低溫海水硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)過程及影響因素

劉洋　梁滬蓮　劉意康　閆坤朋　顧錦釗　宋志文

摘 要：多數(shù)硝化細(xì)菌的適宜溫度是28 ℃左右，低于15 ℃硝化活性會(huì)基本喪失。為解決這一問題，通過構(gòu)建低溫海水硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)裝置，在11～14 ℃、pH值7.0～7.8、溶解氧4.0～4.5 mg/L條件下，經(jīng)過150 d富集培養(yǎng)得到AOB硝化強(qiáng)度為21 mg（NH3-N）/（L·d），NOB硝化強(qiáng)度為93 mg（NO-2-N）/（L·d）的富集培養(yǎng)物。對(duì)富集培養(yǎng)物研究表明，當(dāng)溫度為15 ℃時(shí)，pH值為8.0、初始氨氮濃度為30 mg/L條件下氨氧化活性較強(qiáng)；當(dāng)溫度為15 ℃時(shí)，pH值為7.0、初始亞硝氮濃度為80 mg/L的條件下亞硝酸鹽氧化活性較強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：硝化細(xì)菌；低溫富集培養(yǎng)；pH；底物濃度

硝化細(xì)菌為化能自養(yǎng)，生長(zhǎng)緩慢，對(duì)環(huán)境因素變化敏感[1-2]。其中溫度對(duì)硝化細(xì)菌的活性影響較為明顯，多數(shù)硝化細(xì)菌的適宜溫度為28 ℃左右，當(dāng)溫度低于15 ℃時(shí)硝化作用急劇下降甚至停止[3]。在冬季海水養(yǎng)殖中，多數(shù)硝化細(xì)菌無法耐受其低溫環(huán)境，活性被極大抑制，對(duì)養(yǎng)殖狀況不利[4]。自然界中耐低溫的硝化細(xì)菌數(shù)量和種類較少，因此低溫海水環(huán)境中硝化細(xì)菌的馴化和富集培養(yǎng)顯得尤為重要。

目前，對(duì)于硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)、分離純化與篩選方面的特性研究與應(yīng)用較為廣泛[5-6]，其中也不乏對(duì)低溫環(huán)境硝化細(xì)菌富集、篩選與多樣性方面的研究[7-9]，然而目前大多是針對(duì)淡水低溫環(huán)境硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)，對(duì)海水低溫條件下的應(yīng)用實(shí)踐（如工廠化冷水魚養(yǎng)殖系統(tǒng)）可能效果甚微。因此，本研究構(gòu)建一種低溫海水型硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)方法，研究了低溫海水環(huán)境中不同條件對(duì)硝化細(xì)菌活性的影響，確定其適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，同時(shí)探究了無機(jī)氮鹽去除率與底物濃度的關(guān)系，為低溫海水硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)條件的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用海沙取自冬季青島某海水浴場(chǎng)3～5 cm淺層海沙；氨氧化細(xì)菌（AOB）培養(yǎng)液由氯化銨（AR）、碳酸氫鈉（AR）、人工海水配制而成；亞硝酸鹽氧化細(xì)菌（NOB）培養(yǎng)液由亞硝酸鈉（AR）、碳酸氫鈉（AR）、人工海水配制而成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 富集培養(yǎng)方法 培養(yǎng)裝置見圖1。海沙經(jīng)適當(dāng)處理后分別加入2個(gè)燒杯，燒杯有效體積為5 L，兩燒杯內(nèi)加入海沙體積各1 L。分別向燒杯中加入事先配好的人工海水各4 L，鹽度為30‰。將燒杯置于水箱，水缸液面略低于燒杯液面，燒杯中配備攪拌和曝氣裝置。使用冷水循環(huán)機(jī)將水溫控制在11～14 ℃，使用攪拌器進(jìn)行充分混合，控制溶解氧含量在4.0～4.5 mg/L。定期加入碳酸氫鈉溶液以調(diào)節(jié)pH。初期分別向AOB和NOB燒杯中加入氯化銨和亞硝酸鈉，使培養(yǎng)基中氨氮和亞硝酸鹽氮濃度達(dá)到10 mg/L。每隔24 h檢測(cè)燒杯中氨氮和亞硝酸鹽氮濃度，當(dāng)濃度達(dá)到較低水平時(shí)分別補(bǔ)充至10 mg/L，當(dāng)硝化速率提高時(shí)，分別將培養(yǎng)基中氨氮和亞硝氮濃度提高至30 mg/L和100 mg/L。培養(yǎng)過程中每隔24 h測(cè)定氨氮和亞硝酸鹽氮濃度。

