幾種色素抑制過氧亞硝酸根損傷酪氨酸能力的對比

張辰暘，魏安琪，王 妍，謝子奇，羅云敬

(北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，中國 北京 100124)

幾種色素抑制過氧亞硝酸根損傷酪氨酸能力的對比

張辰暘，魏安琪，王 妍，謝子奇，羅云敬

(北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，中國 北京 100124)

過氧亞硝酸根可以通過強(qiáng)氧化性及強(qiáng)硝化性損傷酪氨酸，從而損害人體健康.姜黃素、原花青素、槲皮素和柚皮素具有抗氧化、抗硝化性，但其自身顏色在研究酪氨酸硝化損傷的常規(guī)方法中易造成干擾.為測定色素抑制3-硝基酪氨酸生成的能力，使用高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-PDAD, High Performance Liquid Chromatography-Photodiode Array Detector)法對硝化損傷體系成分進(jìn)行分離，使用熒光光譜法測定色素抑制酪氨酸二聚體生成能力，鄰苯三酚自氧化法測定超氧根陰離子抑制能力.結(jié)果表明3-硝基酪氨酸抑制率從大到小為姜黃素、原花青素、柚皮素、槲皮素、VC；酪氨酸二聚體抑制率從大到小為原花青素、姜黃素、柚皮素、槲皮素、VC；鄰苯三酚自氧化抑制率從大到小為姜黃素、槲皮素、柚皮素、VC，原花青素?zé)o明顯影響.分析表明4種色素成分抗氧化、抗硝化能力與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān).

高效液相色譜-二極管陣列檢測器；熒光光譜法；過氧亞硝酸根；酪氨酸損傷；黃酮類色素

近年來食品工業(yè)高度發(fā)達(dá)，食用色素的使用十分廣泛，研究表明黃酮類、多酚類天然食用色素具有良好的抗氧化功能[5-10]，張迪[11]、趙靜[12]等驗(yàn)證了原花青素、槲皮素與柚皮苷的抗氧化能力，魯吉珂[13]、周麗娟[14]、周舒文[15]等研究了姜黃素抗氧化、清除自由基的能力，但對于食用色素成分抑制過氧亞硝酸根損傷酪氨酸的能力的研究報(bào)道較少.由于色素成分自身顏色在常規(guī)紫外分光光度法中易造成干擾，并且自由基損傷酪氨酸實(shí)驗(yàn)體系成分較為復(fù)雜，本文利用高效液相色譜法對體系成分進(jìn)行分離，研究對比姜黃素、原花青素、槲皮素和柚皮素抑制過氧亞硝酸根誘導(dǎo)酪氨酸硝化的能力；使用熒光光譜法探究4種色素抑制過氧亞硝酸根氧化損傷酪氨酸的能力，并使用鄰苯三酚自氧化法探究其抗氧化機(jī)理，實(shí)驗(yàn)使用維生素C(VC)作為陽性對照.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)，SunFireRMC18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱(美國Waters公司)，U-3010紫外-可見分光光度計(jì)(日本日立公司)，SH-3數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(北京金紫光科技發(fā)展有限公司)，KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司)，PHS-25數(shù)顯酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器公司)，DKB-450A電熱恒溫水槽(上海森信試驗(yàn)儀器有限公司)，BS-210S電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，PR020XXM1純水機(jī)(北京PALL純水公司)，DL-300掌上離心機(jī)(北京鼎國生物公司)，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(上海科升儀器有限公司),F-4500熒光分光光度計(jì)(日本日立公司).

亞硝酸異戊酯購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，正己烷(色譜純)、過氧化氫(30%)、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、維生素C、焦性沒食子酸和無水乙醇購于天津市福晨化學(xué)試劑廠，二氧化錳、氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉和鹽酸購于北京化工廠，L-酪氨酸、L-3-硝基酪氨酸、甲醇(色譜純)、姜黃素、槲皮素、柚皮素購于上海安譜科學(xué)儀器有限公司，三羥甲基氨基甲烷、氯化血紅素購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，原花青素購于北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司.試劑除標(biāo)注外均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水.姜黃素、槲皮素、柚皮素使用無水乙醇配置為1×10-3mol/L的儲備液，原花青素、VC使用去離子水配置為1×10-3mol/L的儲備液.

1.2 過氧亞硝酸根溶液的制備

過氧亞硝酸根溶液使用UPPU與PRYOR的方法制備[16]，由過氧化氫與亞硝酸異戊酯發(fā)生取代反應(yīng)生成，使用前用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液稀釋，使用紫外-可見分光光度計(jì)測定過氧亞硝酸根濃度.

