響應(yīng)面法優(yōu)化酒醅中風(fēng)味物質(zhì)水蒸汽提取工藝

洪 勝，郭亞飛，袁 曄，李 喆，黃永軍

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

響應(yīng)面法優(yōu)化酒醅中風(fēng)味物質(zhì)水蒸汽提取工藝

洪 勝，郭亞飛，袁 曄，李 喆，黃永軍

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

通過單因素及Box-Behnken設(shè)計實驗對酒醅中的風(fēng)味物質(zhì)成分的水蒸汽提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化目標(biāo)為酒醅水蒸汽提取餾分氣相色譜圖譜與車間原酒圖譜相似度，并在最優(yōu)提取工藝條件下通過酒醅加標(biāo)回收實驗分別獲得了酒醅中7種原酒骨架成分的平均回收率。結(jié)果表明，酒醅中風(fēng)味物質(zhì)水蒸汽提取優(yōu)化工藝參數(shù)為：提取溶劑150 mL，餾分體積15 mL，提取溶劑乙醇濃度17%，此條件下相似度實測值為（92.0±4.2）%。酒醅中7種原酒骨架成分的平均回收率分別為乙酸乙酯84.6%、丁酸乙酯81.0%、己酸乙酯72.6%、乳酸乙酯56.8%、乙酸56.1%、丁酸50.9%、己酸36.4%。

響應(yīng)面； 酒醅； 水蒸汽提取

中國傳統(tǒng)白酒是以糧谷類為原料，酒曲為糖化發(fā)酵劑，采用固態(tài)發(fā)酵方式，經(jīng)蒸餾、貯存、勾調(diào)形成的酒精飲料[1]。酒醅是釀酒原料經(jīng)釀酒微生物混合發(fā)酵的物料，微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，是影響白酒產(chǎn)質(zhì)量的關(guān)鍵因素。目前對于酒醅的研究多集中于其常規(guī)理化及微生物指標(biāo)，而對其所含微量風(fēng)味物質(zhì)的研究相對較少，這就大大限制了對于酒醅發(fā)酵質(zhì)量與對應(yīng)原酒產(chǎn)質(zhì)量關(guān)系的研究，究其原因主要在于對酒醅中不同性質(zhì)的風(fēng)味物質(zhì)的提取較為困難。

目前已有針對酒醅中風(fēng)味物質(zhì)提取研究的相關(guān)報道，如頂空-固相微萃取[2-3]、溶劑輔助風(fēng)味物質(zhì)蒸發(fā)[1]、索氏提取[4]以及水蒸汽提取工藝[5-6]等。水蒸汽提取工藝是化工中分離揮發(fā)性物質(zhì)的一種高效精餾方法，普遍用于有機(jī)物的精餾分離過程。白酒生產(chǎn)中采用水蒸汽提取工藝，故實驗室采用水蒸汽提取工藝不僅能模擬車間生產(chǎn)過程，且提取樣品的風(fēng)味成分更接近真實酒樣，但目前鮮有針對酒醅水蒸汽提取工藝優(yōu)化的研究報道。

酒醅中所含風(fēng)味物質(zhì)種類眾多，且性質(zhì)（如分子量、沸點等）及含量差異極大，而原酒中具有相對穩(wěn)定的風(fēng)味物質(zhì)組分種類及含量，如實驗室采用水蒸汽提取工藝獲得的餾分樣品在風(fēng)味物質(zhì)種類和含量上能最大程度接近原酒，從生產(chǎn)應(yīng)用角度可認(rèn)為提取工藝達(dá)到最優(yōu)。為準(zhǔn)確度量餾分樣品與車間原酒相似程度，引入了指紋圖譜技術(shù)，指紋圖譜即將經(jīng)預(yù)處理的樣品，通過色譜手段分析后得到的能顯示該樣品特性的譜圖，該技術(shù)只需將樣品中各種成分的含量和比例關(guān)系以色譜圖予以呈現(xiàn)，并采用相似度指標(biāo)比較樣品之間差異，其計算一般采用“相關(guān)系數(shù)法”或“夾角余弦”法，但結(jié)果基本一致[7]。

本研究采用響應(yīng)面法對酒醅中風(fēng)味物質(zhì)的水蒸汽提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化因素為提取溶劑體積、餾分體積及提取溶劑組成，優(yōu)化目標(biāo)為餾分樣品氣相色譜圖譜與車間原酒圖譜相似度（下簡稱相似度），確定最優(yōu)提取工藝參數(shù)，并通過加標(biāo)回收實驗確定原酒骨架成分回收率，以期為釀酒生產(chǎn)中酒醅風(fēng)味成分分析提供有效的提取工藝，同時也為從風(fēng)味成分角度探索酒醅和原酒之間的相關(guān)性提供了可能性，從而更準(zhǔn)確的分析酒醅發(fā)酵情況。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

