二仙補腎益精解毒方對弱精子癥大鼠模型氧化應(yīng)激損傷的保護機制研究

劉紹明，郭軍，張岳陽，時建華，丁紅陽，張修舉，陳小均

(1.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院泌尿外科，北京 100029；2.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院男科，北京 100091；3.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院男科，北京 100102；4.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院泌尿外科，北京 100078)

二仙補腎益精解毒方對弱精子癥大鼠模型氧化應(yīng)激損傷的保護機制研究

劉紹明1，郭軍2*，張岳陽3，時建華1，丁紅陽1，張修舉2，陳小均4

(1.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院泌尿外科，北京 100029；2.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院男科，北京 100091；3.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院男科，北京 100102；4.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院泌尿外科，北京 100078)

目的：證實二仙補腎益精解毒方提高弱精子癥精子活動力的作用并探討其可能的作用機制。方法：挑選72只弱精子癥大鼠模型隨機等分為：低、中、高劑量給藥組，左卡尼汀對照組，模型對照組和正常對照組6組進行對照，4周后檢測精子數(shù)量并計算精子活動力；對睪丸生精小管標本進行病理觀察；測定MDA、SOD和GSH的含量。結(jié)果：低、中、高劑量給藥組和左卡尼汀對照組B級精子百分率有改善的趨勢；MDA含量均降低，SOD含量及GSH含量均增高；中劑量給藥組及左卡尼汀對照組大鼠睪丸生精小管內(nèi)可見大量各級生精細胞。結(jié)論：二仙補腎益精解毒方可以明顯提高精子活動力，可以增加生殖細胞對ROS的抗性。

弱精子癥；氧化應(yīng)激；精子活動力

正常的授精過程需要精子有正常的結(jié)構(gòu)和功能，正常的精子活動力是精子完成授精過程的基本要素。精子活動力低下必然影響受孕成功率和生育質(zhì)量。因精子活動力下降導(dǎo)致的弱精子癥(asthenospermia/asthenozoospermia)是不育癥的常見疾病類型，其病因復(fù)雜，占男性不育癥患者的19%～20%[1]。弱精子癥屬于中醫(yī)“精清”“精寒”“精薄”“精冷”范疇，現(xiàn)代中醫(yī)學家認為“腎虛為本，濕熱、血瘀、氣滯等為標”是弱精子癥的基本病機。但從臨床實踐來看，不育癥絕大多數(shù)可能沒有任何臨床癥狀，給辨證論治帶來了諸多困難。因此臨床上一般使用微觀辨精與宏觀辨證相結(jié)合以及體質(zhì)辨證等辨證方法。即便如此，據(jù)統(tǒng)計[2]，臨床上有57.6%的不育患者體質(zhì)類型為平和質(zhì)，即使體質(zhì)辨證也無法進行。因此，目前大部分中醫(yī)家根據(jù)中醫(yī)脾腎相生和精血互化學說理論，認為脾腎兩虛夾瘀是無癥狀性弱精子癥的基本病理變化，脾腎不足為本，治當健脾益腎，即“扶正”，瘀滯不暢為標，宜活血祛瘀，即“祛邪”。二仙補腎益精解毒方為北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院泌尿外科經(jīng)驗處方，化裁于《景岳全書》所載贊育丹，一方面補腎益精，即“扶正”，另一方面清除精室毒濁、瘀血，即“祛邪”，共同作用以達到提高精子活力之目的。我們前期通過應(yīng)用二仙補腎益精解毒方治療弱精子癥的臨床療效觀察，得出二仙補腎益精解毒方治療弱精子癥確實具有較好的臨床效果[3-4]。清除多余氧自由基、恢復(fù)機體“氧化和抗氧化動態(tài)平衡”的氧化應(yīng)激學說，從而提高精子質(zhì)量及活動力，與中醫(yī)的“扶正祛邪”達到“陰平陽秘”狀態(tài)的學術(shù)思想相契合?；诖颂接懷a腎益精活血中藥(二仙補腎益精解毒方)提高弱精子癥的精子活動力、減少其非正常凋亡，是我們進行本項目研究的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級SD遠交成熟雄性大鼠105只，體質(zhì)量200～250 g，購于北京斯貝福實驗動物科學技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。均在北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗動物中心常規(guī)飼養(yǎng)。大鼠飼養(yǎng)過程中，自由進食、飲水，每天換水，隔日更換籠中墊料。環(huán)境溫度20～25℃，光照：白天12 h/日。常規(guī)喂養(yǎng)一周大鼠適應(yīng)后進行造模實驗。

