STGC3基因啟動子生物信息學(xué)分析及載體構(gòu)建

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(1.南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院2013級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)；4.湖北省大冶市人民醫(yī)院病理科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

STGC3基因啟動子生物信息學(xué)分析及載體構(gòu)建

李素云1,2，李佳3，王莉莉4，鐘嘉宏3，陳青3，熊文芳3,曾小微3,賀修勝1*

(1.南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院2013級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)；4.湖北省大冶市人民醫(yī)院病理科)

目的運用生物信息學(xué)預(yù)測并分析鼻咽癌抑癌基因STGC3啟動子，構(gòu)建雙熒光素酶報告基因表達載體。方法采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測STGC3基因5′端上游調(diào)控區(qū)5 000 bp序列進行啟動子預(yù)測與分析，克隆最有可能的啟動子，構(gòu)建螢火蟲熒光素酶雙報告基因重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)MluⅠ和BglⅡ限制性內(nèi)切酶酶切及測序鑒定。

結(jié)果STGC3基因5′端上游-3 046 bp至-46 bp區(qū)域內(nèi)有啟動子活性，在-2 992 bp至-69 bp間啟動子分值達0.8以上，其中-845 bp至-795 bp間分值最高，達到1.0。在-1 140 bp和-774 bp處檢測到GC盒信號；在-441 bp處檢測到CAAT盒信號。在-1 805 bp至-1 705 bp和-900 bp至-684 bp間各有一個CpG島；在-2 348 bp和-948 bp處各有一個轉(zhuǎn)錄起始位點。經(jīng)不同長度的片段缺失比對，取最有可能的283 bp(-1 360 bp至-1 077 bp)、281 bp(-934 bp至-653 bp)和571 bp(-500 bp至+72 bp)啟動子片段構(gòu)建pGL3-en283、pGL3-en281及pGL3-en571三種質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)酶切測序，酶切片段大小一致，序列正確。結(jié)論根據(jù)生物物信息學(xué)分析結(jié)果，成功構(gòu)建STGC3基因啟動子螢火蟲熒光素酶報告基因表達載體，為雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)研究該基因啟動子活性提供前期基礎(chǔ)。

鼻咽癌； 生物信息學(xué)； STGC3基因； 啟動子

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，起源于人體鼻咽部黏膜上皮，其原發(fā)部位隱匿，難以早期發(fā)現(xiàn)，惡性度高，且轉(zhuǎn)移早；鼻咽癌發(fā)病常見于東南亞地區(qū)及我國南方多省，其發(fā)病具有種族特異性與地域集聚性，鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展常常涉及到癌基因和/或抑癌基因[1-8]。STGC3基因是課題組前期克隆并分析所得的鼻咽癌抑瘤基因，在GenBank中，基因登錄號為AY078383。啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游區(qū)域的DNA序列，也是RNA聚合酶結(jié)合的部位，是基因轉(zhuǎn)錄起始中最重要的結(jié)構(gòu)[9]。本研究利用生物信息學(xué)預(yù)測、分析并克隆STGC3基因啟動子，以期為該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件研究奠定前期基礎(chǔ)，為其抑瘤作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒與試劑熒火蟲熒光素酶報告基因載體pGL3 Enhance購于Promega公司。E.coli.J M 109為中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所提供。DNA抽提試劑盒購于大連Takara公司，pfu高保真DNA聚合酶購自Fermentas公司，DNA Marker DL2000為廣州美津生物公司，限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶購于NEB公司，膠回收試劑盒購于杭州四季青生物工程有限公司，酵母粉及胰蛋白胨購于Oxoid公司，瓊脂、瓊脂糖購于上海生工公司，甘油購于長沙艾杰生物技術(shù)公司。

1.2引物設(shè)計與合成在NCBI數(shù)據(jù)庫中，查找STGC3基因gDNA序列，采用生物信息學(xué)預(yù)測分析得到啟動子區(qū)，Primer5.0軟件行引物設(shè)計，DNASTAR軟件行酶譜分析，在上游和下游引物5′端分別引入MluⅠ和BglⅡ限制性內(nèi)切酶酶切位點和保護堿基，交上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1PCR引物序列與產(chǎn)物長度

GenePrimerSequenceProductSize(bp)PGL3?en283sense：cgacgcgtTTAGCTGGACATGGTGGCGTantisense：gaagatctATCTCTGTCCCAAAGTGACA283PGL3?en281sense：cgacgcgtCCTGAGCGACAGAGTGAGantisense：gaagatctCGAGTAGCTGGGACAACA281PGL3?en571sense：cgacgcgtCCTGTAATCCCAGCACTTantisense：gaagatctCTCCTCCATAATGAGACTTT571

1.3分析軟件

1.3.1 基因結(jié)構(gòu)分析(NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank

1.3.2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)啟動子預(yù)測分析(NNPP) http://www.fruitfly.org/seqtools/promoter.html.