圖1 培養(yǎng)裝置示意圖

1.2.2 影響因素研究方法 試驗(yàn)通過控制溫度、DO等相同條件，選取pH與底物濃度作為環(huán)境變量以探究培養(yǎng)所得低溫AOB和NOB菌種的適宜生長(zhǎng)環(huán)境。

1.2.3 水質(zhì)監(jiān)測(cè)方法 氨氮和亞硝酸鹽氮分別采用納氏試劑分光光度法和N-（1-萘基）乙二胺光度法測(cè)定[10]；溶解氧使用哈希溶解氧儀（HACH-HQ30d）測(cè)定；pH使用哈希便攜式pH計(jì)（HACH-HQ30d）測(cè)定。

2 過程與步驟

2.1.1 菌種富集與篩選分離 菌種富集過程在1.2.1的基礎(chǔ)上進(jìn)行，當(dāng)富集培養(yǎng)物硝化強(qiáng)度達(dá)到一定水平不再升高時(shí)，將AOB和NOB培養(yǎng)基靜置2 h后分別加入一定量硅藻土材料（主要成分為SiO2，孔隙度大、吸收性強(qiáng)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、成本低廉）便于硝化細(xì)菌吸附。為篩選和純化所得菌種，加入硅藻土一段時(shí)間后需再次將培養(yǎng)基靜置沉淀并分離出海沙，然后再次向AOB和NOB培養(yǎng)基中各添加一定量硅藻土。

2.2.2 pH對(duì)硝化強(qiáng)度的影響 各取等量4份AOB和NOB培養(yǎng)液200 mL于8個(gè)500 mL搖瓶中（搖瓶經(jīng)高溫滅菌處理），在15 ℃、溶解氧45～5 mg/L、避光條件下，分別投加氯化銨和亞硝酸鈉使氨氮和亞硝酸鹽氮底物濃度為20 mg/L和40 mg/L，調(diào)節(jié)pH分別為6.5、7、7.5、8，每隔6 h檢測(cè)氨氮和亞硝酸鹽氮濃度，測(cè)定不同pH條件下氨氧化速率和亞硝酸鹽氧化速率。

2.2.3 底物濃度對(duì)降解效率的影響 各取等量4份AOB和NOB培養(yǎng)液200 mL于8個(gè)500 mL搖瓶中（搖瓶經(jīng)高溫滅菌處理），在15 ℃、溶解氧4.5～5 mg/L、pH值7～7.5、避光條件下，分別投加氯化銨使初始氨氮濃度分別為10、20、30、40 mg/L，分別投加亞硝酸鈉使亞硝酸鹽氮初始濃度分別為40、80、120、160 mg/L，每隔6 h檢測(cè)氨氮和亞硝酸鹽氮濃度，確定不同底物濃度條件下氨氧化速率和亞硝酸鹽氧化速率。

