WH706-CLL樹脂對(duì)白及多糖脫色工藝的研究△

車向前，常明泉，陳芳，江蓉敬

(1.湖北房縣人民醫(yī)院，湖北 房縣 442100；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院 藥學(xué)院,湖北 十堰 442000)

·中藥工業(yè)·

WH706-CLL樹脂對(duì)白及多糖脫色工藝的研究△

車向前1，常明泉2*，陳芳2，江蓉敬3

(1.湖北房縣人民醫(yī)院，湖北 房縣 442100；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院 藥學(xué)院,湖北 十堰 442000)

目的考察WH706-CLL樹脂對(duì)白及多糖提取液的脫色效果，建立最佳脫色工藝。方法以提取液濃度、溫度、pH值、流速為觀察因素，以脫色率、多糖保留率作為考察指標(biāo)。結(jié)果在提取液質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1、溫度為50 ℃、pH值為6、流速為1 mL·min-1的條件下，WH706-CLL樹脂對(duì)白及多糖的脫色率為93.7%，多糖保留率為87.3%。結(jié)論在設(shè)定工藝條件下WH706-CLL樹脂對(duì)白及多糖的脫色效果良好，適用于白及多糖的脫色。

白及多糖；色素；脫色；WH706-CLL樹脂

白及為蘭科植物白及Bletillastriate(Thumb.)Reichb.F.的干燥塊莖，具有收斂止血、清熱利濕、消腫生肌的功能，常用于咯血、吐血、外傷出血、肺結(jié)核出血和治療手足皸裂[1-2]，白及的主要活性成份是一種直鏈多糖，主要由β-1，4-甘露糖和β-1，4-葡萄糖組成[3]，隨著對(duì)其藥理研究的深入，揭示白及所含多糖除具有上述作用外，也具有抗胃潰瘍、抗腫瘤作用[4]，還可用于介入放射的診斷治療、腫瘤的栓塞治療[5-6]、藥物制劑的助懸劑、食品添加劑等，市場(chǎng)前景可觀。為了獲得優(yōu)良的制劑原材料，本實(shí)驗(yàn)研究用WH706-CLL樹脂對(duì)白及多糖脫色，以脫除其提取液中的植物色素。

1 儀器與材料

TU1901型雙光束紫外/可見分光光度計(jì)(北京普析通儀器有限責(zé)任公司)；DHG-9023A型鼓風(fēng)干燥烘箱(天津市順諾儀器科技有限公司，300×300×270)；FA 2004分析天平(天津天才精密儀器廠，精度：0.000 1 g)；WGA-UNI-10型超純水器(功率：300 W，北京普析通儀器有限責(zé)任公司)。

無水葡糖糖對(duì)照品(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，批號(hào)：200120728)；WH706-CLL樹脂(西安維華科技有限公司，批號(hào)：20150712)；層析柱(上海亞榮生化儀器廠，50 cm×3 cm)；蒽酮(上海葉緣生物有限公司，批號(hào)：20150222)；SSW型電熱恒溫水浴槽(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠，700 W)；純化水(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院新鮮制備)；硫酸、鹽酸、氫氧化鈉為分析純。

白及購(gòu)自湖北神農(nóng)本草公司，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院葉立紅教授鑒定為蘭科植物白及。

2 方法與結(jié)果

2.1 白及多糖提取液的制備

取白及飲片，在60 ℃烘箱中干燥，粉碎，過10目篩，稱取粗粉50 g，加入純化水(藥液比1∶15)750 mL，浸泡60 min，煎煮提取45 min，過濾，收集濾液，藥渣加入純化水(1∶10)500 mL，煎煮提取90 min，過濾，集中濾液，藥渣加入純化水(1∶10)500 mL，煎煮提取90 min，過濾，集中濾液，稀釋至2000 mL，混勻，使成含多糖為1 mg·mL-1的提取液。