1.3.3 轉(zhuǎn)錄起始位點及啟動子預(yù)測分析(Promoter 2.0) http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter

1.3.4 CpG島預(yù)測分析(MethPrimer、Cpgplot) http://www.urogene.org/methprimer;http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot

1.4 STGC3基因啟動子質(zhì)粒的構(gòu)建提取人外周血中的DNA，以此為模板，采用pfu高保真DNA聚合酶擴增相應(yīng)的DNA片段。PCR條件為95 ℃預(yù)變性3 min后循環(huán)，95 ℃變性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，32個循環(huán)后于72 ℃終延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物。MluⅠ和BglⅡ內(nèi)切酶雙酶切PCR產(chǎn)物及載體pGL3 Enhance，膠回收純化，將PCR產(chǎn)物與載體大片段進行連接反應(yīng)，得到的質(zhì)粒分別命名為pGL3-en283、pGL3-en281及pGL3-en571。重組質(zhì)粒經(jīng)MluⅠ和BglⅡ雙酶切及測序進行鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 STGC3基因定位分析在線軟件NCBI對STGC3基因結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果顯示STGC3基因在GenBank數(shù)據(jù)庫中位于ContigsNT-022517.18上，染色體位于chr3:49,297,518--49,298,749(GRCh37)區(qū)域，基因全長為1 232 bp。

2.2 STGC3基因啟動子分析在NCBI數(shù)據(jù)庫中，對STGC3基因進行序列比對分析，找出STGC3基因5′端上游5 000 bp序列及基因序列，預(yù)測STGC3基因啟動子。并對STGC3基因啟動子、外顯子及內(nèi)含子序列分析，結(jié)果顯示STGC3基因cDNA全長1 271 bp，其開放閱讀框(ORF)441 bp，為單外顯子基因，其中5′端上游3 000 bp序列(chr3:49,295,000-49,298,000)為啟動子活躍區(qū)。即以STGC3基因轉(zhuǎn)錄起始密碼子(ATG)的第一個堿基A作為+1，啟動子活躍區(qū)在-3 046 bp至-46 bp長3 000 bp)區(qū)。

提取-3 046 bp至-46 bp間3 000 bp序列，輸入啟動子軟件進行分析，NNPP結(jié)果顯示，在-2 992(55) bp至-69(2978)bp區(qū)啟動子分值存在0.8以上序列，其中在-1 360(1 687)bp至-1 048(1 999)bp區(qū)含有分值為0.91，即-1 213 bp(1 834 bp)至-1 163 bp(1 884 bp)的啟動子片段，在-1 048(1 999)bp至-653(2 394)bp區(qū)含有分值為1.0即-845(2 203)bp至-795(2 253)bp啟動子片段；在-541(2 506)bp+72bp區(qū)含有分值為0.97即-541(2 507)bp至-491(2 557)bp啟動子片段。(圖1)。

Promoter2.0結(jié)果顯示，STGC3基因起始密碼子上游-3 046 bp至-46 bp區(qū)有 兩個轉(zhuǎn)錄起始位點，分別位于-2 348 bp(700 bp)處和-948 bp(2 100 bp)處(圖2)。在-1 140(1 907)bp至-774(2 273)bp處有GC盒，在-441(2 606)bp處有CAAT盒。

NNPP分析結(jié)果：

圖1 STGC3基因啟動子分析結(jié)果

圖2 STGC3基因轉(zhuǎn)錄起始位點分析結(jié)果

2.3 STGC3基因5′端CpG島分析MethPrimer分析比對結(jié)果顯示，STGC3基因chr3:49,295,000-49,298,000區(qū)3 000 bp的序列中，該區(qū)域有兩個CpG島：在-1 805(1 242)bp至-1 705(1 342)bp處有一個CpG島，長101 bp；在-900(2 147) bp至-684(2 363) bp處有另一個CpG島，長217 bp(圖3)。Cpgplot分析比對結(jié)果顯示，該區(qū)域只存在一個CpG島(圖4)：在-900(2 147)bp至-684(2 363)bp處，長217 bp。

