紫甘藍提取液對人乳腺癌細胞生長和遷移的抑制作用

徐穎倩 曾 雪 唐 倩

(重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，重慶，401331)

紫甘藍提取液對人乳腺癌細胞生長和遷移的抑制作用

徐穎倩 曾 雪 唐 倩

(重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，重慶，401331)

目的：探討紫甘藍提取物對乳腺癌細胞MCF7生長和遷移的抑制作用。方法：應(yīng)用MTT法檢測不同濃度紫甘藍提取物對MCF7增殖的抑制作用，并用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，Annexin V-FITC/PI染色細胞后用流式細胞術(shù)檢測不同濃度紫甘藍提取物對MCF7凋亡的影響，采用Transwell法檢測不同濃度紫甘藍提取物對MCF7遷移的影響。采用SPSS 16.0軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果：紫甘藍提取物可抑制MCF7的增殖，并呈濃度依賴性和時間依賴性(P<0.05)，也使MCF7形態(tài)發(fā)生了異常變化，紫甘藍提取物可誘導(dǎo)MCF7凋亡、抑制其遷移，且呈濃度-效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論：紫甘藍提取物可抑制乳腺癌細胞MCF7生長和遷移。

紫甘藍；乳腺癌；細胞增殖；細胞凋亡；細胞遷移

紫甘藍又稱紅甘藍、赤甘藍，俗稱紫包菜，十字花科、蕓苔屬甘藍種中的一個變種，是結(jié)球甘藍中的一個類型，由于它的外葉和葉球都呈紫紅色，故名[1]。紫甘藍營養(yǎng)豐富，含有豐富的維生素和胡蘿卜素，無機鹽含量也很高，是膳食纖維的良好來源，其抗氧化活性多酚類和黃酮類物質(zhì)的含量也比其他蔬菜高[2-3]。國內(nèi)外大部分關(guān)于紫甘藍的研究都關(guān)注于其抗氧化作用[4-5]，但是對紫甘藍抗癌活性作用的相關(guān)研究鮮有報道。本研究旨在探討紫甘藍提取物對乳腺癌細胞生長和遷移的抑制作用，為人們在膳食方面預(yù)防癌癥提供指導(dǎo)意見，對防癌保健食品的開發(fā)提供部分實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人乳腺癌細胞MCF7購于南京科佰生物科技有限公司。

1.1.2 藥物 新鮮紫甘藍購于重慶市重百超市建議鑒定基原，無機械損傷，無蟲害，無腐爛。

1.1.3 試劑與儀器 細胞培養(yǎng)液RPMI1640、胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素(Gibco公司)；MTT(Sigma公司)；Staurosporine(MCE公司)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒(上海貝博生物有限公司)；Transwell小室(Millipore公司)；6、24、96孔板(ThermoFisher公司)：酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio-Rad公司)；倒置顯微鏡IX71(Olympus公司)；流式細胞儀(碧迪醫(yī)療器械有限公司)；離心機(長沙湘儀離心儀器有限公司)；冷凍干燥機(Thermo公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 稱取500 g新鮮紫甘藍，洗凈，晾干，用榨汁機榨取，收集汁液，將該汁液以3 000 r/min離心15 min，取上清液，25 ℃恒溫箱內(nèi)靜置過夜后，將該上清液經(jīng)濾紙反復(fù)過濾，再用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，所濾過的澄清液體即為紫甘藍原液。將紫甘藍原液冷凍干燥24 h，凍干粉末溶解于蒸餾水中，制備成紫甘藍提取液(Purple Cabbage Extract，PCE)。實驗分組：空白對照組(MTT試驗)、正常對照組、陽性藥物Staurosporine(STS)(濃度250 nmol/L)對照組(MTT試驗、細胞凋亡試驗)、PCE處理組(PCE終濃度分別為50、100、150、200、250、300 μg/L)。

1.2.2 干預(yù)方法 PCE和陽性藥物STS直接干預(yù)MCF7細胞。

1.2.3 檢測指標與方法 采用形態(tài)學(xué)觀察法和MTT法檢測PCE對MCF7的抑制作用，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測PCE對MCF7凋亡的影響，Transwell法檢測PCE對MCF7遷移的影響。

用含10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)MCF7細胞，當細胞生長至80%～90%致密單層時，消化細胞并制備細胞懸液，將1×105個/mL濃度的細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的PCE，使最終每組含PCE濃度分別為50、100、150、200、250、300 μg/L，并設(shè)空白對照組、正常對照組和STS(濃度250 nmol/L)對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。分別于12、24、36 h 3個時相進行MTT比色：棄舊培養(yǎng)液，洗滌細胞后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min使藍紫色的結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490 nm波長，以空白對照孔調(diào)零，測定各個孔的吸光度(A)值。按公式“(1-藥物組A值/正常對照組A值)×100%”計算細胞抑制率，每組設(shè)置6個復(fù)孔，進行3次重復(fù)實驗，求其平均值，以劑量和生長抑制率做直線相關(guān)分析。