實驗材料：2017年5月洋河酒廠濃香型出池酒醅；建立對照指紋圖譜用不同批次50個原酒樣品，分別取自該公司2016年9月—2017年5月多個濃香型生產(chǎn)車間不同小組。

主要實驗試劑：乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR）；叔戊醇（內(nèi)標(biāo)1，純度≥99%，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司）；乙酸正戊酯（內(nèi)標(biāo)2，純度≥98.5%，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司）；2-乙基正丁酸（內(nèi)標(biāo)3，純度＞99%，德國Merck Schuchardt公司）；乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丁酸、己酸（純度均≥99.5%，美國Sigma-Aldrich公司）。

主要儀器設(shè)備：Agilent 7890A型氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 氣相色譜分析條件

載氣N2，流速1 mL/min；進(jìn)樣口溫度270℃，進(jìn)樣量 1 μL，分流比 50∶1；CP-Wax 57CB 型（CP-97723A）毛細(xì)管色譜柱，50 m×0.25 mm×0.25 μm；程序升溫，35℃保留6 min，6℃/min升至60℃，保留3min，再以4.5℃/min升至80℃，保留2min，9.5℃/min升至180℃，保留2 min，9.5℃/min升至210℃，保留10 min；FID檢測器，300 ℃，氫氣30 mL/min，空氣300 mL/min。

1.2.2 對照指紋圖譜的建立及相似度計算

50個原酒樣品氣相色譜直接進(jìn)樣，對所有樣品圖譜中所含的43個共有峰（包含1.1節(jié)所述7種骨架成分）進(jìn)行積分，并將原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)化為AIA格式，一并導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，生成共有模式圖譜作為酒醅水蒸汽提取樣品相似度評定對照指紋圖譜。對照指紋圖譜建立后，將不同提取條件得到的酒醅餾分樣品色譜分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入該系統(tǒng)，與對照指紋圖譜進(jìn)行比對，計算并獲得相似度結(jié)果。

1.2.3 單因素實驗

準(zhǔn)確稱取50 g酒醅樣品置于500 mL 3個球形燒瓶中，加入一定體積、一定比例的乙醇溶液，振蕩均勻后通入水蒸汽提取，自來水冷凝回流，收集一定體積餾分，氣相色譜直接進(jìn)樣檢測其中的風(fēng)味物質(zhì)成分。具體實施步驟如圖1，依次研究提取溶劑體積、餾分體積和乙醇濃度3個因素對相似度的影響，每個單因素實驗設(shè)置3個平行。

1.2.4 水蒸汽提取工藝優(yōu)化

以單因素實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，確定溶劑體積、餾分體積和乙醇濃度3個因素作為考察變量，采用3因素3水平的Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化實驗，以相似度為優(yōu)化目標(biāo)，實驗因素及編碼水平見表1。

1.2.5 原酒骨架成分水蒸汽提取回收率測定

在裝有50 g酒醅的3個燒瓶中加入一定體積和濃度的原酒7種骨架成分（乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丁酸、己酸）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（加標(biāo)液體積及濃度見表4），密閉過夜，次日按照優(yōu)化得到最優(yōu)提取工藝實施水蒸汽提取過程，并設(shè)空白對照（未加標(biāo)酒醅樣品），各設(shè)置3個平行。

表1 影響相似度三因素及其編碼水平

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計及統(tǒng)計分析軟件為Design-Expert 7.0.0，相似度評價軟件為中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004 A版。

2 結(jié)果與分析

2.1 水蒸汽提取單因素對相似度的影響

不同溶劑體積、餾分體積及乙醇濃度對相似度影響見圖1。隨著提取溶劑體積增大，相似度呈先增后減趨勢，溶劑體積增大，促進(jìn)水蒸汽與酒醅間的傳質(zhì)、傳熱過程，風(fēng)味物質(zhì)加快析出至餾分中，使相似度增大，但溶劑體積過大會導(dǎo)致體系升溫速率減緩，一定餾分體積下風(fēng)味物質(zhì)成分及含量減小，相似度減小。實驗室使用的提取酒醅量較少，在蒸汽量充足及提取溶劑量一定的前提下，酒醅中的揮發(fā)性成分較大部分在較短時間內(nèi)餾出，致使在餾分體積為10 mL上下時即達(dá)到風(fēng)味物質(zhì)種類和含量最大，相似度最高，隨后逐漸減小。提取溶劑中乙醇的加入極大促進(jìn)了風(fēng)味物質(zhì)的餾出，相似度急劇上升，但乙醇添加比例試驗表明，適宜的乙醇比例非常關(guān)鍵，乙醇濃度在10%vol～30%vol之間相對適宜。綜合圖1選定影響?zhàn)s分與對照原酒相似度三因素的有效范圍：溶劑體積50～200 mL，餾分體積10～50 mL，乙醇濃度10%vol～30%vol。