兩個不同的在線軟件程序分析結(jié)果不同，但二者在-900(2 147) bp至-684(2 363)bp處有一個共同CpG島區(qū)域。且此區(qū)包含動子分值1.0的區(qū)域，說明該區(qū)域可能是STGC3基因的啟動子。

圖3 MethPrimer分析CpG島圖

2.4 STGC3基因啟動子區(qū)生物信息學(xué)綜合分析

根據(jù)生物信息學(xué)綜合分析，結(jié)果顯示，STGC3基因預(yù)測所得的啟動子活性區(qū)為-3 046 bp至-46 bp，其中-1 360 bp至-1 048 bp區(qū)域包含啟動子預(yù)測分值為0.91的片段和GC盒；-1 048 bp至-653 bp區(qū)域含有啟動子預(yù)測分值1.0的片段、轉(zhuǎn)錄起始位點、CPG島、GC盒，此區(qū)域有可能是STGC3基因啟動子核心區(qū)；-541 bp至+72 bp區(qū)域含有啟動子預(yù)測分值0.97的片段和CAAT盒，做示意圖以明確STGC3基因啟動子的基本結(jié)構(gòu)(圖5)。對啟動子區(qū)不同長度缺失分析，最后取最有可能的啟動子片段283 bp(-1 360 bp至-1 077 bp)、281bp(-934 bp至-653 bp)、571 bp(-500 bp至+72 bp)片段進行目的片段重組質(zhì)粒構(gòu)建(圖6)。

圖4 Cpgplot分析CpG島圖

圖5 STGC3基因啟動子區(qū)示意圖

圖6 STGC3基因啟動子區(qū)不同片段載體構(gòu)建區(qū)域示意圖

2.5 STGC3基因啟動子區(qū)目的片段重組載體構(gòu)建結(jié)果

2.5.1 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定 利用高保真Pfu酶，以人外周血DNA作為模板，PCR擴增啟動子區(qū)片段，將擴增片段構(gòu)建至PGL3-enhance質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pGL3-en283、pGL3-en281及pGL3-en571。重組質(zhì)粒經(jīng)MluⅠ和BglⅡ限制性內(nèi)切酶酶切，酶切結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中插入的片段大小和NCBI軟件顯示結(jié)果一致，片段大小正確(圖7)。

2.5.2 重組質(zhì)粒測序鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定的陽性菌，擴大培養(yǎng)后，抽提質(zhì)粒，送Invitrogen公司進行測序，測序結(jié)果在blast中進行比對分析，測序圖如下(圖8～10，紅色箭頭之間為目的序列)，比對分析結(jié)果顯示，堿基序列正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖7 重組質(zhì)粒酶切電泳

3 討 論

鼻咽癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展涉及原癌基因和/或抑癌基因，其中抑癌基因的失活在其發(fā)生發(fā)展中起著更重要的作用。STGC3作為課題組前期克隆的抑瘤基因，其抑瘤功能取得了一定的研究進展，但有關(guān)STGC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制還不清楚。

圖8 pGL3-en283重組質(zhì)粒測序結(jié)果

圖9 pGL3-en281重組質(zhì)粒測序結(jié)果

圖10 pGL3-en571重組質(zhì)粒測序結(jié)果

具有轉(zhuǎn)錄起始特異性的啟動子是一段非編碼DNA序列，位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游，可使RNA聚合酶活化，并使RNA聚合酶準(zhǔn)確結(jié)合到DNA模板上，是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核心區(qū)域；在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，扮演著十分重要角色的真核生物啟動子，是RNA聚合酶特異性結(jié)合位點周圍的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。

本研究運用生物信息學(xué)預(yù)測啟動子，該方法是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的重要研究方法，能有效地從基因組中查找已知和末知的的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，為研究基因的結(jié)構(gòu)、功能提供可靠依據(jù)。在真核生物基因表達調(diào)控體系中，基因的轉(zhuǎn)錄起始與調(diào)控主要通過順式作用元件、反式作用因子和RNA聚合酶相互協(xié)同，共同完成。順式作用元件對基因轉(zhuǎn)錄的起始位點及轉(zhuǎn)錄效率起著決定性的作用，基因的轉(zhuǎn)錄起始常通過啟動子來實現(xiàn)[10-11]。

