基于STM32和LABVIEW的多通道DNA合成儀控制系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

張 莉，王 堯

(1 中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢430074；2 中南民族大學(xué) 檢測(cè)與儀器校級(jí)工程中心，武漢430074)

基于STM32和LABVIEW的多通道DNA合成儀控制系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

張 莉1,2，王 堯1,2

(1 中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢430074；2 中南民族大學(xué) 檢測(cè)與儀器校級(jí)工程中心，武漢430074)

將合成DNA的固相亞磷酸酰胺法與自動(dòng)控制技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計(jì)了一款基于STM32的96通道寡核苷酸長(zhǎng)鏈的合成儀.該DNA合成儀以STM32F103ZET6 微控制器為主控芯片，接收、處理上位機(jī)發(fā)送的指令，并控制外圍的執(zhí)行單元.人機(jī)交互界面采用LabVIEW 開(kāi)發(fā)，具有合成序列多通道輸入、工作狀態(tài)監(jiān)控、與主控系統(tǒng)實(shí)時(shí)通信等功能.該DNA合成儀控制系統(tǒng)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)96 個(gè)獨(dú)立通道的寡核苷酸長(zhǎng)鏈的合成，具有合成效率高、操作界面友好、操作方便等優(yōu)點(diǎn),完全滿足中小型實(shí)驗(yàn)室及社區(qū)醫(yī)院的堿基合成需求.

磷酸酰胺法；DNA合成儀 ；STM32微控制器

DNA合成技術(shù)在基因及調(diào)控組件的合成、基因回路和生物合成途徑的重新設(shè)計(jì)組裝，以及基因組的人工合成等方面都有重要的應(yīng)用[1].21世紀(jì)以來(lái)DNA合成技術(shù)發(fā)展迅速,在能源、重大疾病診斷與治療、環(huán)境、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，具有巨大的社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)效益.

DNA合成儀是設(shè)計(jì)用于合成結(jié)構(gòu)上類似DNA的寡核苷酸的自動(dòng)化儀器，目前高通量DNA合成廣泛采用固相亞磷酸酰胺法合成，它以多孔玻璃為固相載體，微升級(jí)體積的不同試劑經(jīng)脫保護(hù)、偶聯(lián)、帶帽和氧化四步反應(yīng)循環(huán)，將核苷酸單體耦合到核苷酸酸鏈上[2-5].該方法具有偶聯(lián)效率高、起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可用于固相合成并實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化.

DNA合成儀是實(shí)現(xiàn)DNA合成過(guò)程自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)手段.目前國(guó)內(nèi)進(jìn)行批量合成使用的多通道DNA合成儀均以少于96通道合成為主，產(chǎn)品更新?lián)Q代慢，且尚未有國(guó)產(chǎn)多通道高通量DNA合成儀問(wèn)世[6].中國(guó)是世界自動(dòng)化分析檢測(cè)儀器最重要的市場(chǎng)之一，對(duì)于高通量多通道的DNA合成儀還大量依賴進(jìn)口，而進(jìn)口DNA合成儀價(jià)格昂貴、維護(hù)成本高、維修周期長(zhǎng).進(jìn)口儀器合成過(guò)程繁雜，對(duì)于非專業(yè)的操作人員很難在短時(shí)間內(nèi)配置好所需參數(shù)，用戶無(wú)法根據(jù)需求靈活設(shè)置.為此，本文設(shè)計(jì)了一款操作界面簡(jiǎn)單靈活，人性化的多通道高通量DNA合成儀，該合成儀可以在96孔反應(yīng)板的每一孔獨(dú)立實(shí)現(xiàn)寡核苷酸長(zhǎng)鏈的合成.

1 系統(tǒng)總體設(shè)計(jì)