3 結(jié)果與分析

3.1 硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)過程

AOB和NOB富集培養(yǎng)過程中硝化強(qiáng)度變化見圖2、圖3，可以看出，初期海沙中AOB和NOB硝化強(qiáng)度極低，富集培養(yǎng)10 d后，AOB硝化強(qiáng)度為1.5 mg（NH3-N）/（L·d），NOB為0.5 mg（NO-2-N）/（L·d），隨后10～30 d，由于只添加無機(jī)氮鹽，培養(yǎng)基中有機(jī)物含量較低使得異養(yǎng)菌數(shù)量減少，與此同時(shí)，以無機(jī)氮鹽為主要營養(yǎng)來源的化能自養(yǎng)型AOB和NOB得以迅速繁殖，硝化強(qiáng)度得以提高，富集培養(yǎng)30 d時(shí)AOB為4 mg（NH3-N）/（L·d），NOB為4.5 mg（NO-2-N）/（L·d）。富集培養(yǎng)30～60 d時(shí) ，由于海沙晶粒表面光滑少孔，對(duì)AOB和NOB的吸附能力有限，硝化細(xì)菌沒有足夠的附著場(chǎng)所進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖和正常的生理活動(dòng)，使得硝化強(qiáng)度在該段時(shí)間內(nèi)趨于平緩。分別向AOB和NOB培養(yǎng)容器內(nèi)各添加200 g硅藻土，由于硅藻土疏松多孔、比表面積大的特質(zhì)使得游離的硝化細(xì)菌得以附著，硝化強(qiáng)度在60～90 d這段時(shí)間內(nèi)有了明顯升高，硝化強(qiáng)度AOB由5 mg（NH3-N）/（L·d）升高至13 mg（NH3-N）/（L·d），NOB由12 mg（NO-2-N）/（L·d）升高至39 mg（NO-2-N）/（L·d）。為分離純化培養(yǎng)的硝化細(xì)菌，停止攪拌和曝氣，將培養(yǎng)基靜置一段時(shí)間后取走最初放入的海沙，此時(shí)，由于帶走一部分海沙上附著的硝化細(xì)菌使得原先的硝化強(qiáng)度有了一定程度的減弱。AOB硝化強(qiáng)度在培養(yǎng)120 d時(shí)降至9 mg（NH3-N）/（L·d），NOB在培養(yǎng)110 d時(shí)降至29 mg（NO-2-N）/（L·d）。隨后再次向培養(yǎng)容器中分別添加硅藻土200 g，硝化強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，AOB為21 mg（NH3-N）/（L·d），NOB為93 mg（NO-2-N）/（L·d）。經(jīng)過150 d低溫馴化后AOB平均硝化強(qiáng)度由1.5 mg（NH3-N）/（L·d）提升至21 mg（NH3-N）/（L·d），為培養(yǎng)初期的14倍，NOB平均硝化強(qiáng)度由0.5 mg（NO-2-N）/（L·d）提升至93 mg（NO-2-N）/（L·d），為培養(yǎng)初期的186倍。endprint

圖2 AOB富集培養(yǎng)過程中硝化強(qiáng)度變化

圖3 NOB富集培養(yǎng)過程中硝化強(qiáng)度變化

3.2 pH對(duì)細(xì)菌硝化強(qiáng)度的影響

3.2.1 pH對(duì)AOB硝化強(qiáng)度的影響 pH對(duì)AOB的氨氮降解效果影響見圖4。由圖可以看出，對(duì)于AOB在pH為7.5到8.0范圍內(nèi)氨氮降解速率高于pH在6.5到7.0之間，且當(dāng)pH為8.0時(shí)氨氧化活性最高，為0.677 mg（NH3-N）/（L·h）。分別為pH在6.5、7、7.5時(shí)的1.22、119和1.03倍。分析原因可能是水溶液中NH3-N與NH+4-N存在電離平衡，NH3-N是氨氧化細(xì)菌的真正硝化基質(zhì)，升高一定的pH可增加溶液中NH3-N占比從而提高基質(zhì)有效性，促進(jìn)氨氧化反應(yīng)的進(jìn)行。

圖4 pH對(duì)AOB硝化強(qiáng)度的影響

3.2.2 pH對(duì)NOB硝化強(qiáng)度的影響 pH對(duì)NOB的亞硝氮降解效果影響見圖5。由圖可以看出，對(duì)于NOB在pH為6.5到7.0范圍內(nèi)亞硝氮降解速率高于pH在7.5到8.0之間，且當(dāng)pH為7.0時(shí)亞硝酸鹽氧化活性最高，為1.33 mg（NO-2-N）/（L·h）。分別為pH在6.5、7.5、80時(shí)的1.04、1.07和1.24倍。分析原因可能是水溶液中HNO2-N與NO-2-N存在電離平衡，HNO2-N是亞硝酸鹽氧化細(xì)菌的真正硝化基質(zhì)，降低一定的pH可增加溶液中HNO2-N占比從而提高基質(zhì)有效性，促進(jìn)亞硝酸鹽氧化反應(yīng)的進(jìn)行。