1.3 HPLC法對幾種色素抑制過氧亞硝酸根誘導(dǎo)酪氨酸硝化的研究

1.3.1 3-硝基酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取3-硝基酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品11.3 mg，使用0.05 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)定容至50 mL，然后分別稀釋至10，50，100，200，500和1 000 μmol/L.分別取上述溶液1 mL過0.22 nm有機(jī)相微孔濾膜進(jìn)液相進(jìn)行檢測，以3-硝基酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.色譜條件：色譜柱選擇SunFireRMC18反相色譜柱，其規(guī)格為4.6 mm×150 mm，粒徑5 μm.流動(dòng)相V(甲醇)∶V(PBS)=1∶9(pH=7.4)，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫37 ℃，檢測波長420 nm.

1.3.2 姜黃素等對過氧亞硝酸根誘導(dǎo)的3-NT生成的影響 在棕色EP管中加入1.5 mL濃度為1 mmol/L的酪氨酸溶液，隨后加入不同體積的濃度為1×10-3mol/L的姜黃素溶液，使其終濃度分別為0，3.3，10.0，16.6，23.3，33.3，50.0和66.6 mmol/L，使用PBS溶液補(bǔ)齊至2.8 mL，混合物于37 ℃水浴孵育5 min后加入200 mmol/L的ONOO-溶液，于37 ℃水浴攪拌反應(yīng)6 h.原花青素、槲皮素、柚皮素和維生素C實(shí)驗(yàn)組做相同處理.色譜條件同1.3.1.

1.4 熒光法對幾種天然色素對過氧亞硝酸根誘導(dǎo)酪氨酸氧化的抑制作用研究

1.4.1 二聚體-過氧亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線 在生理?xiàng)l件下(pH7.4的Tris-HCl緩沖溶液，37 ℃)，酪氨酸濃度為1.0×10-3mol/L，氯化血紅素1.0×10-6mol/L，只改變ONOO-的濃度(濃度范圍為1.0×10-6～2.0×10-3mol/L)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，熒光光譜儀主要參數(shù)：掃描模式Emission，數(shù)據(jù)模式Fluorescence，激發(fā)波長317 nm，發(fā)射波長范圍350～500 nm，掃描速度1 200 nm/min.

1.4.2 姜黃素等對過氧亞硝酸根誘導(dǎo)的酪氨酸二聚體生成的影響 在10 mL塑料離心管中分別加入500 μL酪氨酸(1.0×10-3mol/L)，50 μL氯化血紅素(1.0×10-6mol/L)，不同體積的姜黃素(1.0×10-3mol/L)，使用Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.4)補(bǔ)齊體積至4 950 μL，以無水乙醇作為空白對照，最后加入50 μL的ONOO-溶液啟動(dòng)反應(yīng)(ONOO-的濃度每次通過紫外分光光度計(jì)測定其含量，并稀釋到1.0×10-2mol/L)，瞬間手持渦旋10 s，隨后于37 ℃水浴中反應(yīng)20 min.反應(yīng)完成后取3 mL于1 cm比色皿中，測定反應(yīng)液熒光強(qiáng)度.原花青素、槲皮素、柚皮素和維生素C實(shí)驗(yàn)組做相同處理.熒光光譜儀主要參數(shù)同1.4.1.

1.5 熒光法測定天然色素對鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的抑制作用

取2.80 mL pH=8.2 的Tris-HCl 緩沖液，0.10 mL 三蒸水一同放入一5 mL比色管中，另取0.10 mL 鄰苯三酚溶液(60 mmol/L)放入另一5 mL比色管中，將兩比色管同時(shí)放入25 ℃水浴中保溫20 min.隨后，將兩比色管中溶液迅速混合后快速搖勻，靜置30 s后于1 cm比色皿中放入熒光光譜儀檢測，記錄激發(fā)波長446 nm、發(fā)射波長502 nm光譜條件下的熒光動(dòng)力學(xué)曲線.該曲線0～5 min 部分的斜率為V0.將0.10 mL 水換為不同濃度的姜黃素溶液，熒光動(dòng)力學(xué)曲線的斜率為Vs.添加原花青素、槲皮素、柚皮素及維生素C實(shí)驗(yàn)組按照上述實(shí)驗(yàn)條件做同樣處理.熒光光譜主要參數(shù)：掃描模式Time，數(shù)據(jù)模式Fluorescence，激發(fā)波長446 nm，發(fā)射波長502 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 幾種色素對過氧亞硝酸根誘導(dǎo)酪氨酸硝化的抑制作用

2.1.1 3-NT標(biāo)準(zhǔn)曲線 在本文色譜條件下，3-硝基酪氨酸(3-NT)色譜峰與其他峰明顯分開，可以對其進(jìn)行準(zhǔn)確定量.標(biāo)準(zhǔn)曲線y=18.968x-0.158 7，R2=0.999 6，線性關(guān)系良好.

