基因芯片技術(shù)在煤工塵肺合并肺結(jié)核中的應(yīng)用價(jià)值

劉建坤 王洪武 陳剛 陳東進(jìn) 鄒珩 張潔莉 周云芝 張楠

?

基因芯片技術(shù)在煤工塵肺合并肺結(jié)核中的應(yīng)用價(jià)值

劉建坤1王洪武1陳剛2陳東進(jìn)3鄒珩1張潔莉1周云芝1張楠1

目的 研究基因芯片技術(shù)在煤工塵肺合并結(jié)核診斷中的應(yīng)用。方法 所有病人均留取合格痰液，通過基因芯片技術(shù)做分枝桿菌菌種鑒定，如為結(jié)核分枝桿菌，則做耐藥基因檢測(cè)。結(jié)果 結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性病人共15人，陽(yáng)性率為60%，非結(jié)核分枝桿菌病人共10人，陽(yáng)性率為40%，結(jié)核分枝桿菌中有1例對(duì)異煙肼耐藥，耐藥率為6.7%。在10例非結(jié)核分枝桿菌中，胞內(nèi)分枝桿菌6例，占60%，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群1例，占10%，龜膿或膿腫分枝桿菌1例，占10%。結(jié)論 胞內(nèi)分枝桿菌為非結(jié)核分枝桿菌主要致病菌種；基因芯片技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，可準(zhǔn)確區(qū)分結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌，并可鑒定至種或群，可做耐藥監(jiān)測(cè)，可為臨床診斷、治療提供有力的支持。

煤工塵肺；肺結(jié)核；基因芯片

資料與方法

一、一般資料

共入選了既往曾接受或正在接受正規(guī)抗結(jié)核治療的煤工塵肺病人116人為研究對(duì)象，年齡41歲至90歲之間，平均70.1歲，均為男性病人。所有病人晨起留取合格痰液通過基因芯片技術(shù)做分枝桿菌菌種鑒定，如為結(jié)核分枝桿菌，則做結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)。

二、煤工塵肺的診斷標(biāo)準(zhǔn)

1986-2002年的病人采用GB5906— 86診斷標(biāo)準(zhǔn),2002年后的病人采用GBZ70— 2002診斷標(biāo)準(zhǔn)。

三、煤工塵肺合并肺結(jié)核的入選條件

已明確診斷煤工塵肺的病人，凡符合一下條件之一者,均可入選:①既往曾行痰涂片或痰培養(yǎng)找到結(jié)核分枝桿菌者；②既往痰查結(jié)核陰性，但是有活動(dòng)性肺結(jié)核典型胸部X射線表現(xiàn)者；③既往病理學(xué)檢查，診斷為肺結(jié)核者。

四、痰樣本采集及處理

以清晨第一口痰為宜。先用清水漱口，囑患者用力咳出深部的痰液于無菌樣本保存容器1份，密封，由博奧生物有限公司技術(shù)人員通過基因芯片技術(shù)做分枝桿菌菌種鑒定，如為結(jié)核分枝桿菌，則做結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)。

五、基因芯片檢測(cè)方法：首先將痰液標(biāo)本加入1-2倍4%NaOH，振蕩混勻，15-20分鐘后加入pH 6.8磷酸緩沖液混勻，離心后去上清，沉淀再加入0.5-1ml磷酸緩沖液混勻，接種。吸取等于或大于1個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?0-20 μl于含核酸提取液的核酸提取管中，使用Extractor 36核酸快速提取儀振蕩5分鐘，95℃水浴5分鐘，5000 rpm離心1分鐘，得到核酸。然后配制PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。將雜交緩沖液于50℃加熱使其完全融化，充分混勻后，在微量離心機(jī)中瞬時(shí)離心，按9 μl/管分裝。每管加入6 μl相應(yīng)的PCR產(chǎn)物。將雜交反應(yīng)混合物加熱至95℃(置于PCR儀或水浴鍋中)變性5 分鐘。雜交反應(yīng)混合物變性完畢取出后，立即浸入冰水混合物中冰浴3分鐘。將雜交反應(yīng)混合物從冰浴中取出，用微量移液器吹吸2次混勻，待白色絮狀沉淀(如有)消失后，經(jīng)蓋片的加樣孔加入13.5 μl雜交反應(yīng)混合物，迅速蓋上雜交盒并密封。每個(gè)微陣列限加一份樣品，記錄芯片編號(hào)、微陣列位置及對(duì)應(yīng)的樣品編號(hào)。立即將密封好的雜交盒水平放入50℃預(yù)熱的恒溫水浴鍋中。待雜交盒全部放入后計(jì)時(shí)120分鐘。雜交反應(yīng)結(jié)束后，將雜交盒水平取出拆開，將芯片取出，進(jìn)行芯片洗滌。然后于離心機(jī)中800 rpm離心5分鐘，甩干后掃描。最后使用LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀和相應(yīng)軟件進(jìn)行信號(hào)的讀取及結(jié)果判讀。

