大黃魚脾酪氨酸激酶的克隆與表達(dá)分析

王小龍，葉坤，王志勇，韓芳

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大黃魚脾酪氨酸激酶的克隆與表達(dá)分析

王小龍，葉坤，王志勇，韓芳*

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建 廈門 361021)

克隆大黃魚脾酪氨酸激酶基因(spleen tyrosine kinase，)并分析其結(jié)構(gòu)，通過熒光定量PCR技術(shù)分析該基因的組織表達(dá)譜以及受LPS、PolyI:C和滅活副溶血弧菌()免疫刺激后的表達(dá)變化規(guī)律。結(jié)果顯示：基因cDNA全長2 761 bp，其中開放閱讀框為1 851 bp，編碼616個氨基酸，預(yù)測相對分子質(zhì)量為70 527，理論等電點為8.13；在所檢測到的大黃魚組織(心臟、肝臟、脾臟、頭腎、中腎、鰓、腸、胃、腦)中均有表達(dá)，屬廣譜型表達(dá)；不同組織間的表達(dá)量存在差異，其中在頭腎中的表達(dá)量最高，在中腎和脾臟中的次之，在胃中的表達(dá)量最低；大黃魚受到LPS、Poly I:C和滅活副溶血弧菌免疫刺激后，脾臟、頭腎和肝臟中基因的表達(dá)水平明顯上調(diào)，表明在大黃魚抵御病毒和細(xì)菌病原的免疫機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。

大黃魚；脾酪氨酸激酶；組織表達(dá)譜；副溶血弧菌；免疫刺激

大黃魚()為石首魚科(Sciaenidae)黃魚屬()代表性魚類，是中國四大海水經(jīng)濟(jì)魚類之一。中國大黃魚養(yǎng)殖主要集中在東南沿海，其中以福建、浙江等地較多，近年來已經(jīng)形成了年產(chǎn)量近15萬t的養(yǎng)殖規(guī)模[1]。目前，大黃魚養(yǎng)殖病害主要由細(xì)菌、病毒和寄生蟲等引起，隨之出現(xiàn)了亂用藥、濫用藥所導(dǎo)致的養(yǎng)殖水域水質(zhì)惡化、種質(zhì)資源退化等問題。小G蛋白Rab5A作為重要的分子開關(guān)在大黃魚抵御病毒、細(xì)菌和寄生蟲的先天性免疫過程中發(fā)揮了重要作用[2]。脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)與Rab5A存在蛋白質(zhì)互作。當(dāng)前關(guān)于酪氨酸激酶特別是脾酪氨酸激酶的研究主要是針對哺乳動物。脾酪氨酸激酶是蛋白酪氨酸激酶家族中的一類非受體型酪氨酸激酶，在信號傳遞過程中，由于能量需求的增加，脾酪氨酸激酶通過催化ATP的γ磷酸基，將磷酸基轉(zhuǎn)移到下游蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上，使其磷酸化，促進(jìn)信號傳遞，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生長、增殖和分化等[3]。目前已有關(guān)于鯉魚()、斑馬魚()[4]、大西洋鮭()、大菱鲆()[5]、斑點叉尾鮰()[6]以及七鰓鰻()[7]中脾酪氨酸基因序列研究的報道，但鮮有關(guān)于其基因表達(dá)特征和功能等的研究。筆者對大黃魚脾酪氨酸激酶的克隆與表達(dá)特征以及病毒和細(xì)菌免疫刺激后基因表達(dá)的變化進(jìn)行研究，以期揭示在大黃魚中的免疫分子機(jī)制，為大黃魚養(yǎng)殖病害防治及抗病育種提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料

健康大黃魚取自福建省寧德市金鈴水產(chǎn)科技有限公司，體長為(15±2) cm，體質(zhì)量為(130±10) g。試驗前在溫度為23~26 ℃、鹽度為27~28 psu的充氣海水中馴養(yǎng)2周。

脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(PolyI:C)購自Sigma公司；副溶血弧菌()由集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院鄢慶枇教授惠贈。