1.1.2 實驗藥物

二仙補腎益精解毒方：采用中藥配方顆粒(由北京康仁堂藥業(yè)有限公司統(tǒng)一制備，藥品檢驗報告書符合2015版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定)，熟地黃24 g，白術(shù)24 g，當歸18 g，枸杞子18 g，仙茅12 g，巴戟天12 g，山萸肉12 g，淫羊藿12 g，蛇床子6 g，人參15 g，白花蛇舌草10 g，蒲公英10 g，茯苓15 g，萆薢10 g，車前子10 g，血余炭10 g。

左卡尼汀口服液：又稱左旋肉毒堿，是臨床驗證有效的抗氧化劑，由東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字H19990372。

1.2 實驗方法

1.2.1 SPF級成熟SD雄性大鼠弱精子癥模型構(gòu)建和評價

1.2.1.1 構(gòu)建大鼠弱精子癥模型

根據(jù)參考文獻[5-7]方法，使用奧硝唑(ORN)法構(gòu)建SPF級SD遠交成熟雄性大鼠弱精子癥模型。

取SPF級SD成熟雄性大鼠90只，體質(zhì)量200～250 g。常規(guī)喂養(yǎng)一周，待大鼠適應(yīng)環(huán)境后進行造模實驗。其中隨機抽取15只正常喂養(yǎng)，作為實驗時的空白對照組，每日一次用生理鹽水以18 mL/kg體質(zhì)量的劑量灌胃。其余90只每日用ORN溶液灌胃，ORN溶液由0.5%梭甲基纖維素鈉溶液按25 mg/mL濃度現(xiàn)用現(xiàn)配制。灌胃劑量通過預(yù)實驗選定，選用100 mg/(kg·d)劑量連續(xù)灌胃20 d，每天1次。從實驗開始當日起計算，每周為大鼠稱質(zhì)量1次，并觀察記錄每只大鼠的體形、毛發(fā)顏色、走路姿勢、尋找食物及日常行為表現(xiàn)，同時記錄實驗對象的死亡率并分析死亡原因。

1.2.1.2 評價大鼠弱精子癥模型

模型構(gòu)建完成后進行隨機驗證，評價是否造模成功。

最后一次給藥24 h后，分別在90只造模大鼠中隨機抽取6只、在15只空白對照組大鼠中隨機抽取1只，進行精子活動力檢測、精液氧化應(yīng)激狀態(tài)評價及觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)的改變，判斷弱精子癥模型是否成功。

1.2.2 實驗過程

篩選出弱精子癥動物模型，運用二仙補腎益精解毒方進行干預(yù)，4周后取材，檢測各組大鼠模型相關(guān)實驗指標。同時與空白對照組進行對照。

將成功篩選出的弱精子癥模型大鼠，隨機分為6組，①低劑量給藥組、②中劑量給藥組、③高劑量給藥組、④左卡尼汀對照組和⑤模型對照組，每組12只進行藥物干預(yù)，與⑥空白對照組12只大鼠對照(在之前的空白對照組內(nèi)隨機抽取12只)。測定大鼠體質(zhì)量，計算給藥量。按大鼠與人體表面積的比值計算，大鼠(200 g)給藥劑量為10 mL/(kg·d)。以中劑量25 g/(kg·d)作為等效劑量,臨床1人用量150 g生藥/60(kg·d)，低劑量和高劑量分別為大鼠等效劑量的0.5倍和2倍，三組藥物濃度分別相當于人體用量的5倍、10倍和20倍。左卡尼汀對照組予左卡尼汀口服液灌胃，模型對照組和空白對照組予生理鹽水。每組每日用藥1次，共4周。以生理鹽水配制各組藥物濃度，各劑量二仙補腎益精解毒方藥以煮沸生理鹽水浸泡30 min制成濃縮液。

低劑量給藥組：予二仙補腎益精解毒方濃縮液，按12.5 g生藥/kg體質(zhì)量的劑量進行灌胃。中劑量給藥組：予二仙補腎益精解毒方濃縮液，按25 g生藥/kg體質(zhì)量的劑量進行灌胃。高劑量給藥組：予二仙補腎益精解毒方濃縮液，按5 0g生藥/kg體質(zhì)量的劑量進行灌胃。左卡尼汀對照組：予左卡尼汀口服液0.1 g/kg體質(zhì)量的劑量進行灌胃[8]。模型對照組：予生理鹽水10 mL/kg體質(zhì)量的劑量進行灌胃?？瞻讓φ战M：予生理鹽水10 mL/kg體質(zhì)量的劑量進行灌胃。

給藥4周后取材，進行相關(guān)指標檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

對計量資料進行正態(tài)分析。如符合或近似符合正態(tài)分布，多個樣本均數(shù)比較用方差分析，多重比較用LSD檢驗。不符合正態(tài)分布者，采用非參數(shù)檢驗的秩和檢驗，相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)。統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。