2.1.2 幾種色素成分對過氧亞硝酸根誘導(dǎo)酪氨酸硝化的色譜分析

由圖1可以看出，在加入姜黃素、原花青素、槲皮素和柚皮素的體系中，酪氨酸硝化損傷產(chǎn)物3-NT的生成量隨色素加入量增加而不同程度地降低，并且對比VC下降趨勢更加明顯.

2.1.3 色素成分對過氧亞硝酸根硝化酪氨酸的抑制作用 以譜圖中對應(yīng)位置處峰面積參照3-NT標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，按式(1)計(jì)算天然產(chǎn)物對ONOO-損傷的抑制能力，所得結(jié)果見表1.

抑制率=(1-I2/I1)×100%,

(1)

式中：I1為未添加食用色素時(shí)ONOO-誘導(dǎo)酪氨酸硝化生成3-NT的濃度;I2為添加食用色素時(shí)ONOO-誘導(dǎo)酪氨酸硝化生成3-NT的濃度.

表1 各色素梯度濃度抑制率統(tǒng)計(jì)

圖1 加入不同體積抑制劑的酪氨酸硝化色譜圖(a～e：姜黃素、原花青素、槲皮素、柚皮素、VC，抑制劑A～H的最終濃度: 0，3.3，10.0，16.6，23.3，33.3，50.0,66.6 mmol/L)Fig.1 Chromatography of Tyr induced by ONOO- add with different concentration of inhibitor(The addition of a～f inhibitors: curcumin, proanthocyanidins, quercetin, naringenin, VC. Final concentration of each inhibitor：0.0,3.3,10.0,16.6,23.3,33.3,50.0 and 66.6 mmol/L)

分析發(fā)現(xiàn)，在本文濃度范圍內(nèi)姜黃素、原花青素、槲皮素及柚皮素對于過氧亞硝酸根引發(fā)的酪氨酸硝化損傷均有不同程度的抑制作用，抑制能力從大到小為姜黃素、原花青素、柚皮素、槲皮素、VC.濃度為10 μmol/L時(shí)，姜黃素抑制率仍達(dá)到72.52%，原花青素為57.56%，槲皮素、柚皮素均在48.5%左右，而同樣濃度的VC抑制率僅12.38%，較低濃度的4種色素表現(xiàn)出良好的抗硝化活性.姜黃素分子中具有多個(gè)功能基團(tuán)，如兩個(gè)苯丙烯酰基骨架、苯環(huán)上的酚羥基與甲氧基及丙烯基、β-雙酮/烯醇式結(jié)構(gòu)的連接，使其具有良好的抗硝化活性[17].

2.2 幾種色素對過氧亞硝酸根誘導(dǎo)酪氨酸二聚體生成的抑制

2.2.1 二聚體-過氧亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線 以過氧亞硝酸根濃度為橫坐標(biāo)，二聚體熒光值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=3.738x+306.8，R2=0.996，線性關(guān)系良好.

2.2.2 幾種色素對過氧亞硝酸根誘導(dǎo)酪氨酸氧化的熒光光譜分析 4種色素對于過氧亞硝酸根誘導(dǎo)的酪氨酸氧化均具有不同程度的抑制作用，抑制能力與色素濃度呈正相關(guān)(圖2)，其中姜黃素作用最為明顯，不同濃度姜黃素抑制酪氨酸二聚體生成的熒光光譜見圖2(a).

圖2 添加姜黃素(a)、原花青素(b)、槲皮素(c)、柚皮素(d)、VC(e)的酪氨酸二聚體熒光光譜圖(A-F：0，2.0，6.0，10.0，14.0，20.0 μmol/L)Fig.2 Fluorescence intensity of dimer-tyr induced by ONOO-add with different concentration of: curcumin(a), proanthocyanidins(b), quercetin(c), naringenin(d) and VC(e)(A-F：0.0，2.0，6.0，10.0，14.0，20.0 μmol/L)

2.2.3 色素成分對過氧亞硝酸根誘導(dǎo)酪氨酸氧化的抑制作用 以光譜圖中λex/em=317/408 nm處的熒光值，參照二聚體-過氧亞硝酸根濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算ONOO-濃度，按公式(2)計(jì)算天然色素的抑制率，所得結(jié)果見表2.