DNA合成儀主要由軟件系統(tǒng)、STM32中央控制器、傳動(dòng)系統(tǒng)、氣路系統(tǒng)、液路系統(tǒng)五大部分組成.STM32中央控制器它是連接傳動(dòng)系統(tǒng)、氣路系統(tǒng)、液路系統(tǒng)之間的橋梁，負(fù)責(zé)傳動(dòng)系統(tǒng)在指定位置完成相應(yīng)的動(dòng)作，控制氣路、液路的加壓排液和保證合成反應(yīng)所需的氣壓和環(huán)境，將反饋信息通過(guò)特定的通信協(xié)議傳送給控制軟件，接收控制軟件的命令并執(zhí)行；傳動(dòng)系統(tǒng)負(fù)責(zé)把電磁閥板傳送到與合成版孔的相對(duì)位置；氣路系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)試劑瓶、堿基瓶精確壓力控制，氣路整體的加壓排液控制，合成反應(yīng)惰性環(huán)境的控制，各路電磁閥板加液時(shí)試劑所需壓強(qiáng)和不合成時(shí)對(duì)廢液及洗滌液的壓力控制等；液路系統(tǒng)的主要功能是把參與合成反應(yīng)的10種試劑分別一分為8路液體輸出管路；軟件系統(tǒng)是DNA合成儀的核心，是決定其合成效率、合成效果的關(guān)鍵因素，基于labview開(kāi)發(fā)的控制軟件完成用戶對(duì)合成板指定板孔的選擇、對(duì)指定板孔的合成序列的輸入,輸入堿基序列參數(shù)解析后通過(guò)RS485通訊協(xié)議把相關(guān)電磁閥開(kāi)關(guān)指令信息分步驟傳送給STM32控制系統(tǒng).其系統(tǒng)整體框圖如圖1所示.

圖1 系統(tǒng)整體框圖Fig.1 Overall system block diagram

2 控制系統(tǒng)設(shè)計(jì)

2.1 氣路控制系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

DNA合成儀合成試劑需要保持內(nèi)外氣體隔絕且需要在一定壓強(qiáng)下才能達(dá)到更高的耦合率，因此氣路系統(tǒng)整體的密閉性、對(duì)氣壓控制優(yōu)劣性直接決定所需合成引物的合成效率.氣路系統(tǒng)設(shè)計(jì)主要包括合成試劑瓶精確壓力控制、合成反應(yīng)倉(cāng)惰性環(huán)境控制、各分流氣路的加壓排液控制、對(duì)洗滌液和廢液外排氣路控制等.合成反應(yīng)試劑通過(guò)多級(jí)氣壓計(jì)和壓力開(kāi)關(guān)的檢測(cè)，與多路高精度的微流體調(diào)壓閥相結(jié)合，保證了各氣路壓強(qiáng)穩(wěn)定在微小的波動(dòng)范圍內(nèi).在合成反應(yīng)倉(cāng)處我們配備了加壓和減壓的氣壓閥，保證合成所需壓強(qiáng)環(huán)境，當(dāng)合成完畢，反應(yīng)倉(cāng)先排氣降壓再排液.其氣路系統(tǒng)設(shè)計(jì)如圖2所示.

2.2 液路控制系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

固相亞磷酸酰胺法是目前最常用的DNA固相合成方法，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物穩(wěn)定等特點(diǎn)[3].該方法主要步驟是脫保護(hù)基、縮合反應(yīng)、帶帽反應(yīng)、氧化反應(yīng)，四個(gè)步驟循環(huán)完成DNA鏈的合成.該合成策略也是本文DNA合成儀設(shè)計(jì)的主要依據(jù)之一.在合成過(guò)程中會(huì)涉及到十種試劑(試劑1，試劑2，試劑3，試劑4，試劑A,試劑T,試劑G，試劑C,試劑5，試劑6)參與反應(yīng)，試劑的添加次序依次是：試劑1-4-所需堿基(A、T、G、C)-5-6.我們將每種試劑一分為8路，對(duì)應(yīng)96反應(yīng)孔板的8行，每一路連接一個(gè)電磁閥，這樣10種試劑被分成8×10路，由8×10個(gè)電磁閥組成了液路系統(tǒng).8×10電磁閥組中每個(gè)電磁閥開(kāi)關(guān)都是獨(dú)立的，由控制器根據(jù)合成需要打開(kāi)相應(yīng)的電磁閥開(kāi)關(guān).本液路控制系統(tǒng)選用了密封型好、無(wú)內(nèi)部容積結(jié)構(gòu)、耐腐蝕的隔膜電磁閥為控制載體來(lái)保證每一路的液體流量的均一性.設(shè)計(jì)原理如圖3所示.

