高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定淡水、沉積物中的阿莫西林

時(shí)文博　李春青　陳永平　高麗娜　李連慶

摘 要：建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測(cè)定淡水、沉積物中阿莫西林含量的檢測(cè)方法。方法采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。淡水樣品通過(guò)固相萃取柱富集后洗脫，沉積物樣品通過(guò)乙腈直接提取，以0.2%甲酸/5 mmol/L醋酸銨-乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫，通過(guò)C18色譜柱進(jìn)行分離。方法的線性范圍為0.05～10 μg/L，相關(guān)系數(shù)r>0.999。淡水中阿莫西林的平均回收率為77.9%～84.8%，RSD為2.5%～5.9%。沉積物中阿莫西林的平均回收率為76.5%～82.7%，RSD為1.2%～2.7%。方法步驟簡(jiǎn)單，靈敏度高，可以用于環(huán)境淡水及沉積物中阿莫西林的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：淡水；沉積物；LC-MS/MS；阿莫西林

阿莫西林（Amoxicillin）是一種最常用的青霉素類廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素，在醫(yī)學(xué)和養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用[1]。近年來(lái)，抗生素濫用導(dǎo)致的環(huán)境污染現(xiàn)象日益嚴(yán)重，各地從河流到飲用水均有抗生素殘留檢出。環(huán)境中的抗生素污染對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量安全產(chǎn)生了直接的影響[2]，環(huán)境中的抗生素還會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，從而威脅人們的健康[3]。阿莫西林作為我國(guó)使用量最大的抗生素之一，污染風(fēng)險(xiǎn)也較高。因此，對(duì)自然環(huán)境中阿莫西林的含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)十分必要。目前，環(huán)境中阿莫西林的檢測(cè)還缺乏相關(guān)的方法，文獻(xiàn)報(bào)道的主要是動(dòng)物組織、牛奶等的阿莫西林檢測(cè)[4-5]，淡水及沉積物中阿莫西林的檢測(cè)方法還未見(jiàn)報(bào)道。本文分別建立了淡水、沉積物中阿莫西林的提取方法，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，該方法具有穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點(diǎn)，可以為阿莫西林的環(huán)境監(jiān)測(cè)工作提供技術(shù)保障。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

AB SCIEX QTRAP5500三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀；島津LC-30A高效液相色譜儀；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)；固相萃取裝置；固相萃取小柱Waters Oasis HLB（3 cc/60 mg）；阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；甲醇（CH3OH）（色譜純）；乙腈（C2H3N）（色譜純）；甲酸（CH2O2）（色譜純）；醋酸銨（C2H7NO2）（色譜純）；磷酸二氫鈉（NaH2PO4）（分析純）。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：島津Shim-pack XR-ODS（2.0 mm×75 mm ）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A：乙腈，B：5 mmol/L 醋酸銨（含0.2%甲酸）。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式：正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣：25 psi；霧化氣：50 psi；輔助加熱氣：50 psi；定性及定量離子、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）見(jiàn)表2。

1.3 樣品前處理

淡水樣品：將所采集的淡水樣品通過(guò)0.45 μm玻璃纖維濾膜進(jìn)行過(guò)濾，收集過(guò)濾液并調(diào)節(jié)其pH為4.0后置于4 ℃冰箱避光保存。固相萃取柱活化：依次使用3 mL甲醇、3 mL純水淋洗固相萃取柱對(duì)其進(jìn)行活化。準(zhǔn)確量取100 mL淡水樣品導(dǎo)入固相萃取柱，對(duì)固相萃取裝置真空度進(jìn)行調(diào)節(jié)，使流速控制不超過(guò)5 mL/min，待樣品流盡后加入3 mL純水進(jìn)行淋洗，純水流盡后加入6 mL甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液于25 mL玻璃離心管中，移至氮吹儀氮?dú)獯抵两?。加? mL 5%乙腈溶液溶解殘?jiān)?，混勻。過(guò)0.22 μm濾膜，移至進(jìn)樣瓶中準(zhǔn)備進(jìn)樣。