2.2 WH706-CLL層析柱脫色

取WH706-CLL樹脂，用純化水浸泡24 h，洗至澄清，傾去水后加2～3倍量濃度為2 mol·L-1的HCl，混勻，浸泡2 h，傾去HCl，加純化水洗至中性，加4～5倍量2 mol·L-1NaOH溶液，混勻，浸泡2 h，水洗至中性；取層析柱，將處理好的樹脂濕法裝柱，裝柱量占層析柱內(nèi)容量的2/3，加蓋墊，用純化水透析至澄清，層析柱(帶恒溫套的層析柱)恒溫至50 ℃，取適宜白及多糖提取液加入層析柱中，以1 mL·min-1的流速收集脫色液，對(duì)收集液用α-萘酚濃硫酸法[7]動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，顯陽性反應(yīng)時(shí)則可收集脫色液，脫色完畢，以pH為6的稀鹽酸溶液為洗脫液洗脫，收集洗脫液至用α-萘酚濃硫酸法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)顯陰性反應(yīng)時(shí)終止，集中脫色液和洗脫液，即得。

2.3 脫色率的測(cè)定

分別取脫色前后的樣品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，用紫外分光光度計(jì)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，取3次測(cè)定的平均值，計(jì)算脫色率[8]。

脫色率(%)=(A前-A后)/A前×100%

(1)

A前為脫色前提取液的吸光度值，A后為脫色后提取液的吸光度值。

2.4 多糖保留率的測(cè)定

2.4.1 溶液的制備 密稱精取在105 ℃干燥至恒重的無水葡糖糖對(duì)照品適量，加純化水溶解，制備成質(zhì)量濃度為0.051 5 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密吸取該對(duì)照品溶液、白及多糖脫色液、純化水各2 mL于3支10 mL的刻度試管中，各加入0.2%蒽酮-硫酸試液6 mL，靜置30 min使反應(yīng)充分，溫度降至室溫，即為對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶液。

2.4.2 方法學(xué)的建立

2.4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 取質(zhì)量濃度為0.150 mg·mL-1的對(duì)照品溶液0.1、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL于10 mL刻度試管中，各加純化水至2 mL，再分別加入0.2%的蒽酮-硫酸試液6 mL，靜置30 min使反應(yīng)充分，溫度降至室溫，搖勻，既得每mL含無水葡萄糖對(duì)照品1.88、5.63、11.25、16.88、22.50、28.12、33.75 μg的對(duì)照品溶液，以2.4.1項(xiàng)下空白溶液校儀器零點(diǎn)，在589 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.022X-0.002(r=0.999)，無水葡萄糖在1.88～33.75 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.4.2.2 精密度 取2.4.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，在589 nm處測(cè)定吸收度5次，結(jié)果RSD為0.79%。

2.4.2.3 穩(wěn)定性 取2.4.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液在589 nm處于0.5、1、3、6 h測(cè)定吸收度，結(jié)果RSD為1.07%。

2.4.2.4 重復(fù)性 按2.4.1項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液5份，在589 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度，結(jié)果RSD為1.51%。

2.4.2.5 回收率 精密吸取已測(cè)含量的白及多糖脫色液1 mL于10 mL刻度試管中，共9份，每3份1組，分別按供試液含量的120%、100%和80%加入適宜對(duì)照品溶液，加純化水至2 mL，各加入0.2%蒽酮-硫酸試液6 mL，靜置30 min使反應(yīng)充分，溫度降至室溫，搖勻，在589 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，計(jì)算多糖含量，結(jié)果平均回收率為96.3%，RSD為1.61%。

2.4.3 測(cè)定 取2.4.1項(xiàng)下的供試品溶液在589 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，計(jì)算多糖保留率[7-8]。

多糖保留率(%)=M后/M前×100%

(2)