圖2 氣路系統(tǒng)設(shè)計(jì)Fig.2 Gas path system design

圖3 液路系統(tǒng)設(shè)計(jì)Fig.3 Fluid system design

2.3 傳動(dòng)控制系統(tǒng)設(shè)計(jì)

合成DNA時(shí)，裝有10種合成試劑的8×10的電磁閥板在8×12的合成孔板上方來(lái)回運(yùn)動(dòng)，完成每個(gè)版孔的試劑添加.電磁閥板有10列，合成孔板有12列，電磁閥板從第一列與合成板孔第一列對(duì)齊，到電磁閥板第十列完全走出合成孔板需要22步，因此我們把步進(jìn)電機(jī)運(yùn)動(dòng)22步規(guī)定為一趟，而來(lái)回的趟數(shù)由用戶輸入的最長(zhǎng)的堿基序列數(shù)決定.每一列的8路試劑出液口和96合成孔板具體某一列相對(duì)位置的定位精度是決定傳動(dòng)系統(tǒng)是否滿足要求的最重要衡量標(biāo)準(zhǔn)，為提高傳動(dòng)系統(tǒng)重復(fù)運(yùn)動(dòng)定位精度，我們?cè)趥鲃?dòng)系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)的起點(diǎn)和終點(diǎn)處都設(shè)定了重復(fù)定位精度達(dá)到0.1mm光電傳感器，并設(shè)計(jì)了減少電機(jī)負(fù)載，每次合成前重新校準(zhǔn)原點(diǎn)位置等步驟.首先，傳動(dòng)系統(tǒng)啟動(dòng)前，氣路系統(tǒng)會(huì)在傳動(dòng)系統(tǒng)兩端進(jìn)氣口加壓，一來(lái)趕走傳動(dòng)系統(tǒng)內(nèi)部的空氣，保證合成所需惰性氣體的條件；二來(lái)傳動(dòng)系統(tǒng)受氣壓反作用力處于半懸空狀態(tài)，減小電機(jī)來(lái)回運(yùn)動(dòng)時(shí)的阻力.然后，步進(jìn)電機(jī)搜尋起點(diǎn)光電開(kāi)關(guān)定原點(diǎn)，待原點(diǎn)確定后，控制系統(tǒng)控制電機(jī)運(yùn)動(dòng)到第一步合成的位置，此時(shí)，電磁閥板的第一列和96孔板的第一列一上一下地對(duì)齊.第一步合成完后電機(jī)運(yùn)動(dòng)到第二步合成位置.第二步合成位置電磁閥板的第一列和96孔板的第二列、電磁閥板的第二列和96孔板的第一列一上一下地對(duì)齊.第二步合成完后電機(jī)運(yùn)動(dòng)到第三步合成位置,如此依次走完第一趟(22步)所有步數(shù)后，電機(jī)繼續(xù)向右運(yùn)動(dòng)到終點(diǎn)光電開(kāi)關(guān)位置，表示第一趟合成完成，之后再重新回到原點(diǎn)位置等待合成指令.設(shè)計(jì)原理圖如圖4所示.

圖4 傳動(dòng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)Fig.4 Transmission system design

3 軟件系統(tǒng)設(shè)計(jì)

系統(tǒng)軟件與硬件電路密切結(jié)合是實(shí)現(xiàn)儀器精確穩(wěn)定運(yùn)行的必要條件.本儀器是集機(jī)械自動(dòng)化、計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)狀態(tài)監(jiān)控和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)分析于一體的系統(tǒng)[7].要求系統(tǒng)軟件完成：用戶可以在人機(jī)界面的96孔板中任意選擇并輸入需要合成的DNA堿基序列、穩(wěn)定準(zhǔn)確執(zhí)行上位機(jī)發(fā)出的指令、實(shí)時(shí)處理收發(fā)數(shù)據(jù)、顯示下位機(jī)的運(yùn)行狀態(tài)同時(shí)將與合成進(jìn)程相關(guān)的數(shù)據(jù)回傳給上位機(jī).為此，課題組提出軟件系統(tǒng)設(shè)計(jì)方案，軟件系統(tǒng)分為上位機(jī)軟件系統(tǒng)和下位機(jī)軟件系統(tǒng).

3.1 下位機(jī)軟件系統(tǒng)設(shè)計(jì)

在主控STM32上和在步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)板TMCM-351運(yùn)行的軟件即為下位機(jī)軟件.STM32基于Keil MDK4的開(kāi)發(fā)環(huán)境采用C語(yǔ)言編譯、TMCM-351采用TMCL語(yǔ)言開(kāi)發(fā).下位機(jī)軟件根據(jù)功能可分為以下幾大模塊.