從暫養(yǎng)群體中選取6尾正常大黃魚，剖取心臟、肝、脾、頭腎、中腎、鰓、腸、胃和腦組織，于液態(tài)氮中冷凍，存放于–80 ℃冰箱。

從暫養(yǎng)群體中選取240尾大黃魚，平均分成4組(1個對照組，3個試驗組)，用丁香酚麻醉后，試驗組分別腹腔注射0.25 mL Poly I:C(1 g/L)、0.25 mL LPS(1 g/L)和0.25 mL的副溶血弧菌(，1×108cfu/mL)進(jìn)行攻毒；對照組腹腔注射0.25 mL PBS。試驗期間的飼養(yǎng)溫度、pH和鹽度等與馴養(yǎng)條件一致。試驗組與對照組分別于刺激前以及刺激后3、6、12、24、48、72 h取樣，每個時間點取5尾魚的肝臟、脾臟和頭腎。試驗重復(fù)3次。

1.2　方法

1.2.1總RNA的提取及cDNA的合成

大黃魚組織樣品RNA的提取采用Trizol Reagent Kit (Invetrogeon，USA)，并用RNase–free Dnase (Promega, USA)除去其中的DNA雜質(zhì)，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳。cDNA第一條鏈的合成采用GoScript? Reverse Transcription kit (Promega, USA)進(jìn)行。以合成的cDNA為模板擴(kuò)增大黃魚管家基因–，用以對cDNA合成質(zhì)量進(jìn)行檢測。將質(zhì)量較好的cDNA于–20 ℃保存，備用。

1.2.2基因的克隆

大黃魚基因cDNA具體數(shù)據(jù)源自GenBank數(shù)據(jù)庫(登錄號：XM_010751528.2)，并參考其序列信息，設(shè)計1對引物F 和–R (表1)，通過RT–PCR擴(kuò)增其ORF。擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s， 56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；最后再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化后連接pMD–19T vector (TaKaRa, 大連，中國)，送華大基因(上海)科技有限公司測序。

表1　LcSyk基因擴(kuò)增的引物序列和退火溫度

1.2.3生物信息學(xué)分析

序列同源性比對采用在線BLAST((http://blast. ncbi.nlm.nih/.govBlast.cgi)；通過ExPASy(http://web. expasy.org/compute_pi/)預(yù)測大黃魚脾酪氨酸激酶蛋白等電點及其相對分子質(zhì)量；分別采用Signal IP Server 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos/)預(yù)測該蛋白質(zhì)的信號肽和磷酸化位點；通過SMART (http://smart.embl–heidelberg.de/)預(yù)測大黃魚脾酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)功能域；采用SWISS– MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)并結(jié)合Swiss PDB Viewer預(yù)測該蛋白的三級空間結(jié)構(gòu)；將大黃魚脾酪氨酸氨基酸序列與其他物種該蛋白進(jìn)行多重比對后，用MEGA 5.02構(gòu)建脾酪氨酸激酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4實時熒光定量PCR分析

根據(jù)大黃魚管家基因–設(shè)計內(nèi)參引物––F和––R (表1，=2.01，2=0.995 5)，產(chǎn)物長度為107 bp[8]。在測序所得的基因ORF序列內(nèi)設(shè)計試驗引物–QF和–QR(表1，=1.93,2=0.999 6)，產(chǎn)物長度為132 bp。反應(yīng)體系(20 μL)為：10 μL TransStart Top Gree qPCR SuperMix (2×)，0.4 μLQF(10 μmol/L)，0.4 μLQR (10 μmol/L)，0.4 μL Passive Reference Dye(50×)，5 μLcDNA模板及3.8 μL ddH2O。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。試驗設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個樣品進(jìn)行3個技術(shù)性重復(fù)。采用2–ΔΔCt法結(jié)合SPSS19.0中的One–Way ANOVA和LSD Multiple Comparison Test分析各樣品間基因表達(dá)的差異。