圖5 pH對(duì)NOB硝化強(qiáng)度的影響

3.3 底物濃度對(duì)降解效果的影響

3.3.1 底物濃度對(duì)AOB氨氮去除效果的影響 試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表可知，AOB富集培養(yǎng)物對(duì)于低濃度氨氮廢水（10 mg/L和20 mg/L）去除效果較好，處理36 h后氨氮去除率達(dá)90%以上，而對(duì)較高濃度氨氮廢水（30 mg/L和40 mg/L）去除效果較差。AOB對(duì)氨氮轉(zhuǎn)化速率隨底物濃度先升后降，在30 mg/L時(shí)速率達(dá)到峰值，為0.93 mg（NH3-N）/（L·h），是其余底物濃度轉(zhuǎn)化速率的2.16、1.35和1.98倍。轉(zhuǎn)化速率達(dá)到峰值后若底物濃度繼續(xù)增加，速率下降程度明顯，導(dǎo)致去除效果減弱。分析原因?yàn)?，底物濃度過高產(chǎn)生的抑制作用和溶解氧條件的限制都會(huì)對(duì)AOB的生理活性造成負(fù)面影響，導(dǎo)致氨氮轉(zhuǎn)化速率下降，降解效果減弱。

3.3.2 底物濃度對(duì)NOB亞硝氮去除效果的影響 試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表可知，NOB富集培養(yǎng)物對(duì)于低濃度氨氮廢水（40 mg/L和80 mg/L）去除效果較好，處理24 h后亞硝氮去除率達(dá)90%以上，而對(duì)較高濃度氨氮廢水（80 mg/L和120 mg/L）去除效果較差。NOB對(duì)亞硝氮轉(zhuǎn)化速率隨底物濃度先升后降，在80 mg/L時(shí)速率達(dá)到峰值，為5.5 mg（NO-2-N）/（L·h），是其余底物濃度轉(zhuǎn)化速率的1.51、1.86和2.78倍。轉(zhuǎn)化速率達(dá)到峰值后若底物濃度繼續(xù)增加，速率下降程度明顯，導(dǎo)致去除效果減弱。分析原因與氨氮同理，底物濃度過高產(chǎn)生的抑制作用和溶解氧條件的限制都會(huì)對(duì)NOB的生理活性造成負(fù)面影響，導(dǎo)致氨氮轉(zhuǎn)化速率下降，降解效果減弱，且底物抑制對(duì)轉(zhuǎn)化速率影響程度更大。

3.3.3 無機(jī)氮濃度對(duì)硝化強(qiáng)度的影響 在底物濃度試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)氨氮和亞硝氮濃度對(duì)AOB和NOB的硝化強(qiáng)度具有一定影響，結(jié)果見圖6、圖7。由圖可知，隨著無機(jī)氮鹽濃度增大，AOB和NOB對(duì)氨氮和亞硝氮的降解速率均呈現(xiàn)先增大后減小的規(guī)律。分析原因，一方面當(dāng)無機(jī)氮鹽濃度較低時(shí)，由于缺乏營養(yǎng)和能量來源，AOB和NOB的生長(zhǎng)和活性受到抑制，導(dǎo)致硝化強(qiáng)度較弱；另一方面，隨著無機(jī)氮鹽濃度的升高，AOB和NOB獲得足夠的營養(yǎng)來源，硝化強(qiáng)度隨之增強(qiáng)。但當(dāng)氨氮濃度超過30 mg/L、亞硝氮濃度超過80 mg/L時(shí)，由于底物對(duì)AOB和NOB活性的抑制使得硝化作用減弱，硝化強(qiáng)度隨之降低。由此可得，當(dāng)氨氮和亞硝氮濃度分別達(dá)到30 mg/L和80 mg/L時(shí)可使AOB和NOB硝化強(qiáng)度達(dá)到較高水平，為完善富集培養(yǎng)條件和獲得更高效的硝化細(xì)菌提供了理論依據(jù)。

圖6 不同氨氮濃度下AOB硝化強(qiáng)度變化規(guī)律

圖7 不同亞硝氮濃度下NOB硝化強(qiáng)度變化規(guī)律

4 結(jié)論

經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間低溫馴化，AOB平均硝化強(qiáng)度由1.5 mg（NH3-N）/（L·d）提升至21 mg（NH3-N）/（L·d），NOB平均硝化強(qiáng)度由0.5 mg（NO-2-N）/（L·d）提升至93 mg（NO-2-N）/（L·d），硝化細(xì)菌在低溫環(huán)境中具有較高活性，添加人工載體（如硅藻土）可增加硝化細(xì)菌附著面積，提高了對(duì)氨氮和亞硝酸鹽氮的轉(zhuǎn)化效率。

通過控制溫度、溶解氧以及光照條件等培養(yǎng)因素發(fā)現(xiàn)，AOB在pH為8.0、氨氮初始濃度為30 mg/L時(shí)硝化強(qiáng)度最高； NOB在pH為7.0、亞硝氮濃度為80 mg/L時(shí)硝化強(qiáng)度最高。