(1)參數(shù)設(shè)定.電機(jī)根據(jù)負(fù)載的情況和運(yùn)行的速度需要設(shè)定其電機(jī)的參數(shù)，在TMCM-351軟件上我們需設(shè)定傳動(dòng)系統(tǒng)步進(jìn)電機(jī)的細(xì)分參數(shù)、最大加速度、規(guī)定正負(fù)(正為右方向負(fù)為左方向)、電機(jī)來(lái)回運(yùn)行的速度等參數(shù).

(2)歸零.儀器上電開(kāi)始后，程序首先會(huì)搜索零點(diǎn)并置零.零點(diǎn)位置的確定說(shuō)明儀器處于起始狀態(tài)，零點(diǎn)的確定對(duì)后面每一步合成的位置都有決定性的作用.

(3)定位流程.DNA合成儀每一趟分為22合成步驟，每一個(gè)合成步驟都有其具體的位置信息.當(dāng)步進(jìn)電機(jī)運(yùn)行到當(dāng)前合成位置時(shí)，下位機(jī)會(huì)立刻將其位置信息反饋給上位機(jī)，然后上位機(jī)再發(fā)送當(dāng)前合成步驟電磁閥的開(kāi)關(guān)指令給下位機(jī)處理.

(4)指令處理.下位機(jī)在合成過(guò)程中會(huì)處理上位機(jī)發(fā)送的三種指令：1) 合成開(kāi)始指令，下位機(jī)收到開(kāi)始指令后會(huì)立刻控制電機(jī)運(yùn)動(dòng)到合成開(kāi)始位置并把位置信息反饋給上位機(jī)；2) 電磁閥開(kāi)關(guān)指令，步進(jìn)電機(jī)每到達(dá)一次合成位置，上位機(jī)會(huì)發(fā)送相應(yīng)的電磁閥開(kāi)關(guān)指令，主控會(huì)處理這些指令并轉(zhuǎn)換成高低電平信號(hào)控制電磁閥開(kāi)閉和時(shí)間；3) 合成結(jié)束指令，下位機(jī)收到后會(huì)控制步進(jìn)電機(jī)走到終點(diǎn)位置，表示整個(gè)DNA合成過(guò)程結(jié)束.

3.2 上位機(jī)軟件系統(tǒng)設(shè)計(jì)

上位機(jī)開(kāi)發(fā)基于LabVIEW 2015圖形化編程開(kāi)發(fā)平臺(tái)，它由前面板和程序框圖組成.前面板用來(lái)設(shè)置用戶需要合成的堿基序列和顯示合成步驟，程序框圖用于編寫和顯示程序源代碼.

上位機(jī)軟件設(shè)計(jì)主要由以下6大模塊組成：(1)板孔選擇：用戶可以對(duì)96孔板任意選定.(2)序列輸入：當(dāng)用戶完成對(duì)板孔數(shù)的選擇后，需要對(duì)每個(gè)已經(jīng)被選擇的板孔進(jìn)行合成序列輸入(合成序列由A,T,G,C組成且每條序列長(zhǎng)度不能超過(guò)30).(3)合成進(jìn)程設(shè)置：用戶完成輸入后，上位機(jī)會(huì)根據(jù)算法生成每一步的電磁閥開(kāi)關(guān)指令.同時(shí)會(huì)根據(jù)步進(jìn)電機(jī)反饋的位置信息來(lái)判斷合成進(jìn)程.(4)流程指令存儲(chǔ)：DNA合成儀是分趟數(shù)分步驟來(lái)合成想要合成的序列，因此需要把還沒(méi)執(zhí)行到的指令代碼存儲(chǔ)起來(lái).(5)串口通信、流程執(zhí)行模塊：用采用VISA串口通信的方式，上位機(jī)選擇串口實(shí)現(xiàn)與下位機(jī)連接通信，收發(fā)指令；流程的開(kāi)始、結(jié)束指令根據(jù)下位機(jī)反饋的信息來(lái)決定.(6)狀態(tài)監(jiān)測(cè)：上位機(jī)會(huì)不斷根據(jù)下位機(jī)反饋的信息來(lái)監(jiān)測(cè)下位機(jī)的運(yùn)行狀況.其上位機(jī)控制軟件界面如圖5所示.