沉積物樣品：將所采集的濕沉積物樣品放置在通風(fēng)處風(fēng)干，避免陽(yáng)光直射。風(fēng)干后將沉積物樣品粉碎，研磨成粉末狀后放入密封廣口瓶?jī)?nèi)，置于4 ℃冰箱避光保存。準(zhǔn)確稱取5.0 g沉積物粉末于50 mL塑料離心管內(nèi)，向離心管內(nèi)加入8 mL乙腈，渦旋混勻2 min，超聲提取10 min，放入離心機(jī)10 000 r/min離心3 min，取上清液于25 mL玻璃離心管內(nèi)。再向50 mL塑料離心管內(nèi)加入8 mL乙腈，重復(fù)上述操作，合并上清液。將25 mL玻璃離心管置于氮吹儀上氮?dú)獯抵两桑尤? mL 5%乙腈溶液溶解殘?jiān)?，混勻。過(guò)0.22 μm濾膜，移至進(jìn)樣瓶中準(zhǔn)備進(jìn)樣。

阿莫西林受熱易導(dǎo)致分解，因此在氮?dú)獯蹈蛇^(guò)程應(yīng)中避免溫度過(guò)高。建議將水浴溫度調(diào)節(jié)至40 ℃以下。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜參數(shù)的確定

實(shí)驗(yàn)選擇了甲醇和乙腈分別作為流動(dòng)相有機(jī)相進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇作為有機(jī)相時(shí)色譜圖的基線噪音相較于乙腈偏高，同時(shí)色譜峰也有一定的拖尾情況，乙腈作為有機(jī)相峰形較好。

實(shí)驗(yàn)還比較了0.1%、0.2%、0.3%的甲酸以及純水作為水相對(duì)阿莫西林色譜峰的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著甲酸濃度的提高，阿莫西林離子豐度增加、峰形變差；經(jīng)過(guò)總體比較發(fā)現(xiàn)，甲酸濃度為02%時(shí)，阿莫西林的離子峰形與豐度的綜合效果最佳。根據(jù)查詢文獻(xiàn)得知[6]，在流動(dòng)相中加入一定量醋酸銨可以改善色譜峰的峰形，同時(shí)避免拖尾。因此，實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈作為有機(jī)相，以0.2%甲酸以及5 mmol/L 醋酸銨的混合溶液作為水相流動(dòng)相。采用優(yōu)化后的色譜條件和質(zhì)譜條件，阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 淡水中阿莫西林提取條件的優(yōu)化

自然界中阿莫西林含量可能比較低，為了提高檢測(cè)靈敏度，因此提取過(guò)程中需要對(duì)樣品進(jìn)行富集濃縮。本實(shí)驗(yàn)選擇的方式是通過(guò)固相萃取柱對(duì)水中的待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行富集，經(jīng)過(guò)對(duì)固相萃取柱的比較研究，選用的固相萃取柱為Waters公司的Oasis HLB（3 cc/60 mg），實(shí)驗(yàn)中水樣最終的富集倍數(shù)為100倍。

前處理過(guò)程中，為了達(dá)到最佳富集效果，使水中阿莫西林的回收率達(dá)到最高，本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步優(yōu)化了相關(guān)條件，研究了pH對(duì)阿莫西林回收率的影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)在pH 為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0六種條件下阿莫西林的回收率進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)。取待測(cè)水樣100 mL，使用硫酸溶液和氫氧化鈉溶液分別調(diào)節(jié)水樣pH為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，加入10 μg/mL阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)使用液100 μL，加標(biāo)濃度為10 ng/mL，過(guò)HLB小柱后洗脫進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。endprint

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH為4.0的條件下，阿莫西林的回收率最高。因此實(shí)驗(yàn)對(duì)保存的水樣pH進(jìn)行了調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)pH為4.0。