2.2 水蒸汽提取工藝優(yōu)化

2.2.1 Box-Behnken實驗結(jié)果

基于Box-Behnken設(shè)計的優(yōu)化實驗結(jié)果見表2，其中含12組析因點實驗，3組中心點重復(fù)實驗用于評估實驗誤差。

2.2.2 模型方程的建立與顯著性評價

圖1 單因素實驗結(jié)果

表2 Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計實驗結(jié)果

運用Design-Expert軟件對表2 Box-Behnken實驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到水蒸汽提取酒醅中風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)學(xué)模型（已編碼）：Y=84.77+5.78 X1-10.45 X2-5.11 X3-3.77 X1X2-2.80 X1X3+5.67 X2X3-15.28 X12-9.15X22-14.99 X32，其中Y為相似度編碼值，X1、X2和X3為溶劑體積、餾分體積和乙醇濃度編碼值。回歸模型顯著性方差分析見表3。

由表3可知：（1）該模型方程F值為7.22，對應(yīng)P值（0.0009）小于0.01，表明該模型極顯著；（2）決定系數(shù)R2值為0.9807，表示餾分與原酒相似度實驗值與模型預(yù)測值有良好一致性；（3）模型中X1X2和X1X3項表現(xiàn)為不顯著，可簡化模型方程Y=84.77+5.78 X1-10.45 X2-5.11 X3+5.67 X2X3-15.28 X12-9.15X22-14.99 X32；（4）3個影響因素對相似度影響大小為餾分體積＞溶劑體積＞乙醇濃度。

2.2.3 響應(yīng)面分析

圖2為響應(yīng)面及其等高線圖，分別反映出各獨立變量及其兩兩之間的交互作用對相似度的影響。圖2中a1和b1分別表示固定乙醇濃度為20%vol時，餾分體積和溶劑體積兩因素對相似度的影響，a1反映出餾分體積對相似度的影響比溶劑體積大，b1等高線圖呈現(xiàn)近似橢圓，表明餾分體積和溶劑體積可能存在交互作用，但模型方程顯著性分析顯示其P值為0.0918，交互作用不顯著。

圖2中a2和b2分別表示固定餾分體積為30 mL時，乙醇濃度和溶劑體積兩因素對相似度的影響，由a2可看出，溶劑體積對相似度的影響較乙醇濃度大，b2等高線圖表現(xiàn)為完整的圓形，這兩個因素不存在交互作用，模型方差分析也得到相同結(jié)果。

圖2中a3和b3分別表示固定溶劑體積為125 mL時，乙醇濃度和餾分體積兩因素對相似度的影響，a3顯示餾分體積對響應(yīng)值的影響較乙醇濃度大，b3等高線圖呈現(xiàn)為橢圓形，該兩因素存在交互作用，契合模型方差分析結(jié)果。

表3 回歸模型顯著性方差分析

2.2.4 最優(yōu)提取條件驗證

圖2 溶劑體積、餾分體積和乙醇濃度對餾分與原酒相似度影響響應(yīng)面圖及等高線圖

運用Design-Expert軟件對建立的模型方程進(jìn)行尋優(yōu)分析，得到相似度最高的水蒸汽提取工藝：溶劑體積148.36 mL，餾分體積15.21 mL，乙醇濃度16.60%vol，此工藝下預(yù)測相似度為90.4%?？紤]到實際操作過程，將上述工藝條件調(diào)整為：溶劑體積150 mL，餾分體積15 mL，乙醇濃度17%vol，并進(jìn)行了該條件下的3次平行驗證實驗，實際測得相似度為（92.0±4.2）%，與預(yù)測值相對誤差僅為1.8%。

表4 原酒中7種骨架成分水蒸汽提取加標(biāo)回收結(jié)果

2.3 原酒骨架成分水蒸汽提取回收率

在最優(yōu)水蒸汽提取工藝條件下酒醅中7種原酒骨架成分的加標(biāo)回收結(jié)果見表4。7種成分加標(biāo)回收率隨著其沸點的升高而降低，最大和最小值差距達(dá)48.03%，其原因在于最優(yōu)提取工藝條件設(shè)定餾分體積為15 mL，沸點低較沸點高的風(fēng)味物質(zhì)成分優(yōu)先餾出。根據(jù)回收率結(jié)果可間接推算酒醅中上述7種成分的含量，從而可為研究酒醅發(fā)酵質(zhì)量與對應(yīng)酒體風(fēng)味關(guān)系積累數(shù)據(jù)。

