HPLC法同時(shí)測(cè)定白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的含量

鄺俊維，卿 萍，周子虬，鄒 輝

(湖南師范大學(xué)a.化學(xué)化工學(xué)院，b.醫(yī)學(xué)院，c.樹達(dá)學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081)

HPLC法同時(shí)測(cè)定白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的含量

鄺俊維a，卿 萍b，周子虬c*，鄒 輝b

(湖南師范大學(xué)a.化學(xué)化工學(xué)院，b.醫(yī)學(xué)院，c.樹達(dá)學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081)

本研究建立了同時(shí)測(cè)定中藥白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ含量的高效液相色譜法，結(jié)果表明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ進(jìn)樣量分別在76～760 ng，87～870 ng，75～750 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，白術(shù)甲醇超聲提取液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ平均加樣回收率分別為100.20%(RSD=1.8%)，100.10%(RSD=1.2%)，99.68%(RSD=0.84%)，白術(shù)甲醇回流提取液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ平均加樣回收率分別為100.67%(RSD=0.88%)，100.06%(RSD=0.67%)，100.67%(RSD=1.7%).該含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于白術(shù)藥材的質(zhì)量控制.超聲提取法對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ的提取效率均高于加熱回流提取法.

白術(shù)；高效液相色譜法；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ；白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ；含量測(cè)定

白術(shù)為菊科植物白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz)的干燥根莖，為2015年版《中國(guó)藥典》收錄的國(guó)標(biāo)藥材，其性味苦、甘，溫，歸脾、胃經(jīng)，主治脾虛、胎動(dòng)不安等[1].主產(chǎn)于浙江、安徽、淮北、皖南等地，為地道藥材“浙八味”之一，是藥用處方中的常用藥材，其主要活性成分為白術(shù)內(nèi)酯類成分[2-3]，此外還有苷類[4]和多糖類成分[5]；近年來，研究者從白術(shù)中發(fā)現(xiàn)了系列多炔類成分[6]，并證實(shí)其具有顯著的抗炎作用[7].研究顯示白術(shù)具有抗衰老[8]、抗腫瘤[9-10]、鎮(zhèn)痛[11]等藥理作用.

白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ是白術(shù)中含量較高的化學(xué)成分，亦是白術(shù)的特征性成分，并且藥理研究表明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ是白術(shù)的主要藥效成分[12-15]，這3種成分的含量可作為白術(shù)質(zhì)量控制的指標(biāo)成分.本文建立了可同時(shí)測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量的HPLC方法，并考察了不同提取方法對(duì)這3種成分含量的影響，為完善白術(shù)的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù).

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀(日本島津公司，配備低壓四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器、色譜工作站)；FB224自動(dòng)內(nèi)校電子分析天平(0.000 01 g，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RH-800型高速多功能粉碎機(jī)(浙江榮浩工貿(mào)有限公司)；不銹鋼沖框標(biāo)準(zhǔn)篩(孔徑250 μm,即60目，長(zhǎng)沙市思科儀器沙篩廠).

1.2 試藥

白術(shù)藥材飲片(批號(hào)16012009，購(gòu)自湖南衡岳中藥飲片有限公司)；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ對(duì)照品(自制，經(jīng)HPLC檢測(cè)，歸一法計(jì)算純度>99.0%)；甲醇(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙腈(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；純水(經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾)，其余試劑為分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ對(duì)照品于10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解，定容至10 mL，制成濃度分別為1.869，1.912，2.178 g/L的單一對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；精密吸取各單一對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL定容至25 mL，得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ濃度分別為0.149 5，0.153 0，0.174 2 g/L的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用.

2.2 供試品溶液的制備

白術(shù)飲片粉碎后過篩，取白術(shù)藥材細(xì)粉2份，各約1.0 g，精密稱定，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，精密量取2份甲醇各50 mL，分別加入上述錐形瓶中，微微振搖，稱定質(zhì)量.一份超聲60 min，另一份水浴回流60 min，待冷卻后，加甲醇補(bǔ)足溶劑揮發(fā)的量，搖勻.將提取的2份供試品溶液先用普通漏斗過濾，取續(xù)濾液分別置于50 mL錐形瓶中備用，在進(jìn)樣前用0.45 μm微孔濾膜濾過.