2　結(jié)果與分析

2.1　LcSyk基因的cDNA序列

基因cDNA全長2 761 bp，包括246 bp的5′端和664 bp的3′端非編碼區(qū)，其開放閱讀框(ORF)為1 851 bp，編碼616個氨基酸(圖1)。通過ExPasy預(yù)測其蛋白相對分子質(zhì)量為70 527，理論等電點為8.13；采用TMHMM Server和Signal IP Server預(yù)測其沒有跨膜區(qū)和信號肽，表明該蛋白可能是游離的非分泌蛋白；通過NetPhos 3.1 Server預(yù)測其存在18個絲氨酸(Ser)、6個酪氨酸(Tyr)及6個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點，推測大黃魚脾酪氨酸激酶蛋白自身可能受磷酸化激酶的調(diào)控。由SMART進(jìn)行分析的結(jié)果表明，該蛋白主要存在Src同源結(jié)構(gòu)域(8–93 aa及161–245 aa，SH2 domain)和酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域(352–607 aa，TyrKc domain)2種保守結(jié)構(gòu)域。

起始和終止密碼子用黑色方框標(biāo)出；潛在的磷酸化位點(T為蘇氨酸；Y為酪氨酸磷酸；S為絲氨酸磷)用黑色陰影突出顯示；灰色陰影部分依次為SH2–N、SH2–C及TyrKc結(jié)構(gòu)域。

2.2　LcSyk基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

BLASTp比對分析結(jié)果(圖2)顯示：大黃魚LcSyk蛋白氨基酸序列與較多物種具有較高的一致性(63%~89%)，從低到高分別為非洲爪蟾(，XP_002937073.2)，原鴿(，XP_013222534.1)，褐家鼠(，NP_036890.1)，家兔(，XP_002708308.1)，人(，NP_003168.2)，原雞(，NP_001026601.1)，狨猴(，XP_008990899.1)，鯉魚(，AAK49117.1)，斑馬魚(，NP_998008.2)，大西洋鮭(，NP_001167144.1)，斜帶石斑魚(，ALG38206.1)。采用MEGA5.02軟件并以鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結(jié)果顯示大黃魚基因與斜帶石斑魚最近，并與其他魚類(大西洋鮭、斑馬魚、鯉魚)聚為一支，其余物種的基因分別以鳥類、哺乳類及兩棲類為單位各自形成一個分支。

Syk蛋白的SH–N和SH–C及結(jié)構(gòu)域分別用下劃線和波浪線標(biāo)出；TyrKc結(jié)構(gòu)域用黑色陰影標(biāo)出。

圖3　根據(jù)LcSyk基因編碼氨基酸繪制的N–J系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3　LcSyk蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析

如圖4所示，LcSyk蛋白三級結(jié)構(gòu)中的SH2–N、SH2–C及TyrKc結(jié)構(gòu)域分別以綠色、藍(lán)色和紫色標(biāo)示出來。此外，以上結(jié)構(gòu)域間還存在黃色標(biāo)示的Inter SH2(A)及淺灰色標(biāo)示的Interdomain linker(B)2個域間連接。LcSyk蛋白的N末端的前半部分包含2個SH2結(jié)構(gòu)域緊密耦聯(lián)的模塊，由1個螺旋線圈狀的域間連接A串聯(lián)起來。SH2結(jié)構(gòu)域與酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域之間也有一段較長的域間連接B，結(jié)合大黃魚基因和其他物種氨基酸序列的多重比對結(jié)果(圖2)分析，發(fā)現(xiàn)該部分是不同Syk蛋白出現(xiàn)遺傳分化的主要區(qū)域。

LcSyk蛋白不同的結(jié)構(gòu)域分別以各自的顏色顯示，其中A為Inter SH2；B為Interdomain linker。

2.4　大黃魚LcSyk基因的組織表達(dá)分析

熒光定量PCR檢測大黃魚組織表達(dá)譜的結(jié)果(圖5)顯示，在所檢測的大黃魚9個組織或器官中均有脾酪氨酸激酶的表達(dá)，表明脾酪氨酸激酶在大黃魚體內(nèi)是廣譜型表達(dá)。盡管基因mRNA在大黃魚體內(nèi)廣泛表達(dá)，但其表達(dá)量存在明顯差異(圖5)：頭腎組織中的表達(dá)量最高(表達(dá)量從高到低依次為頭腎、中腎、脾臟、鰓、肝臟、腸、腦、心臟、胃)。