結(jié) 果

共入組116人，檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌為15人，占所有陽(yáng)性人數(shù)的60%，非結(jié)核分枝桿菌共10人，占所有陽(yáng)性人數(shù)的40%，總體陽(yáng)性率為21.6%。結(jié)核耐藥情況：共做耐藥檢測(cè)15人次，其中有1人對(duì)異煙肼耐藥，其余對(duì)異煙肼及利福平均敏感，耐藥率為6.7%。(耐藥檢測(cè)結(jié)果)。

表1 基因芯片檢測(cè)分枝桿菌病原菌分布

表2 耐藥菌檢測(cè)結(jié)果

表3 基因芯片技術(shù)檢測(cè)非結(jié)核分枝桿菌病原菌情況

有2例未判，是因?yàn)榈陀跍y(cè)序靈敏度。

討 論

在臨床上，肺結(jié)核患者痰查結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性率偏低，而煤工塵肺并發(fā)肺結(jié)核的患者,痰查結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性率更低。如何能提高痰查結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性率已成為臨床亟須解決的課題之一。該研究利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)煤工塵肺合并肺結(jié)核患者，陽(yáng)性率達(dá)21.6%。這與既往的研究結(jié)果相一致。Jeda A等[2]發(fā)現(xiàn)基因芯片檢測(cè)靈敏度比PCR電泳法高10倍。該研究使用博奧生物有限公司提供的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法)，檢測(cè)靈敏度為1×103個(gè)菌/PCR反應(yīng)。這與唐曙明等[3]的研究結(jié)果相一致，提高了結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的靈敏度。

該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)非結(jié)核分枝桿菌的發(fā)病率較高，占所有陽(yáng)性人數(shù)的40%。這與既往研究成果相一致，我國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查資料顯示非結(jié)核分枝桿菌分離率2010年高達(dá)22. 9%[1]，李昕潔等[4]也發(fā)現(xiàn)在臨床上非結(jié)核分枝桿菌的分離率較高，反映出我國(guó)當(dāng)前非結(jié)核分枝桿菌感染率呈明顯上升的趨勢(shì)。

該研究結(jié)構(gòu)顯示，在現(xiàn)有的煤工塵肺合并非結(jié)核分枝桿菌感染的病人中，胞內(nèi)分枝桿菌所占比例為60%。這與Herndndez—Gardufio[5]、黃明翔等[6]的研究結(jié)果相一致。非結(jié)核分枝桿菌菌種快速、準(zhǔn)確鑒定對(duì)于臨床疾病的診斷和治療具有重要意義，美國(guó)2007年“非結(jié)核分枝桿菌病診斷、治療與預(yù)防的指南”[7]中明確指出臨床分離的非結(jié)核分枝桿菌必須鑒定到菌種水平。因此如何能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)致病性分枝桿菌做出診斷，是有效預(yù)防分枝桿菌病的發(fā)生、有效控制病情傳播的重要手段。傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法主要有涂片抗酸染色法、羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法和結(jié)核抗體金標(biāo)法，其中抗酸染色涂片法簡(jiǎn)便、快捷、價(jià)格低廉，但是敏感性低，不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌；羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法耗時(shí)(2-8周)；結(jié)核抗體金標(biāo)法則只能檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，而不能檢測(cè)非結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)。