5 討論

硝化作用是在一系列酶促反應(yīng)下進(jìn)行的，低溫不僅影響細(xì)菌細(xì)胞膜流動(dòng)性并且降低菌體內(nèi)氧化酶活性，從而影響作用效果。本研究控制恒定低溫環(huán)境，根據(jù)不同培養(yǎng)階段硝化菌作用強(qiáng)度的變化相應(yīng)增加無機(jī)氮鹽濃度以此提高菌群活性，對(duì)硝化強(qiáng)度變化進(jìn)行分析，結(jié)合條件因素對(duì)其生理活性的影響，表明培養(yǎng)所得AOB和NOB在11～14 ℃低溫環(huán)境下仍具有較高生理活性，較之前相關(guān)研究在15～18 ℃時(shí)富集培養(yǎng)所得硝化菌種更具耐低溫特性[11]，具有較高實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NOB較AOB的生長(zhǎng)具有滯后性且NOB往往晚于AOB進(jìn)行硝化作用，可能由于NOB世代周期更長(zhǎng)，對(duì)于環(huán)境因素要求較高且難以附著。有研究表明AOB繁殖一代需要6～8 h，而NOB繁殖一代需要16～18 h[12]，試驗(yàn)結(jié)果與該研究規(guī)律相似。然而NOB在適應(yīng)當(dāng)前環(huán)境，生長(zhǎng)繁殖狀態(tài)穩(wěn)定后，其對(duì)亞硝酸鹽降解效果明顯高于AOB對(duì)氨的降解效果，具體原因需要進(jìn)行更深層次方面的研究。研究pH對(duì)培養(yǎng)所得低溫硝化細(xì)菌活性的影響，表明AOB較NOB適宜在更高pH環(huán)境中生長(zhǎng)，分析原因可能為NOB對(duì)硝化反應(yīng)中間產(chǎn)物對(duì)其生長(zhǎng)環(huán)境適應(yīng)性的改變以及NOB本身生理活動(dòng)狀態(tài)有關(guān)。此特征與楊紅艷[13]報(bào)道的AOB和NOB在不同pH生長(zhǎng)條件的適應(yīng)性相似（AOB適應(yīng)pH范圍7.0～8.5，NOB適應(yīng)pH范圍6.5～7.5）。底物濃度對(duì)微生物活性的影響主要表現(xiàn)在對(duì)其酶促反應(yīng)進(jìn)程的正負(fù)相關(guān)性的影響，從研究結(jié)果可以看出，在底物濃度很低時(shí)，硝化反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而加快，兩者呈正比關(guān)系。隨著底物濃度的升高，反應(yīng)速度不再呈正比例加快，反應(yīng)速度增加的幅度不斷下降。在氨氮和亞硝氮濃度分別達(dá)到30 mg/L和80 mg/L時(shí)，AOB和NOB硝化強(qiáng)度達(dá)到峰值，如果繼續(xù)加大底物濃度，反應(yīng)速度不增反降，此時(shí)過高的底物濃度對(duì)硝化細(xì)菌作用產(chǎn)生抑制，說明硝化菌體內(nèi)的氧化酶已被底物所飽和[14]，由此可知對(duì)于高濃度無機(jī)氮廢水導(dǎo)致硝化菌作用強(qiáng)度的減弱與處理耗時(shí)的增加同樣降低該環(huán)境下的去除率和降解效果。endprint

目前對(duì)低溫硝化細(xì)菌研究中的菌種大多來自冬季污水處理廠回流污泥，污泥中微生物數(shù)量和種類龐雜，有機(jī)物含量高，可能會(huì)對(duì)硝化菌的分離提純和培養(yǎng)產(chǎn)生一定影響。本研究中硝化菌種來自冬季海洋環(huán)境，有機(jī)物含量少，培養(yǎng)過程中異養(yǎng)菌對(duì)硝化菌生長(zhǎng)的抑制作用較小，具有一定先天環(huán)境條件優(yōu)勢(shì)，培養(yǎng)得到的硝化細(xì)菌具有較好的低溫耐受特性和較高的硝化性能。然而本研究培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，如何短時(shí)間內(nèi)獲得高效耐低溫硝化菌種也將成為后續(xù)研究工作的重點(diǎn)方向。

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