“*”示P<0.05水平差異；“**”示P<0.01水平差異。

2.5　大黃魚LcSyk基因免疫刺激后的表達(dá)變化

在脾臟中，大黃魚經(jīng)LPS、Poly I:C和副溶血弧菌刺激后，表達(dá)量在前6 h相對于對照組無明顯變化，之后逐漸升高，并在24 h時達(dá)到最高峰，分別為對照組的6.9、7.8、6.0倍，此后逐漸下降，其中副溶血弧菌刺激后72 h時仍明顯高于對照組(圖6)。

“*”示P<0.05水平差異。

在肝臟中，經(jīng)LPS、Poly I:C和副溶血弧菌刺激后，大黃魚脾酪氨酸激酶表達(dá)量均明顯上調(diào)(圖7)，其中LPS免疫刺激組在刺激后12 h的表達(dá)量最高，約為對照組的4.5倍，之后表達(dá)量雖稍有下降，但免疫刺激后72 h仍明顯高于對照組；副溶血弧菌刺激組在刺激后48 h的表達(dá)量最高，約為對照組的5.5倍。病毒類似物Poly I：C刺激組刺激后24 h脾酪氨酸激酶的表達(dá)量最高，約為對照組的4.0倍。

“*”示P<0.05水平差異。

在頭腎中，大黃魚經(jīng)LPS和副溶血弧菌刺激后，表達(dá)量迅速升高(圖8)，并在刺激后3 h達(dá)到峰值，分別約為對照組的2.5倍和3.2倍，而病毒類似物Poly I:C免疫刺激組基因表達(dá)量的上調(diào)相對滯后，最終于刺激后48 h達(dá)到峰值，約為對照組的3倍。

“*”示P<0.05水平差異。

此外，腹腔注射PBS對照組的表達(dá)量在脾臟、頭腎和肝臟中各時相(刺激后0、3、6、12、24、48、72 h)的相對表達(dá)量均無明顯升高或降低。

3　結(jié)論與討論

酪氨酸激酶作為分子開關(guān)，調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的多種生理學(xué)功能[9–10]。Rab5A蛋白也是作為分子開關(guān)發(fā)揮生物學(xué)功能。一旦酪氨酸激酶發(fā)生突變，當(dāng)其一直處于分子開關(guān)中“開”的狀態(tài)時會導(dǎo)致許多癌癥發(fā)生[11]。酪氨酸激酶功能失調(diào)也會造成許多炎性疾病，比如全身性炎癥、某些慢性炎癥、動脈粥樣硬化等[12]。通過對酪氨酸激酶活性進(jìn)行干預(yù)，可為有機(jī)體炎性疾病及自身免疫病治療提供思路[13]。這一途徑也可能為大黃魚病害防治研究提供參考。