M前為脫色前提取液中多糖的含量，M后為脫色后提取液中多糖的含量。

2.5 脫色影響因素的考察

分別考察WH706-CLL樹脂在脫色時(shí)提取液濃度、溫度、pH值、流速對(duì)脫色率、多糖保留率的影響，比較各因素條件下的脫色效果。

2.5.1 濃度的影響 取白及多糖提取液分別配制成含糖量為0.5、1、2、3、4 mg·mL-1的溶液，每份樣品配制100 mL，用稀鹽酸調(diào)pH值為6，將樣品溶液在50 ℃水浴中加溫，按2.2項(xiàng)下的方法在50 ℃條件下以1 mL·min-1流速收集脫色液，分別按2.3、2.4項(xiàng)下的方法測(cè)定脫色率和多糖保留率。結(jié)果，當(dāng)多糖含量在0.5～1 mg·mL-1時(shí)脫色率比在2～4 mg·mL-1時(shí)平均高23.2%，多糖保留率差異則不顯著，取1 mg·mL-1為最佳脫色濃度，見表1和圖1。

表1 不同濃度、溫度、pH值、流速對(duì)白及多糖提取液脫色率和多糖保留率測(cè)定結(jié)果

圖1 濃度因素圖

2.5.2 溫度的影響 取白及多糖提取液配制成多含糖為1 mg·mL-1的溶液，共5份，每份樣品配制100 mL，用稀鹽酸調(diào)pH值為6，分別將樣品溶液上于設(shè)定溫度為30、40、50、60、70 ℃的層析柱(帶恒溫套的層析柱)中恒溫30 min，使樣品溶液達(dá)到設(shè)定脫色溫度。然后按2.2項(xiàng)下方法以1 mL·min-1流速收集脫色液，分別按2.3、2.4項(xiàng)下的方法測(cè)定脫色率和多糖保留率，結(jié)果，當(dāng)脫色液溫度在50～70 ℃時(shí)，脫色率趨于穩(wěn)定，平均比30～40 ℃時(shí)高9.3%，多糖保留率在此溫度范圍也趨于穩(wěn)定，取50 ℃為最佳脫色溫度。見表1和圖2。

圖2 溫度因素圖

2.5.3 pH的影響 取白及多糖提取液配制成含糖為1 mg·mL-1的溶液，共5份，每份樣品配制100 mL，分別用稀鹽酸及氫氧化鈉溶液調(diào)pH為4、5、6、7、8，將樣品溶液在50 ℃水浴中加溫，按2.2項(xiàng)下的方法在50 ℃條件下以1 mL·min-1流速收集脫色液，分別按2.3、2.4項(xiàng)下的方法測(cè)定脫色率和多糖保留率，結(jié)果，當(dāng)pH在6～8范圍時(shí)脫色率平均比pH在4～5時(shí)高9.6%，多糖保留率高8.0%，取pH 6為最佳脫色pH值，見表1和圖3。

圖3 pH因素圖

2.5.4 流速的影響 取白及多糖提取液配制成含糖為1 mg·mL-1的溶液，共5份，每份樣品配制100 mL，分別用稀鹽酸調(diào)pH值為6，將樣品溶液在50 ℃水浴中加溫，按2.2項(xiàng)下的方法在50 ℃條件下分別以0.5、1、1.5、2、2.5 mL·min-1流速收集脫色液，分別按2.3、2.4項(xiàng)下的方法測(cè)定脫色率和多糖保留率，結(jié)果，當(dāng)流速在0.5～1 mL·min-1時(shí)脫色率平均比流速處于1.5～2.5 mL·min-1時(shí)高19%，多糖保留率變化不明顯，取1 mL·min-1為最佳脫色流速。見表1和圖4。

圖4 流速因素圖

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，為了驗(yàn)證WH706-CLL樹脂層析柱對(duì)白及多糖脫色工藝的可靠性，取同一批次含白及多糖為1.0 mg·mL-1的提取液，將pH值調(diào)至6，在50 ℃條件下以1 mL·min-1的流速按2.2項(xiàng)下的方法收集脫色液，樣品溶液按2.3、2.4項(xiàng)下的方法測(cè)定脫色率與多糖保留率，結(jié)果脫色率為93.7%，多糖保留率為87.3%。該工藝為WH706-CLL樹脂層析柱用于白及多糖脫色的最佳工藝。