3 結(jié)論

采用水蒸汽提取工藝提取酒醅中的多種風(fēng)味物質(zhì)組分，以提取得到的酒醅餾分樣品氣相色譜圖譜與車間原酒圖譜相似度為優(yōu)化目標(biāo)，運用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化酒醅水蒸汽提取工藝參數(shù)，包括提取溶劑體積、餾分體積和提取溶劑乙醇濃度，獲得酒醅中風(fēng)味物質(zhì)成分最優(yōu)水蒸汽提取工藝為溶劑體積150 mL，餾分體積15 mL，乙醇濃度17%vol，模型相似度預(yù)測值為90.4%，3個平行驗證實驗值為（92.0±4.2）%。最優(yōu)提取工藝條件下酒醅加標(biāo)回收實驗結(jié)果顯示：酒醅中7種原酒骨架成分平均回收率分別為乙酸乙酯84.6%、丁酸乙酯81.0%、己酸乙酯72.6%、乳酸乙酯56.8%、乙酸56.1%、丁酸50.9%、己酸36.4%，通過回收率數(shù)據(jù)計算其在酒醅中的含量分別為4.41 mg/50 g、0.24 mg/50 g、4.65mg/50g、12.91mg/50g、5.23mg/50g、1.06mg/50g、3.02 mg/50 g。從發(fā)展角度看，酒醅中風(fēng)味物質(zhì)成分提取工藝及其含量的初步確定不僅為實際生產(chǎn)過程中酒醅的質(zhì)量控制提供了一個有價值的指標(biāo)，也為后期研究酒醅與對應(yīng)原酒中風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)系提供了數(shù)據(jù)支持。

[1]宮莉莉,李安軍,孫金沅,等.溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)法與頂空-固相微萃取法結(jié)合分析白酒酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味成分[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(9)：169-177.

[2]尚柯,韓興林,王德良,等.醬香白酒高溫堆積酒醅揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測分析[J].中國釀造,2016,35(2)：139-143.

[3]范文來,徐巖.應(yīng)用HS-SPME技術(shù)測定固態(tài)發(fā)酵濃香型酒醅微量成分[J].釀酒,2008,35(5)：94-98.

[4]胡沂淮,蔡楠,戴源,等.濃香型白酒堆積發(fā)酵酒醅揮發(fā)性成分分析[J].釀酒科技,2014(3)：93-96.

[5]周新虎,陳翔,楊勇,等.濃香型白酒窖內(nèi)參數(shù)變化規(guī)律及相關(guān)性研究（Ⅲ）：風(fēng)味物質(zhì)[J].釀酒科技,2012(6)：47-51.

[6]崔海灝,崔靖靖.十里香發(fā)酵酒醅中風(fēng)味物質(zhì)、酶活力和微生物的關(guān)系探討[J].釀酒,2013,40(6)：74-76.

[7]祝成,張宿義,趙金松.指紋圖譜在白酒分析及質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].中國釀造,2011(11)：17-20.

Optimization of Steam Distillation Extraction of Flavoring Compounds from Fermented Grains by Response Surface Method

HONG Sheng,GUO Yafei,YUAN Ye,LI Zhe and HUANG Yongjun
(Yanghe Distillery Co.Ltd.,Suqian,Jiangsu 223800,China)

The steam distillation extraction conditions of flavoring compounds from fermented grains were optimized by single factor test and Box-Behnken design.The goal of the optimization was the similarity between GC spectrum of the distillate from fermented grains by steam distillation extraction and GC spectrum of base liquor in workshop.The optimum extraction conditions were summed up as follows:the extraction solvent volume was 150 mL,extraction sample volume was 15 mL,ethanol concentration of extraction solvent was 17%,and the final similarity was(92.0±4.2)%.Under the optimal extraction conditions,the average recoveries of seven kinds of base liquor skeleton components in fermented grains were obtained respectively by recovery test as follows:84.6%(ethyl acetate),81.0%(ethyl butyrate),72.6%(ethyl hexanoate),56.8%(ethyl lactate),56.1%(acetic acid),50.9%(butyric acid),and 36.4%(caproic acid).

response surface method;fermented grains;steam distillation extraction

TS262.3；TS261.4；TS261.7

A

1001-9286（2017）12-0055-05

10.13746/j.njkj.2017206

2017-07-25

洪勝（1985-），男，碩士，主要從事白酒風(fēng)味物質(zhì)檢測工作。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2017-10-13；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20171013.1352.006.html。