圖5 上位機(jī)控制軟件界面Fig.5 Upper computer control software interface

上位機(jī)軟件主要實(shí)現(xiàn)以下功能：(1)串口通信功能:依據(jù)485通信協(xié)議經(jīng)由USB轉(zhuǎn)485串口與下位機(jī)進(jìn)行通信，上位機(jī)實(shí)時(shí)獲取下位機(jī)運(yùn)行狀態(tài)，同時(shí)下位機(jī)回傳與合成進(jìn)程相關(guān)的數(shù)據(jù)給上位機(jī).(2)數(shù)據(jù)處理功能：當(dāng)用戶完成堿基序列輸入步驟后，第一步：上位機(jī)會(huì)提取出所有輸入版孔的第一個(gè)堿基組成一個(gè)新的堿基序列的二維數(shù)組，新組成的二維數(shù)組每一個(gè)元素保留其所在原來(lái)輸入版孔的行和列信息.再根據(jù)下位機(jī)反饋的位置信息提取出新組成的二維數(shù)組對(duì)應(yīng)的堿基列.到達(dá)第一個(gè)位置時(shí)提取二維數(shù)組中含有第一列信息的所有元素并按照一個(gè)元素對(duì)應(yīng)固定的十步指令分步驟把開(kāi)關(guān)信息發(fā)送給下位機(jī)，到達(dá)第二個(gè)位置時(shí)提取二維數(shù)組中含有第一列信息和第二列信息的所有元素按照固定算法把開(kāi)關(guān)信息發(fā)送給下位機(jī)……依次處理完所有信息.上位機(jī)根據(jù)不同的堿基序列輸入，完成對(duì)合成序列解析，再分步驟解析出相對(duì)應(yīng)的電磁閥開(kāi)關(guān)指令并發(fā)送給下位機(jī).(3)指令的發(fā)送：電磁閥開(kāi)關(guān)指令的發(fā)送是分躺數(shù)分不同位置信息的，趟輸由用戶最長(zhǎng)堿基序列長(zhǎng)度決定，第一趟發(fā)送的是所有輸入版孔中的首個(gè)堿基的開(kāi)關(guān)信息.而每一趟又分為22步，就說(shuō)明每一趟有22個(gè)位置信息，同一堿基不同位置信息會(huì)對(duì)應(yīng)不同的開(kāi)關(guān)指令.其上位機(jī)軟件流程圖如圖6所示.

圖6 上位機(jī)軟件流程圖Fig.6 Upper computer software flow chart

4 結(jié)語(yǔ)

本文設(shè)計(jì)的DNA合成儀控制系統(tǒng)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)96 個(gè)獨(dú)立通道的寡核苷酸長(zhǎng)鏈的合成.基于LabVIEW開(kāi)發(fā)的上位機(jī)軟件功能齊備，操作界面美觀友好，數(shù)據(jù)處理和轉(zhuǎn)換方便.基于STM32開(kāi)發(fā)的下位機(jī)高效可靠，對(duì)上位機(jī)指令處理迅速準(zhǔn)確，控制電機(jī)和捕獲光電開(kāi)關(guān)觸發(fā)信號(hào)及時(shí)穩(wěn)定.由于DNA合成儀的重復(fù)工作量大，長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行后定位系統(tǒng)的精確度和每次打開(kāi)電磁閥組排出液體的均一性還需要不斷完善.

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DesignofMulti-ChannelDNASynthesizerControlSystemBasedonSTM32andLabVIEW

ZhangLi1,2,WangRao1,2

(1 College of Biomedical Engineering,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074,China;2 Testing and Instrumentation Engineering Center,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074,China)

Combining solid phase phosphoramidite method of DNA synthesis with automatic control technology, a DNA synthesizer of 96 oligonucleotides long chain is designed based on STM32. The core of DNA synthesizer is STM32F103ZET6 microcontroller, who is used for receiving and processingrecinstruction from upper computer, and controlling peripheral circuit module.Based on LabVIEW development platform, application software ofupper computer is built, which has function of synthetic sequence multichannel input,working state monitoring and real-time communication with control system. The DNA synthesizer researched in this paper can achieve composition of 96 independent channel oligonucleotides long chain at the same time. It has many advantages, such as high synthetic efficiency, friendly operation interface, and easy operation mode. The DNA synthesizer can fully satisfy requirement of base composition of small and medium-sized laboratory and community hospital.

phosphoramidite；DNA synthesizer；STM32microcontroller

2017-02-27

張 莉(1972-)，女，教授，博士，研究方向：激光物理、非線性系統(tǒng)的隨機(jī)動(dòng)力學(xué)、信號(hào)檢測(cè)與處理、光電檢測(cè)與醫(yī)療儀器相關(guān)技術(shù)研發(fā)，E-mail: Zhangli1996@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81101080)

TP273

A

1672-4321(2017)04-0078-06