3 討論

白及多糖提取液濃度過高，在相對(duì)低的溫度環(huán)境下(室溫)粘性增強(qiáng)，脫色過程中會(huì)堵塞樹脂孔槽，而提高溫度有利于多糖溶解降低粘性，在實(shí)驗(yàn)中當(dāng)多糖濃度在1.5 mg·mL-1以上、脫色液收集至1/4時(shí)樹脂孔槽堵塞，幾乎沒有脫色液流出，當(dāng)脫色液濃度在1 mg·mL-1以下、溫度達(dá)到40 ℃以上時(shí)脫色液流出順暢，脫色率和多糖保留率趨于穩(wěn)定狀態(tài)。脫色液流速對(duì)脫色效果有明顯影響，1.5 mL·min-1是脫色效果的分界點(diǎn)，流速高于此時(shí)脫色率明顯下降，可能是流速過快色素未被樹脂充分吸附或脫吸附所致。由于植物色素與多糖結(jié)合形式不同，對(duì)于不同植物中的多糖，其色素和多糖含量也有差別，多糖提取液中如果存在結(jié)合性色素則難以脫除，將pH值調(diào)至6可能促使植物色素細(xì)胞破壁[9-10]，破壞與多糖的結(jié)合形態(tài)，有利于色素與多糖的分離，從而增強(qiáng)脫色效果。

筆者曾參考文獻(xiàn)[11]實(shí)驗(yàn)，在提取液中加入1.5%～3%的活性炭對(duì)白及多糖進(jìn)行脫色，但脫色率僅為62.5%，多糖保留率為75.7%，脫色后殘留活性炭難以完全去除，活性炭的吸附性是多糖損失率增多的原因；實(shí)驗(yàn)用H2O2對(duì)白及多糖脫色[12]，結(jié)果脫色率為66.8%，多糖保留率為56.4%，H2O2氧化劑性在氧化色素時(shí)也氧化部分多糖，降低其保留率，兩者脫色效果均沒有WH706-CLL樹脂理想，WH706-CLL樹脂對(duì)多糖脫色是利用其對(duì)色素成分的選擇吸附性和篩分性而達(dá)到去除白及多糖中色素的目的，它用于白及多糖的脫色，較之活性炭和H2O2具有顯著的優(yōu)越性能。WH706-CLL樹脂層析柱適用于白及多糖的脫色，所制定工藝可獲得良好的脫色效果，為白及精加工提供了可借鑒的方法。

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DecolorizationofBletillastriataPolysaccharidebyWH706-CLLResin

CHE Xiangqian1，CHANG Mingquan2*，CHEN Fang2，JIANG Rongjing3

(1.HubeiFangxianPeople’sHospital，F(xiàn)angxian，Hubei，442100，China；2.TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiMedicalUniversity，442000，China；3.ThepharmacyinstituteofHubeiMedicalUniversity,442000，China)

Objective：To investigate the decoloring effect ofBletillastriatapolysaccharide extract by WH706-CLL resin，and establish the optimum process of decolorization.MethodsWith extract concentration，temperature，pH value，flow rate as observation factors，the decolorization rate and polysaccharide retention rate were examined.ResultsWhen the extract concentration was 1 mg·mL-1，the temperature was 50 ℃，the pH value was 6，and the flow rate was 1 mL·min-1，the decoloring rate of WH706-CLL resin reached 93.7% and the polysaccharide retention rate was 87.3%.ConclusionUnder the conditions of setting process，the WH706-CLL resin has good effect on the decolorization ofB.striatapolysaccharide，and is suitable for the decolorization ofB.striatapolysaccharide.

Bletilla striata polysaccharide；pigment；decolorization；WH706-CLL resin

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.018

太和科研基金資助項(xiàng)目(2013JJXM021)；湖北省科技廳鑒定成果(2014D150024000699)

*

常明泉，副主任藥師，研究方向：藥物制劑；E-mail：907622985@qq.com

2016-11-18)