該研究所采用的博奧生物有限公司提供的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法)則能同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌，是針對(duì)臨床常見的分枝桿菌設(shè)計(jì)特異性的PCR擴(kuò)增引物及種屬特異性寡核苷酸探針，可鑒定出被測(cè)細(xì)菌的種類。除痰液外，膿液、分泌物、肺泡灌洗液、穿刺液(包括腦脊液、胸腹水、心包液、關(guān)節(jié)液、膽汁等)、尿液等標(biāo)本均可使用該試劑盒檢測(cè)，另外該試劑盒檢測(cè)耗時(shí)短，只需6-8小時(shí)即可出結(jié)果。

隨著一線藥物的使用，耐多藥結(jié)核分枝桿菌的感染有日益增多的趨勢(shì)。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，肺結(jié)核位于傳染病死亡原因的第一位，耐藥菌株流行是結(jié)核病控制難度增加的主要原因[8-9]。耐多藥結(jié)核分枝桿菌是指患者感染的結(jié)核分枝桿菌在體外對(duì)異煙肼和利福平耐藥。煤工塵肺患者是肺結(jié)核的好發(fā)人群，全國(guó)塵肺流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果報(bào)告塵肺結(jié)核合并率為19.35%[10]。因?yàn)槊簤m對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，使大量巨噬細(xì)胞變性、壞死、崩解，加之外周血中T淋巴細(xì)胞減少，對(duì)結(jié)核分枝桿菌的吞噬、清除能力下降； 另外煤工塵肺病人晚期可出現(xiàn)肺間質(zhì)纖維化，導(dǎo)致循環(huán)血容量不足，抗結(jié)核藥物不易達(dá)到病灶部位，難以達(dá)到有效殺菌濃度，以上各種原因綜合起來導(dǎo)致耐多藥結(jié)核分枝桿菌感染率日益增高。該研究因入選病人較少，15人次中共有1例對(duì)異煙肼耐藥，陽(yáng)性率為6.7%，結(jié)果不具有代表性，但是也提示耐藥的嚴(yán)重性。

該研究所采用的博奧生物有限公司提供結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒(DNA微陣列芯片法)，該試劑盒可檢測(cè)利福平及異煙肼的3個(gè)耐藥相關(guān)基因rpoB基因、katG基因及inhA基因啟動(dòng)子的野生型及不同突變型，檢測(cè)靈敏度為1×103個(gè)菌/PCR反應(yīng)，該試劑盒檢同樣只需6-8小時(shí)即可出結(jié)果。

綜上所述，煤工塵肺病人是肺結(jié)核的高發(fā)人群，同時(shí)肺結(jié)核分枝桿菌的發(fā)病率逐年升高，在現(xiàn)有的煤工塵肺合并非結(jié)核分枝桿菌感染的病人中，胞內(nèi)分枝桿菌所占比例為60%，為人類主要的非結(jié)核分枝桿菌致病性菌種；耐藥菌株流行是結(jié)核病疫情日趨嚴(yán)重的主要原因?；蛐酒夹g(shù)用于分枝桿菌的檢測(cè)具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高等特點(diǎn)，可準(zhǔn)確區(qū)分結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌，并可鑒定至種或群，可做耐藥監(jiān)測(cè)，可為臨床診斷、治療提供有力的支持。

[1] 王宇.全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查資料匯編[M]．北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2011:26．

[2] Jeda A，Witek A，Janikowska G，et al.Expression profile of genes associated with the histamiergic system estimated by oligonucleotide microarray analysis HG-U133A in women with endometrial adenocarcinoma[J]．Ginekol Pol,2014,85(3)：172-179.

[3] 唐曙明，李愛敏，陳海霞，等.基因芯片快速鑒定分枝桿菌菌種方法的建立[J]．重慶醫(yī)學(xué)，2015，44(11)： 1516-1518.

[4] 李昕潔，譚守勇，黃業(yè)倫，等．812 株非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株流行病學(xué)特征分析[J]．中國(guó)防癆雜志，2010，32(12):811-814．

[5] Hernández-Garduo E,Elwood RK．Demographic risk factors of pulmonary colonization by non-tuberculous mycobacteia[J]．Int J Tuberc Lung Dis，2010，14(1):106-112．

[6] 黃明翔，萬康林，陳力舟，等.福建省臨床分離非結(jié)核分枝桿菌菌種分布研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2014，30(12)：1227-1230.