將MCF7細胞以1×105個/mL濃度接種于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為150、200、250、300 μg/L的PCE，并設(shè)正常對照組和STS(濃度250 nmol/L)對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，消化細胞并制備細胞懸液，1000 r/min，25 ℃，離心5 min，棄上清液，收集MCF7細胞。向MCF7細胞加入Annexin V結(jié)合液重懸細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×106個/mL，按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒說明書操作，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

將預(yù)先饑餓處理了12 h的MCF7細胞以1×106個/mL濃度種植于Transwell(膜孔徑8 μm，膜直徑6.5 mm)上室，下室分別加入1 mL終濃度為150、200、250、300 μg/L的PCE，并設(shè)正常對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將遷移到Transwell小室膜外側(cè)的MCF7細胞用95%乙醇固定10 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。在倒置顯微鏡(×200)下，隨機觀察12個高倍視野，計數(shù)遷移細胞數(shù)，每2個視野取均數(shù)得6個取均后的細胞數(shù)。每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

不同質(zhì)量濃度的PCE作用于MCF7細胞后，對細胞的生長具有不同程度的抑制作用。當PCE作用細胞12 h時，隨著其濃度的提高，其對MCF7細胞的抑制作用逐漸增強，隨后通過延長PCE的作用時間發(fā)現(xiàn)，相同濃度的PCE隨作用時間延長，其抑制MCF7細胞的能力也隨著增強(圖1)。當PCE濃度大于250 μg/L，并且作用24 h以上時，其對MCF7細胞的抑制率能達到50%以上。檢測到STS作用于MCF7細胞24 h和36 h后，其抑制率分別為(52.37±1.46)%和(65.14±1.58)%。

圖1 PCE對MCF7細胞的抑制作用

正常條件下培養(yǎng)的MCF7細胞生長狀態(tài)良好，細胞排列緊密，細胞呈扁平、多角形或梭形，邊界清楚，大小均勻；STS陽性藥物處理過的細胞出現(xiàn)收縮、變圓、體積變小，細胞間隙增寬，細胞排列紊亂；50 μg/L的PCE作用于細胞后，與正常對照組比較，細胞的形態(tài)無明顯變化；100 μg/L的PCE作用于細胞后，細胞數(shù)量與正常對照組比較有所減少，但是細胞形態(tài)正常，無損傷跡象；當PCE的濃度達到150 μg/L時，細胞的形態(tài)與正常對照組比較出現(xiàn)了明顯的變化，細胞開始收縮、變圓、變小，其形態(tài)和陽性藥物STS組相似，并且隨著PCE濃度的增加，細胞的數(shù)量和密度逐漸變少(圖2)。

圖2 PCE對MCF7形態(tài)的影響(×100)

圖3 PCE對MCF7細胞凋亡的影響

組別凋亡率(%)正常對照組5.31±0.24STS對照組(250nmol/L)42.53±0.27PCE處理組(150μg/L)23.49±0.30PCE處理組(200μg/L)34.72±0.31PCE處理組(250μg/L)41.48±0.26PCE處理組(300μg/L)62.93±0.35

圖4 PCE對MCF7細胞遷移的影響

STS對照組細胞早期凋亡區(qū)域和晚期凋亡區(qū)域的細胞數(shù)量明顯多于正常對照組(圖3)，150 μg/L的PCE作用于MCF7細胞后，早期凋亡的細胞數(shù)量明顯多于正常對照組，并且隨著PCE的濃度增加，凋亡的細胞數(shù)逐漸增多。當不同濃度的PCE作用于MCF7細胞后，細胞凋亡率明顯高于正常對照組，隨著劑量的增加，細胞凋亡率明顯增加。見表1。

與正常對照組比較，150、200、250、300 μg/L的PCE作用后顯著抑制了MCF7細胞的遷移能力，且呈濃度依賴性(圖4)，當PCE的濃度到達200 μg/L時，MCF7細胞的遷移能力下降了50%左右。