2.3 沉積物中阿莫西林提取劑的選擇

目前常用的阿莫西林提取劑主要有乙腈、磷酸二氫鈉溶液、乙腈水溶液。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了乙腈、0028 mol/L磷酸二氫鈉溶液、1∶1的乙腈水溶液三種提取劑的提取效果。稱取5.0g空白沉積物粉末，加入100 μL 100 ng/mL的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)使用液，進(jìn)行提取測(cè)定。測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.028 mol/L磷酸二氫鈉溶液與1∶1的乙腈水溶液由于無(wú)法直接氮?dú)獯蹈?，需要通過(guò)HLB小柱進(jìn)行萃取，造成了一定的損失，導(dǎo)致回收率較低。三種試劑乙腈作為提取劑時(shí)回收率最高，優(yōu)于磷酸二氫鈉溶液及乙腈水溶液，因此選取乙腈作為沉積物中阿莫西林的提取劑。

2.4 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度

使用外標(biāo)法定量，配制阿莫西林系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用1.2中的色譜條件及質(zhì)譜條件。以阿莫西林的色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)， 阿莫西林的質(zhì)量濃度（ μg/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性方程為Y=1.29×105X-5.71×103，如圖2所示。結(jié)果顯示阿莫西林在質(zhì)量濃度0.05～10 μg/L 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r>0.999。在方法規(guī)定的取樣體積和定容體積下，以信噪比S/N=10確定其定量下限（LOQ）分別為0.66 ng/L和0.013 μg/kg。

2.5 方法的回收率與精密度

采用加標(biāo)回收的方式對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，在空白淡水樣品中分別按5.0、10.0、20.0 ng/L 3個(gè)濃度進(jìn)行填加，在空白沉積物樣品中分別按照10、2.0、5.0 μg/kg 3個(gè)濃度進(jìn)行填加，每個(gè)濃度填加3個(gè)平行樣品，按照1.3中的方法進(jìn)行前處理后上機(jī)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果及算得的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別見(jiàn)表4、表5。

上述結(jié)果可見(jiàn)，3個(gè)濃度填加的淡水樣品中的阿莫西林的平均回收率為77.9%～84.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）的范圍為2.5%～5.9%。3個(gè)濃度填加的沉積物樣品中的阿莫西林的平均回收率為76.5%～82.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）的范圍為1.2%～2.7%。

3 結(jié)論

本文通過(guò)優(yōu)化淡水、沉積物的提取條件，色譜質(zhì)譜儀器條件，建立了自然環(huán)境中淡水水體及沉積物中阿莫西林含量的測(cè)定方法。結(jié)果表明，本方法中阿莫西林的質(zhì)量濃度在0.05～10 μg/L范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，淡水和沉積物中的定量限分別為0.66 ng/L 和0.013 μg/kg。淡水和沉積物中的空白加標(biāo)回收率均大于75%，同時(shí)RSD均小于10%，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，具有較高的可靠性，可以用于淡水、沉積物中阿莫西林含量的測(cè)定，為開(kāi)展監(jiān)測(cè)阿莫西林的藥殘工作提供了技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1]

謝愷舟，陳學(xué)森，徐東，等.高效液相色譜熒光檢測(cè)法檢測(cè)雞蛋中阿莫西林殘留[J].食品科學(xué)， 2012，33 （22） ：264-268

[2] 王萍亞，周勇，陳皚，等.高效液相色譜熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中4種四環(huán)素族藥物殘留的研究[J].計(jì)量學(xué)報(bào)，2008，29（4A）：238-241

[3] 張致一，劉軍，董杰，等.天津市市售貝類水產(chǎn)品中副溶血性弧菌污染和耐藥狀況的調(diào)查[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015，14（7） ：2413-2415

[4] 秦峰，鄭文捷，陳桂良，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中6種青霉素類藥物的殘留量[J].中國(guó)抗生素雜志，2009，34（6）：348-351

[5] 孫雷，張?bào)P，汪霞，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物源性食品中13種β-內(nèi)酰胺類藥物殘留的檢測(cè)[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2009，28（5）：576-580

[6] 孫漢文，李揮，張敬軒，等.快速高分離液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)原乳中活性β-內(nèi)酰胺酶[J].分析化學(xué)，2010，38（8）：1203-1205

（收稿日期：2017-06-14；修回日期：2017-07-19）endprint