LcSyk蛋白含有酪氨酸激酶家族典型的Src同源結(jié)構(gòu)域(SH2 domain)和酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域(TyrKc domain)。Src同源結(jié)構(gòu)域與受體酪氨酸激酶磷酸化殘基具有很高的親和力，它協(xié)助磷酸化反應(yīng)完成，從而促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[14–15]。SH2與TyrKc結(jié)構(gòu)域間還存在2個域間連接，它們賦予了LcSyk蛋白結(jié)構(gòu)的靈活性和SH2結(jié)構(gòu)域的獨立性[16]，可能為參與的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供較好的分子基礎(chǔ)。本研究中通過對大黃魚脾酪氨酸激酶基因表達(dá)譜的分析，發(fā)現(xiàn)是一個可以在多種組織中表達(dá)的基因，表明其在這些組織中具有重要的生理功能?；蛟谒鶛z測的9個大黃魚器官或組織中均有表達(dá)，屬廣譜型表達(dá)。這與對七鰓鰻的研究結(jié)果[7]一致。在不同組織中表達(dá)量的差異明顯，在頭腎組織中的表達(dá)量最高，在中腎和脾臟中也有高表達(dá)。硬骨魚類的免疫器官主要包括胸腺、頭腎、脾臟及黏膜淋巴組織[17]。胸腺在魚苗早期發(fā)揮主要免疫作用。頭腎相當(dāng)于一種二級淋巴器官，在幼魚和成魚時期發(fā)揮免疫作用，是免疫細(xì)胞發(fā)生、增殖、分化的主要場所，同時也擔(dān)負(fù)著捕獲抗原和產(chǎn)生抗體的重任[18]。虹鱒魚在注射有放射性物質(zhì)標(biāo)記的細(xì)菌后，70%以上被注射細(xì)菌駐留在頭腎，說明頭腎是捕獲抗原與免疫應(yīng)答啟動的主要部位[19–20]。脾臟是魚類機(jī)體中各種中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞等產(chǎn)生、儲存和成熟的主要場所，不僅具有各種免疫細(xì)胞的功能，還具有造血功能[18]。在大黃魚腎臟和脾臟組織中的高表達(dá)，表明脾酪氨酸激酶在大黃魚免疫應(yīng)答中扮演著重要角色。

在大黃魚中，經(jīng)LPS、Poly I：C和副溶血弧菌刺激后，基因表達(dá)量不同程度上調(diào)。

本研究結(jié)果表明，基因在大黃魚不同組織中的表達(dá)差異較明顯，其中在頭腎中的表達(dá)量最高，在胃中的表達(dá)量最低。不同物種的Syk蛋白在進(jìn)化上較為保守，都包含Src同源結(jié)構(gòu)域和酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域。大黃魚經(jīng)Poly I:C、和LPS免疫刺激后，與基因的表達(dá)變化類似，均明顯上調(diào)。推測與可能在其信號級聯(lián)中通過炎癥及吞噬作用共同在大黃魚免疫機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，但其具體作用機(jī)制還有待研究。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王庫

Cloning and expression analysis of spleen tyrosine kinase gene in

WANG Xiaolong，YE Kun，WANG Zhiyong，HAN Fang*

(Fisheries College, Jimei University/Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea, Ministry of Agriculture, Xiamen 361021, China)

The structure of spleen tyrosine kinase gene in()was analyzed from cloned samples, the expression ofmRNA in different tissues was analyzed by quantitative real–time PCR (qRT–PCR), and their expression levels were investigated after stimulated with LPS, polyinosinic polycytidynic acid and. The results showed that the full length cDNA ofwas 2 761 bp, including an ORF of 1 851 bp, encoding with 616 amino acids. The predicted molecular weight and theoretical isoelectric point was 70 527 and 8.13, respectively. The qRT–PCRexpression profiles ofshowed that it could express in all 9 examined tissues, including heart, liver, spleen, head–kidney, kidney, gill, intestine, stomach and brain, but the expression levels were different. The dominant expression level was detected in head–kidney, followed by kidney and spleen, but it was the lowest in stomach. Moreover, it was significantly up–regulated after stimulated with Poly I:C,and LPS. This suggested thatmight play an important role in enhancing immunity against bacteria and virus.

; spleen tyrosine kinase; tissue expression profile;; immune stimulation

Q953.3

A

1007-1032(2017)06-0662-07

2017–05–11

2017–11–01

國家自然科學(xué)基金項目(31402339)；福建省高校杰出青年科研人才計劃項目(20152018)；農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室開放課題(FREU2016–05)

王小龍(1992—)，男，湖北咸寧人，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)動物免疫學(xué)研究，466198152@qq.com；

通信作者，韓芳，女，副教授，主要從事水產(chǎn)動物免疫學(xué)研究，hanfangyc@jmu.edu.cn

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