3 討論

癌癥是以細胞異常增殖及轉(zhuǎn)移為特點的疾病，是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一，乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，嚴重危害了婦女的生命健康，通過攝入有抗癌活性的食物防治乳腺癌是一種簡單經(jīng)濟、效果明顯的方法[6-7]。天然食物是化學(xué)預(yù)防藥物的最好來源之一，這些來源于食物的天然成分生理作用比較緩和，幾乎無毒，可以較長期服用[8-9]。紫甘藍富含多種營養(yǎng)成分和植物色素，但對其抗癌作用的研究鮮有報道，本研究分別考察了紫甘藍濃縮汁液對乳腺癌細胞MCF7的增殖、形態(tài)、凋亡和遷移的影響。紫甘藍對MCF7細胞的體外抑制試驗采用的是MTT法，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比，可間接反映活細胞數(shù)量，并且靈敏度較高[10]，MTT試驗結(jié)果表明，PCE能夠有效抑制MCF7細胞增殖，細胞抑制率呈濃度、時間依賴性，對細胞形態(tài)的觀察也進一步的表明PCE對MCF7細胞有損傷和抑制作用。細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的有序的死亡，其意義在于能消除在形成過程中發(fā)生異常的細胞，然而在抑癌基因p53出現(xiàn)問題時，就不會誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，從而導(dǎo)致癌細胞的不斷增長，采用Annexin V-FITC/PI法可以區(qū)分凋亡早期、凋亡晚期和死亡細胞，靈敏度高[11]。細胞凋亡試驗結(jié)果表明，PCE能誘導(dǎo)MCF7細胞凋亡，這很有可能是導(dǎo)致MCF7細胞形態(tài)發(fā)生改變以及抑制MCF7細胞增殖的原因。癌細胞轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤致死的主要原因，腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移是多因素、多步驟的過程，其中腫瘤細胞的遷移能力被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移的限速環(huán)節(jié)，腫瘤細胞的遷移能力與其轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)性[12]。在本研究中，用Transwell法觀察了PCE對MCF7細胞遷移的影響，Transwell小室置于培養(yǎng)板中，Transwell小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室盛裝細胞培養(yǎng)液，下室盛裝細胞誘導(dǎo)液，上下層液體以PET膜相隔，將MCF7細胞種在上室內(nèi)，由于PET膜的通透性，下層遷移液的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對MCF7細胞遷移的影響[13]。Transwell實驗結(jié)果顯示，PCE對MCF7細胞遷移有明顯的抑制作用，并且呈濃度依賴性。這些實驗結(jié)果提示紫甘藍具有潛在的抗癌價值。

紫甘藍屬于十字花科甘藍類植物，在200多項流行病學(xué)研究資料中，有80%的結(jié)果表明食用植物性食物特別是十字花科蔬菜能夠降低多種癌癥的患病風險，其中甘藍類植物對癌癥的預(yù)防作用更是強于其他蔬菜和水果[14-15]。十字花科植物所含有的硫代葡萄糖苷(硫苷)的水解產(chǎn)物是其抗癌特性的主要成分，硫苷自身性質(zhì)比較穩(wěn)定，不具備生物活性，但是它可以被內(nèi)源性黑芥子酶或人腸道內(nèi)微生物產(chǎn)生的水解酶水解，生成硫氰酸鹽、異硫氰酸鹽、腈類等一系列活性物質(zhì)，異硫氰酸鹽對哺乳動物的肝癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌有明顯的抑制作用[16-18]。研究表明，紫甘藍含有脂肪族硫苷、吲哚族硫苷、芳香族硫苷等，除了含有硫苷外，還富含花青素，花青素是一種天然色素，可以清楚自由基，有很強的抗氧化功能，其降解產(chǎn)物在減輕疼痛和預(yù)防癌癥方面也有一定的功效[19-20]。因此，我們推測紫甘藍的抗癌活性與其富含的硫苷和花青素有關(guān)，但是具體是哪些物質(zhì)發(fā)揮了抗癌活性，以及紫甘藍的抗癌機制還有待進一步研究。

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PurpleCabbageExtractinInhibitionofBreastCancerCellGrowthandMigration

Xu Yingqian,Zeng Xue,Tang Qian

(CollegeofPharmacy,ChongqingMedicalandPharmaceuticalCollege,Chongqing401331,China)

Objective:To investigate the effect of purple cabbage extract (PCE) on breast cancer cell MCF7 growth and migration.MethodsThe inhibition rate of MCF7 cells was assessed by MTT method,and the inverted phase contrast microscope was used to observe the cellular shape.Flow cytometry was utilized for measuring cell apoptosis after Annexin V-FITC/PI stained the cell.The transwell chamber was used to investigate cell migration.ResultsPCE inhibited MCF7 cell proliferation in a concentration-and time-dependent manner (P<0.05).After incubated with PCE,the cells became shrinkage and turned round,arranged loosely and adhered not favorable gradually.PCE induced MCF7 cell apoptosis and inhibited cell migration in a concentration-dependent manner (P<0.05).ConclusionPCE inhibits breast cancer cell MCF7 growth and migration.

Purple cabbage；Breast cancer；Cell proliferation；Cell apoptosis；Cell migration

重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校科研計劃項目(ygz2015107)

徐穎倩(1989.04—)，女，碩士，講師，研究方向：藥物化學(xué)，E-mail：alicexu0410@126.com

唐倩(1979.02—)，女，碩士，副教授，副院長，研究方向：藥物分析，E-mail：15981934@qq.com

R151.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.054

(2016-12-29收稿 責任編輯：楊覺雄)