抑制率=(1-I2/I1)×100%，

(2)

式中：I1為未添加天然色素時(shí)ONOO-誘導(dǎo)酪氨酸氧化生成酪氨酸二聚體的濃度；I2為添加天然色素時(shí)ONOO-誘導(dǎo)酪氨酸氧化生成酪氨酸二聚體的濃度.

表2 天然色素對過氧亞硝酸根氧化酪氨酸的抑制作用

結(jié)果表明，姜黃素、原花青素、槲皮素及柚皮素對過氧亞硝酸根氧化酪氨酸均具有不同程度的抑制作用.隨著幾種天然色素的濃度不斷增加，酪氨酸二聚體的生成量逐漸減少，抑制作用從大到小為原花青素、姜黃素、柚皮素、槲皮素、維生素C.在低濃度(2 μmol/L)時(shí)，4種色素已能夠抑制過氧亞硝酸根誘導(dǎo)酪氨酸氧化損傷，姜黃素、原花青素、槲皮素及柚皮素的抑制率分別達(dá)到了24.03%，50.80%，7.20%及20.99%，而同濃度的維生素C抑制率僅1.30%，其中微量的原花青素表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，而槲皮素雖有報(bào)道顯示其可以抑制ONOO-引起的魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)和硝化反應(yīng)[18]，但在抑制ONOO-氧化酪氨酸過程中，槲皮素的抗氧化活性不及其他幾種天然色素.

2.3 幾種色素對鄰苯三酚自氧化的抑制作用

圖3 天然色素對鄰苯三酚自氧化抑制率 Fig.3 Inhibition rate of natural pigment on autoxidation of pyrogallic acid

檢測結(jié)束后，讀取熒光動(dòng)力學(xué)曲線擬合出的反應(yīng)速率，按公式(3)計(jì)算天然色素對鄰苯三酚自氧化的抑制能力，以色素濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，見圖3.

抑制率=(V0-Vs)/V0×100%,

(3)

式中：V0為未添加天然色素時(shí)鄰苯三酚自氧化速率;Vs為添加天然色素時(shí)鄰苯三酚自氧化速率.

結(jié)果表明，姜黃素、原花青素、槲皮素及柚皮素對鄰苯三酚自氧化過程均具有不同程度的抑制作用.由圖可知，隨著幾種色素的濃度不斷增加，鄰苯三酚自氧化速率不斷降低，當(dāng)濃度達(dá)到300 μmol/L時(shí)，姜黃素、槲皮素及柚皮素的抑制率分別為64.66%， 33.60%，19.88%，而同濃度的維生素C抑制率為10.66%，3種色素成分表現(xiàn)出良好的清除超氧根陰離子的能力.原花青素在此實(shí)驗(yàn)中未表現(xiàn)出良好的抑制作用，可能由于其以聚合物形式存在，在該體系中其空間結(jié)構(gòu)影響了抗氧化活性[19].

3 結(jié)論

由上述試驗(yàn)可知，姜黃素、原花青素、槲皮素、柚皮素均具有良好的抗氧化、抗硝化能力，其中姜黃素的作用最為明顯，其苯環(huán)上的酚羥基、甲氧基和β-雙酮結(jié)構(gòu)能夠有效保護(hù)生物大分子免于過氧亞硝酸根的氧化、硝化損傷.姜黃素、槲皮素、柚皮素能夠通過清除過氧亞硝酸根分解產(chǎn)生的超氧根陰離子實(shí)現(xiàn)其抗氧化功能，而原花青素由于其多聚物的存在形式，對超氧根陰離子的抑制效果并不明顯.本文對探究食用色素成分在人體內(nèi)的代謝、保健作用機(jī)理具有啟示作用.本文分析方法對于成分復(fù)雜的食用色素-自由基體系可以進(jìn)行準(zhǔn)確分析，對于未來新型食品添加劑的抗氧化、抗硝化能力分析具有一定指導(dǎo)作用.

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ComparisonofSeveralPigmentsInhibitPeroxynitriteDamagingTyrosineStudyontheEffectofSeveralPigmentsonTyrosineDamageInducedbyPeroxynitrite

ZHANGChen-yang,WEIAn-qi,WANGYan,XIEZi-qi,LUOYun-jing*

(College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)

HPLC-PDAD; fluorescence spectrometry; peroxynitrite; tyrosine damage; flavonoid pigments

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.06.005

2017-04-14

國家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2015BAK44B00)

*通訊作者,E-mail：luoyj@bjut.edu.cn

Q55

A

1000-2537(2017)06-0034-06

(編輯 WJ)