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱：Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫；洗脫程序：0～15 min，乙腈55%，15～30 min，乙腈55%～80%；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm(白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅲ)，276 nm(白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ)；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃.

2.4 方法可行性考察

取白術(shù)對(duì)照品溶液及供試品溶液進(jìn)行分析，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，得色譜圖(見圖1～3)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ對(duì)照品的保留時(shí)間分別為9.3，16.0，23.1 min，各成分均達(dá)到基線分離，具有較好的對(duì)稱性，分離度均大于1.5，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的理論塔板數(shù)均大于5 000.

圖1 白術(shù)內(nèi)酯對(duì)照品色譜圖(1.白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ；2.白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ；3.白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ)Fig.1 The HPLC chromatogram of reference substance (1.Atractylenolide Ⅰ; 2.Atractylenolide Ⅱ; 3. Atractylenolide Ⅲ)

圖2 超聲提取白術(shù)樣品色譜圖(1.白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ；2.白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ；3.白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ)Fig.2 The HPLC chromatogram of samples by ultrasonic extraction (1.Atractylenolide Ⅰ; 2.Atractylenolide Ⅱ; 3.Atractylenolide Ⅲ)

圖3 回流提取白術(shù)樣品色譜圖(1.白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ；2.白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ；3.白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ)Fig.3 The HPLC chromatogram of samples by reflux extraction (1.Atractylenolide Ⅰ; 2.Atractylenolide Ⅱ; 3.Atractylenolide Ⅲ)

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照儲(chǔ)備液0.5 mL加適量甲醇溶解后定容至10 mL，配制成白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ分別為7.475，7.65，8.71 mg/L的混合溶液.按既定方法在色譜系統(tǒng)中分別進(jìn)樣10，20，40，60，80，100 μL測(cè)定.以峰面積A對(duì)進(jìn)樣量X(ng)進(jìn)行線性回歸，求得各自的線性回歸方程為：白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ,Y=3 346.2X-27 657(r=0.998 7)，線性范圍為76～760 ng；白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ,Y=3 616X-48 059(r=0.999 4)，線性范圍為87～870 ng；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ,Y=3 242X+1 548(r=0.999 9)，線性范圍75～750 ng.

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

在“2.3”項(xiàng)的色譜條件下，對(duì)供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量每次20 μL，分別測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的峰面積，計(jì)算RSD分別為0.28%，0.26%，0.16%，表明儀器精密度良好.

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次的白術(shù)飲片細(xì)粉12份，每份約1.0 g，精密稱定，其中6份按超聲提取方法制成供試品溶液，6份按回流提取方法制成供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)的色譜條件色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得超聲提取供試品溶液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量的RSD分別為2.5%，2.0%，2.8%，回流提取白術(shù)供試品溶液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量的RSD分別為0.74%，2.2%，2.0%，表示該方法重復(fù)性良好.結(jié)果見表1，2.

表1 超聲提取白術(shù)供試品溶液重復(fù)性結(jié)果

表2 回流提取白術(shù)供試品溶液重復(fù)性結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別取“2.2”項(xiàng)下制備得到的兩種供試品溶液，在0，2，4，6，8，12和24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算得到超聲提取白術(shù)供試品溶液的白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ峰面積的RSD分別為1.4%，2.1%，2.4%，回流提取白術(shù)供試品溶液的白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ峰面積的RSD分別為0.76%，2.7%，2.4%，結(jié)果表明兩種供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.結(jié)果見表3，4.