[7] Griffith DE，Aksamit T，Brown-Elliott BA，et al.An official ATS/IDSA Statement:diagnosis，treatment，and prevention of nontuberculous mycobacterial disease[J].Am J Respir Crit Care Med，2007，175(7)：744-745.

[8] YuCC,Chang CY,Liu CE,et al.Drug resistance pattern of mycobacterium tuberculosis complex at a medical center in central Taiwan, 2003-2007[J].J Microbiol Immunol Infect,2010,43(4)：285-290.

[9] Gumbo T.New Susceptibility Breakpoints for First-Line Antituberculosis Drugs Based on Antimicrobial Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Science and Population Pharmacokinetic Variability[J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(4)：1484-1491.

[10] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.全國(guó)塵肺流行病學(xué)調(diào)查研究資料集[M]．北京:北京醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社, 1992:25,529.

[11] Boehme CC，Nicol MP，Nabeta P，et al．Feasibility，diagnostic accuracy，and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study[J]．Lancet，2011，377(9776):1495-1505.

Diagnostic value of gene clip for coal workers’ pneumoconiosis complicated with pulmonary tuberculosis

LIUJian-kun,WANGHong-wu,CHENGang,CHENDong-jin,ZOUHeng,ZHANGJie-li,ZHOUYun-zhi,ZHANGNan

ChinaMeitanGeneralHospital,Beijing100028,China

Objective To explore the diagnostic value of gene clip for coal workers’ pneumoconiosis complicated with pulmonary tuberculosis. Methods All the patients were used to detect Mycobacterium tuberculosis by gene clip. Mycobacterium strains isolated from all the patients were identified by drug-resistant genes. Results 15 strains of Mycobaterium isolated were M.tuberculosis, accounting for 60%. 10 strains were non-tuberculosis Mycoberium, accounting for 40%. In the 15 strains of M.tuberculosis, 1 strain was resistant to isoniazid (6.7%). 6 strains were M. intracellulare of all the non-tuberculosis Mycobacterium (60%). 1 strain was M.tuberculosis complex group, accounting for 10%. 1 strain was M. chelonae (10%). 2 strains were non-tuberculosis Mycobacterium, but they couldn’t be identified. Conclusion Of all the coal workers’ pneumoconiosis complicated with non-tuberculosis Mycobacterium, the main strain is M. Intracellulare. The gene clip is simple, rapid, sensitive and specific for detecting tuberculosis. It could diagnose M.tuberculosis and non-tuberculosis Mycoberium and monitor drug resistance, which could be taken as a helpful method for diagnosis and treatment of pulmonary tuberculosis.

coal workers’ pneumoconiosis; pulmonary tuberculosis; gene clip

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.01.009

1. 100028 北京 煤炭總醫(yī)院呼吸內(nèi)科 2. 066000 河北 秦皇島 國(guó)家煤礦安全監(jiān)察局塵肺病康復(fù)中心塵肺科 3. 102300 北京 北京京煤集團(tuán)總醫(yī)院結(jié)核病科

煤工塵肺在我國(guó)已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅煤礦工人健康的一種主要職業(yè)病。煤工塵肺患者是肺結(jié)核的好發(fā)人群，但是由于煤工塵肺結(jié)核在臨床表現(xiàn)上無特異性，且非結(jié)核分枝桿菌的感染率逐年提高[1]，所以早期診斷與治療煤工塵肺結(jié)核，已經(jīng)成為延緩煤工塵肺病情進(jìn)展為一種重要手段。我們?nèi)脒x了既往曾接受或正在接受正規(guī)抗結(jié)核治療的煤工塵肺病人116人為研究對(duì)象，通過相關(guān)研究,了解基因芯片技術(shù)及其在煤工塵肺合并肺結(jié)核中的應(yīng)用價(jià)值，為制定有效的防治措施提供依據(jù)。

2016-05-19]