2 實驗結(jié)果

2.1 實驗動物一般情況

造模過程中，除正常對照組外，所有大鼠從造模開始后很快出現(xiàn)體重減輕、食欲下降、活動減少、精神萎靡、體毛稀疏，光澤度降低、小便量增多、大便溏泄的癥狀，與中醫(yī)藥理論所說的“腎虛”證候表現(xiàn)相似。藥物干預(yù)期間，空白對照組由于沒有藥物干預(yù)，灌胃的前9天內(nèi)，體質(zhì)量和活動量無明顯增加，精神狀態(tài)差，有大便溏瀉的情況出現(xiàn)。模型對照組大鼠體質(zhì)量和活動量均不如其他各組，毛發(fā)光澤度不高，總體情況較其他組差。二仙補腎益精解毒方高、中、低劑量組，左卡尼汀對照組實驗大鼠在藥物干預(yù)期間，從灌胃操作第8天開始，體質(zhì)量和食量增加，體毛光澤度提高，活動量增加，出現(xiàn)打斗現(xiàn)象，小便量減少，大便良好。

整個造模和實驗過程均沒有大鼠死亡。

2.2 精液常規(guī)檢查結(jié)果

動物造模后，除正常對照組外所有實驗大鼠的B級精子百分率、前向精子(PR)百分率均出現(xiàn)明顯減少，與正常組相比有明顯差異，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明造模成功。

2.3 精液氧化應(yīng)激狀態(tài)評價

2.3.1 MDA檢測值

結(jié)果分析：與對照組比較，模型組及藥物組MDA含量高，有統(tǒng)計意義(P<0.01)；與模型組比較，西藥及中藥各組MDA含量均降低，有統(tǒng)計意義(P<0.01)；中藥中劑量組較高、低劑量組偏低，但無統(tǒng)計意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠精液MDA含量比較

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01

2.3.2 SOD檢測值

結(jié)果分析顯示：與對照組比較，模型組及藥物組SOD含量均低，有統(tǒng)計意義(P<0.01)；與模型組比較，西藥及中藥各組SOD含量均增高，有統(tǒng)計意義(P<0.01)；中藥中劑量組較高、低劑量組有增加趨勢，但無統(tǒng)計意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠精液SOD含量比較

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01

2.3.3 GSH檢測值

二仙補腎益精解毒方作用后結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，模型組及藥物組GSH含量均低，有統(tǒng)計意義(P<0.01)；與模型組比較，西藥及中藥各組GSH含量均增高，有統(tǒng)計意義(P<0.01)；中藥中劑量組較高、低劑量組有增加趨勢，但無統(tǒng)計意義(P>0.05)，見表3。

2.4 各組大鼠睪丸病理學觀察

左卡尼汀對照組及二仙補腎益精解毒方中劑量組睪丸及附睪均未見明顯改變，睪丸生精小管內(nèi)可見大量各級生精細胞，與正常對照組類似。詳見圖1～6。

表3 各組大鼠精液GSH含量比較

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01

圖1 正常組睪丸組織(HE染色)

圖2 正常組附睪組織(HE染色)

圖3 左卡尼汀對照組睪丸組織(HE染色)

圖4 左卡尼汀對照組附睪組織(HE染色)

圖5 中劑量給藥組睪丸組織(HE染色)

圖6 中劑量給藥組附睪組織(HE染色)

3 討論

精液中缺少有活性的精子是導(dǎo)致男性生育能力降低的主要原因，通過有效清除生殖細胞內(nèi)的ROS，優(yōu)化精子質(zhì)量、增加有活力精子的數(shù)量，是治療弱精子癥的核心環(huán)節(jié)，也是目前臨床研究的重點。如何清除過量ROS、保護線粒體功能，對于保護精子活力、增加精子數(shù)量至關(guān)重要。