表3 超聲提取白術(shù)供試品溶液穩(wěn)定性研究結(jié)果

表4 回流提取白術(shù)供試品溶液穩(wěn)定性結(jié)果

2.9 加樣回收率

取已按既定方法測(cè)定含量的白術(shù)細(xì)粉12份，每份約1.0 g，精密稱定，其中6份置于50 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對(duì)照儲(chǔ)備液2.0，2.5，3.0 mL，加甲醇至50 mL，按超聲提取方法制成供試品溶液；另6份置于250 mL圓底燒瓶中，分別精密加入混合對(duì)照儲(chǔ)備液2.0，2.5，3.0 mL，加甲醇至50 mL，按回流提取方法制成供試品溶液；按“2.3”項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)樣，分別測(cè)定兩種提取方法下3種成分的含量，計(jì)算回收率.結(jié)果超聲提取白術(shù)供試品溶液白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的平均加樣回收率分別為100.20%(RSD=1.8%)，100.10% (RSD=1.2%)，99.68% (RSD=0.84%)；回流提取白術(shù)供試品溶液白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ平均加樣回收率分別為100.06(RSD=0.88%)，100.30(RSD=0.67%)，100.67(RSD=1.7%)，結(jié)果見表5，6.

表5 超聲提取白術(shù)供試品溶液加樣回收率結(jié)果

表6 回流提取白術(shù)供試品溶液加樣回收率結(jié)果

2.10 樣品含量測(cè)定

取同一批次的白術(shù)細(xì)粉6份，其中3份按超聲提取方法制成供試品溶液，另3份按回流提取方法制成供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)樣，用峰面積外標(biāo)法計(jì)算白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量，測(cè)定結(jié)果見表7，8.

表7 超聲提取法白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量測(cè)定結(jié)果

表8 回流提取法白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ對(duì)照品在190～800 nm進(jìn)行紫外可見光譜掃描，結(jié)果顯示白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ在220 nm波長(zhǎng)有最大吸收，而白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ在276 nm有最大吸收波長(zhǎng)，故確定220 nm為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的檢測(cè)波長(zhǎng)，276 nm為白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的檢測(cè)波長(zhǎng).

3.2 研究意義

本文建立了同時(shí)測(cè)定中藥白術(shù)中3種主要活性成分的HPLC方法，為白術(shù)質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).在該方法下，分別檢測(cè)了超聲提取與加熱回流2 種提取方法下白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的含量.結(jié)果表明，超聲提取中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的含量均高于加熱回流提取，而且超聲提取較加熱回流提取具有操作簡(jiǎn)單、方便、無需特殊裝置，相對(duì)高效等優(yōu)勢(shì)，因此，本研究為選擇白術(shù)有效成分的提取方法提供了科學(xué)依據(jù).

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SimultaneousDeterminationofAtractylenolideⅠ, Ⅱ,andⅢinAtractylodesMacrocephalaKoidzwithHPLC

KUANGJun-weia,QINGPingb,ZHOUZi-qiuc*,ZOUHuib*

(a. College of Chemistry and Chemical Engineering, b. Scool of Medicine, c. Shuda College, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

In this work, a HPLC method has been established to simultaneously determine atractylenolideⅠ, Ⅱ, and Ⅲ inAtractylodesmacrocephalaKoidz. Our method has generated good linearity in the range of 76～760 ng,87～870 ng, and 75～750 ng for atractylenolideⅠ,Ⅱ, and Ⅲ,respectively. The average recoveries for these three compounds were 100.20%(RSD=1.8%), 100.10%(RSD=1.2%), and 99.68%(RSD=0.84%)by ultrasonic extraction, and 100.67%(RSD=0.88%), 100.06%(RSD=0.67%), and 100.67%(RSD=1.7%)by heating reflux extraction, respectively. The proposed method is simple, fast, accurate and reproducible, and can be used to control the quality ofAtractylodesmacrocephalaKoidz. The ultrasonic extraction method shows higher extraction efficiency than the heating reflux extraction method.

AtractylodesmacrocephalaKoidz; HPLC; atractylenolide Ⅰ; atractylenolide Ⅱ; atractylenolide Ⅲ; content determination

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.06.009

2017-03-07

湖南師范大學(xué)校青年基金資助項(xiàng)目(21401)

*通訊作者,E-mail：zhouziqiu1985@163.com;zouhui308@163.com

R917

A

1000-2537(2017)06-0055-06

(編輯 WJ)