3 結(jié)論

(1)兩種產(chǎn)漆酶菌株在桉葉殘?jiān)系墓腆w發(fā)酵試驗(yàn)表明，雖然菌株在發(fā)酵過(guò)程中均會(huì)產(chǎn)生含漆酶在內(nèi)的復(fù)雜酶系，但二者對(duì)底物的利用都依賴于漆酶的分泌，殘?jiān)举|(zhì)素的降解程度與菌株產(chǎn)漆酶的能力緊密相關(guān)。同時(shí)，該結(jié)果驗(yàn)證了課題組前期液體發(fā)酵的結(jié)果，兩菌株產(chǎn)酶各有優(yōu)點(diǎn)，靈芝TR6產(chǎn)漆酶酶活較高，但木霉LaTr01具有表達(dá)量大、胞外分泌率高、產(chǎn)酶速度快等優(yōu)點(diǎn)。

(2)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的等溫吸附體系是異類的固液體系，由水不溶性木質(zhì)素和水溶性漆酶組成。提純的桉葉木質(zhì)素(吸附劑)對(duì)不同菌種產(chǎn)漆酶的吸附量不同，說(shuō)明酶與底物的易接近性不同。漆酶對(duì)木質(zhì)素的易接近性受許多因素影響，如木質(zhì)素的表面積、密度、孔隙率、孔徑大小，酶的分子大小、結(jié)構(gòu)、基團(tuán)等。木質(zhì)素是由苯基丙烷結(jié)構(gòu)單元通過(guò)碳-碳和醚鍵連接而成的具有三度空間的高分子聚合物，易形成氫鍵，憎水基多，不易與水形成氫鍵，而對(duì)兩菌株產(chǎn)漆酶吸附量都比較大。兩種漆酶的分子量接近，木霉LaTr01產(chǎn)漆酶為69.2 kDa，靈芝TR6產(chǎn)漆酶為62.6 kDa。而漆酶是一種糖蛋白，肽鏈一般由500個(gè)左右的氨基酸組成，糖基占整個(gè)分子的10%～45%[24]，糖基的差異導(dǎo)致同工酶的產(chǎn)生[25]。因此，推測(cè)實(shí)驗(yàn)中的等溫吸附差異是由溶液中漆酶的結(jié)構(gòu)狀態(tài)和糖基的變化造成，原因有待于對(duì)兩種漆酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步研究。

(3)漆酶在木質(zhì)素上的吸附是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，清楚地認(rèn)識(shí)酶在溶液中的固體上吸附機(jī)理存在一定的困難，但可以借助數(shù)學(xué)模型從理論上進(jìn)行剖析。實(shí)驗(yàn)中Sips吸附模型更符合兩種漆酶在木質(zhì)素上的吸附特性，該模型是Langmuir單分子層吸附模型的變型，是一種非均勻表面兩階段吸附熱力學(xué)模型。這說(shuō)明，兩種真菌漆酶在木質(zhì)素上的吸附不是簡(jiǎn)單的單分子層吸附，更貼近非均勻表面兩階段多層吸附。該模型的建立可對(duì)指導(dǎo)設(shè)計(jì)生化反應(yīng)器提供參數(shù)依據(jù)。

(4)酶解動(dòng)力學(xué)和GC-MS結(jié)果都說(shuō)明，對(duì)同一種底物來(lái)說(shuō)，吸附酶量越大，酶解率越高。靈芝TR6被桉葉木質(zhì)素吸附量較多，酶解效果就更明顯。GC-MS同樣檢測(cè)到的丙酸、丁酸等小分子酸類物質(zhì)，可以說(shuō)明木質(zhì)素芳香環(huán)骨架發(fā)生斷裂后，被氧化生成羧酸類或者醛類物質(zhì)[26]。兩種漆酶對(duì)木質(zhì)素降解后底物的官能團(tuán)在種類上沒(méi)有變化，數(shù)量上有一定的差異，降解途徑都是側(cè)鏈氧化去甲基化和芳香環(huán)骨架斷裂，進(jìn)而說(shuō)明了不同來(lái)源的漆酶作用在木質(zhì)素的位點(diǎn)是相同的，但程度不同。

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ComparativestudyonEucalyptusleaveslignindegradationbytwofungallaccase

LIU Zi-tao, WANG Ji-kun1, WANG Li1, CAO Yong1,GUO Li-qiong1, CAO Su-fang3, Zhao Li-chao1,2*

1(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)2(Guangdong Province Key Laboratory for Green Processing of Natural Products and Product Safety, Guangzhou 510640, China)3(Ausnutria Dairy (China) Co. Ltd., Changsha 410005, China)

TheEucalyptusleaves lignin degradation byTrichodermaspp. LaTr01 andGanodermalucidumTR6 from three aspects the degradation ofEucalyptusleaves, the adsorption and degradation of pure enzyme andEucalyptuslignin, and the changes of substrate and product. The results prove that the degradation degree of residual lignin was closely related to the laccase producing ability. In the process of solid-state fermentation withEucalyptusleaves residue as substrate, the laccase activity of TR6 was higher, LaTr01 showed the characteristics of high expression, high excretion rate and rapid enzyme production. The adsorption of two kinds of purified laccase on purifiedEucalyptuslignin was close to the Uniform Surface Two-Step Adsorption Model, which conformed to Sips adsorption model adsorption capacity of TR6 was higher and the effect was more obvious. Spectroscopic analysis of the substrate and detection of the product by GC-MS showed that there was no difference in the number of functional groups in the substrates of the two kinds of laccase, the degradation pathway of both the side chain oxidative demethylation and the aromatic ring skeleton breakage. The differences of the degradation ofEucalyptusleaves lignin by two kinds of fungal laccase mainly showed that the molecular structure of laccase led to the accessibility of the substrate, which further led to the enzymatic hydrolysis rate the type and quantity of products.

Eucalyptusleaves lignin; laccase;Trichoderma;Ganodermalucidum; difference of enzymatic hydrolysis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014223

碩士研究生(趙力超副教授為通訊作者,E-mail：zlc@scau.edu.cn)。

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B090800022)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2017A020224024)；廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目(201613)

2017-03-06，改回日期：2017-07-12