啟動子序列包含核心元件TATA盒、上游核心啟動子元件BRE、下游啟動子元件DPE、起始子，還包含CAAT盒及GC盒；研究表明約10-20﹪的編碼蛋白基因含特定的轉(zhuǎn)錄起始位點和TATA盒，大多數(shù)基因啟動子不含TATA盒，但有多個選擇性的啟動子區(qū)和轉(zhuǎn)錄起始位點，約72﹪的基因啟動子區(qū)含CpG島，CpG島是一段約200 bp或更長的DNA序列，其G+C含量較高，且CpG島占G+C含量達50%以上，許多脊椎動物的啟動子區(qū)都與CpG島的位置重合[12-15]。啟動子的這些特征是研究工作者利用生物信息學(xué)方法研究啟動子的重要信息。因此，本研究在NCBI數(shù)據(jù)庫對STGC3基因結(jié)構(gòu)定位分析，對STGC3基因5′端上游5000bp序列進行分析，在軟件中，查找該基因的啟動子、內(nèi)含子及外顯子，發(fā)現(xiàn)該基因啟動子區(qū)和核心啟動子區(qū)。利用Promoter 2.0軟件預(yù)測該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點，通過MethPrimer與Cpgplot軟件預(yù)測，發(fā)現(xiàn)CpG島，此外，同時對該3 000 bp序列進行分析，發(fā)現(xiàn)STGC3基因無TATA盒，但有GC盒信號，也有CAAT盒信號，經(jīng)預(yù)測打分得到啟動子及核心啟動子區(qū)。

本研究將STGC3基因生物信息學(xué)分析得到的結(jié)果，根據(jù)基因啟動子的分析，克隆并構(gòu)建不同啟動子片段報告基因載體，為進一步研究STGC3基因啟動活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，探討基因表達調(diào)控機制提供實驗依據(jù)。

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BioinformaticsanalysisofsTGC3genepromoterandconstructionofdualluciferasereportgeneexpressionVector

LI Suyun,LI Jia,WANG Lili,et al

(CancerResearchInstitute,UniversityofSouthChina，Hengyang421001，Hunan,China)

ObjectiveUsing bioinformatics to predict and analyse the promoter of STGC3 gene,then construct dual luciferase reporter gene expression vector for 5′ Upstream regulated elements of STGC3 gene.MethodsThe bioinformatics was used to predict and analyze the promoter region of STGC3 during gene 5′upstream 5000bp regulatory region,and then the most likely promoters were cloned.The dual-luciferase reporter gene plasmids were constructed,and these recombinant plasmids were identified by the MluⅠand BglⅡ enzyme digestion and DNA sequencing.ResultsThe bioinformatics results show that there are promoter activity from -3 046 bp to-46 bp.The activity value of -2 992 bp to -69 bp is 0.8 and -845 bp to -795 bp is 1.0.There is a GC box in -1 140 bp to -774 bp and a CAAT box in -441 bp.Two CpG islands were detected in -1 805 bp to -1 705 bp and -900 bp to -684 bp.Two transcription start sites(-2 348 bp and -948 bp) were found.The most possible fragments 283bp (-1 360 bp to -1 077 bp),281bP(-934 bp to -653 bp) and 571bP(-500 bp to -72 bp) were chosen to construct plasmids pGL3-en283,pGL3-en281and pGL3-en571.These plasmids were identified by enzyme digestion and sequencing,the size of the fragment and the sequence was correct.ConclusionBased on the results of bioinformatics analysis,the successful construction of STGC3 gene dual luciferase report gene expression vector,provides a preliminary basis for the dual luciferase report gene detection system of the gene promoter activity.

nasopharyngeal carcinoma； bioinformatics； STGC3 gene； promoter

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.01.011

2016-05-21；

2016-12-19

國家自然科學(xué)基金資助項目(2011GZK46)、湖南省科技廳資助項目(2012TT2020)、湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)與創(chuàng)新性實驗資助項目(231).

*通訊作者，E-mail：hexiusheng@hotmail.com.

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蔣湘蓮)