本實驗選擇檢測SOD和GSH來判斷二仙補腎益精解毒方抗氧化的能力。非酶促抗氧化劑也能顯著降低MDA濃度，主要包括各種維生素、輔酶Q10以及左旋肉堿等。酶促和非酶促是機體內(nèi)源性抗氧化劑，來自大自然的外源性抗氧化劑也不少，比如深海魚、藻類等等。很多中草藥及中藥復(fù)方也被證明有很好的抗氧化作用。二仙補腎益精解毒方即是被實驗證實的有效的外源性抗氧化劑。二仙補腎益精解毒方為北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院泌尿外科經(jīng)驗處方，化裁于《景岳全書》所載贊育丹，一方面補腎益精，即“扶正”，另一方面清除精室毒濁、瘀血，即“祛邪”，共同作用以達到提高精子活力之目的。通觀全方，淫羊藿辛、甘，溫，歸肝、腎經(jīng)，益腎助陽，現(xiàn)代中藥藥理也證明，淫羊藿能改善男性睪丸間質(zhì)細胞功能，增加機體睪酮的血清水平；熟地黃甘溫質(zhì)潤入腎，善滋陰補血，益精填髓，二藥合用補腎溫陽，益精填髓，共為君藥，主導(dǎo)補腎益精以正“腎主生殖”的功效；仙茅、巴戟天鼓動腎氣，補腎陽，增強淫羊藿益腎助陽的功效；山萸肉、枸杞子益精血，滋腎陰，增加熟地黃益腎填精的作用；人參、白術(shù)、茯苓補益脾氣，更能補后天而益先天，正所謂以后天之精養(yǎng)先天之精，共為臣藥，達到補腎益精健脾的功效；同時佐以車前子清熱利濕，萆薢利膀胱水道、赤白便濁；蒲公英、白花蛇舌草清熱解毒、利濕；當歸補血活血；血余炭祛瘀血；蛇床子除能溫腎壯陽增加君臣藥力之外，還能燥濕殺蟲，共同達到清熱利濕活血解毒的作用。

本實驗結(jié)果顯示，二仙補腎益精解毒方在三個方面具有較好作用。一是在抗氧化方面能夠提升抗氧化酶GSH、SOD的含量，同時降低MDA的含量。二是能改善精子活動力，提升A級精子百分率。與正常對照組比較，各組A級精子活動力均偏低；與模型組比較，左卡尼汀對照組和中劑量給藥組活動力明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其他各組有改善的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。三是對睪丸病理結(jié)構(gòu)有改善作用。顯微鏡觀察HE染色各組睪丸病理組織切片，與正常對照組比較，模型對照組大鼠睪丸的生精小管管腔內(nèi)可見大量各級生精細胞脫落，而中劑量給藥組及左卡尼汀對照組大鼠睪丸均未見明顯改變，睪丸生精小管內(nèi)可見大量各級生精細胞，均與正常對照組類似。以上數(shù)據(jù)顯示，二仙補腎益精解毒方能提高模型大鼠的精子活動力，提高抗氧化酶SOD、GSH含量，進而清除精液ROS，同時能保護睪丸生精小管，促使各級生精細胞產(chǎn)生、生長及成熟，值得進一步研究開發(fā)。

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ProtectiveMechanismofErxianBushenYijingJieduFormulaforAsthenospermiaRatswithOxidativeStressInjury

LIU Shao-ming1,GUO Jun2,ZHANG Yue-yang3,SHI Jian-hua1,DING Hong-yang1,ZHANG Xiu-ju2,CHEN Xiao-jun4

(1.TheThirdAffiliatedHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2.XiyuanHospital,ChineseAcademyofChineseMedicineScience,Beijing100091,China; 3.WangjingHospital,ChineseAcademyofChineseMedicineScience,Beijing100102,China; 4.DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China)

Objective: To observe the protective effect of Erxian Bushen Yijing Jiedu formula improving sperm motility in asthenospermia rats with oxidative stress injury induced by Ornidazole, and to explore its possible mechanism. Methods: 72 rats were randomly divided into the blank control group, the model group, the Levocarnitine group, and low-dose medication group, middle-dose medication group, and high-dose medication group, the medication groups were treated with Erxian Bushen Yijing Jiedu formula. After four-week treatment, sperm count and sperm motility were evaluated, pathological changes were observed in seminiferous tubules of testicles, and contents of MDA, SOD and GSH-Px in testicles and epididymal tissues were determinated by spectrophotometry. Results: Grade B sperm productivity showed an improved tendency in the three medication groups and in the Levocarnitine group compared to the model group; the content of MDA was decreased, and in the contents of SOD and GSH were increased significantly in the three medication groups and in the Levocarnitine group compared to the model group; Pathological studies showed that a large number of spermatogenic cells were found in the seminiferous tubules in the middle-dose medication group and the Levocarnitine group, which were similar to those in the blank control group. Conclusion: Erxian Bushen Yijing Jiedu formula can improve sperm motility and the resistance of generative cells to ROS.

Asthenospermia; Oxidative stress; Sperm motility

R285.5;R698+.2

A

1002-2392(2017)06-0032-05

2017-08-25

2017-11-20

國家自然科學基金面上項目(81473527)

劉紹明(1975-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事泌尿男科專業(yè)工作。

*通訊作者：郭軍(1965-)，男，碩士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事泌尿男科專業(yè)工作。