血必凈注射液治療火器致兔ALI的康復價值及對肺組織NF—κB表達的影響

徐曉峰++許秀娟+++郝建++吳升++錢鈞++李樹雯++李霄茜

[摘要] 目的 探討血必凈（XBJ）注射液治療火器致兔急性肺損傷（ALI）的康復價值及對肺組織核因子-κB（NF-κB）表達的影響。 方法 采用隨機數(shù)字表法將SPF級健康雄性兔60只分為正常對照組、ALI模型組、生理鹽水組、低劑量XBJ治療組、中劑量XBJ治療組、高劑量XBJ治療組，每組各10只。ALI模型組、生理鹽水組、低劑量XBJ治療組、中劑量XBJ治療組、高劑量XBJ治療組吸入高溫氣體，制作完成兔ALI動物模型；建模半小時后，低、中、高劑量XBJ治療組分別腹腔內注射10、20、30 mg/kg XBJ，生理鹽水組注射生理鹽水，正常對照組和ALI模型組不做處理。觀察12 h后，處死兔并取左肺上葉肺組織，檢測肺組織NF-κB的表達；在光鏡下對肺組織進行病理學檢查，并及時記錄其病理變化。 結果 病理學檢查結果：正常對照組肺泡結構清晰，肺泡壁薄，肺泡內未見水腫液；ALI模型組、生理鹽水組肺泡結構模糊，肺泡壁斷裂，肺內大量炎癥細胞浸潤，肺組織間質及肺泡腔出現(xiàn)明顯水腫，可見較多的紅細胞，肺泡壁間質增厚，透明膜形成；經(jīng)XBJ治療的各組肺泡結構仍存在，肺內炎癥細胞浸潤減輕，肺組織間質及肺泡腔中度水腫，可見少量滲液、出血。肺組織Western blot分析顯示，ALI模型組NF-κB活性明顯高于正常對照組（P < 0.01）；與ALI模型組、生理鹽水組比較，低、中、高劑量XBJ治療組兔肺組織中NF-κB活性明顯降低，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），其中，中劑量XBJ治療組降低最明顯，與低、高劑量XBJ治療組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05、P < 0.01）。 結論 XBJ注射液對火器傷誘導兔的ALI具有保護作用，且XBJ中劑量保護作用最明顯。

[關鍵詞] 急性肺損傷；血必凈注射液；核因子-κB；細胞因子

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）11（a）-0019-05

The value of Xuebijing Injection on the rehabilitation of rabbits with acute lung injury induced by firearm injury and the effect on the expression of NF-κB in lung tissue

XU Xiaofeng XU Xiujuan HAO Jian WU Sheng QIAN Jun LI Shuwen LI Xiaoqian

Cardiopulmonary Rehabilitation Medicine Center， Hangzhou Sanatorium of People's Liberation Army， Zhejiang Province， Hangzhou 310007， China

[Abstract] Objective To investigate the value of Xuebijing Injection （XBJ） on the rehabilitation of rabbits with acute lung injury （ALI） induced by firearm injury and the effect on the expression of nuclear factor kappa B （NF-κB） in lung tissue. Methods Sixty healthy male rabbits were randomly divided into normal control group， ALI model group， normal saline group， low dose of XBJ treatment group， medium dose of XBJ treatment group， high dose of XBJ treatment group by random number table mehtod， with 10 rats in each group. The rabbits of ALI model group， normal saline group， low dose of XBJ treatment group， medium dose of XBJ treatment group， high dose of XBJ treatment group were inhaled with high-temperature gas， so as to complete the model of rabbits with ALI. After modeling for half an hour， low， medium， high dose of XBJ treatment groups were respectively received intraperitoneal injection of 10， 20， 30 mg/kg XBJ， normal saline group was injected with normal saline， while normal control group and ALI model group were not dealt with any treatment. After 12 h， the rabbits were killed and the lung tissue of left upper lobe was taken to detect the expression of NF-κB in lung tissue； under the light microscope， the lung tissue was taken to make pathological examination， and the pathological changes were recorded in time. Results The results of pathological examination： in the normal control group， the alveolar structure was clear， the alveolar wall was thin， and no edematous fluid was found in the lung tissue； in the ALI model group and normal saline group， the alveolar structure was fuzzy， the alveolar wall was broken， there were a lot of inflammatory cells infiltration in the lung， obvious edema was found in the pulmonary mesenchyme and alveolar space， many red blood cells could be seen， and the mesenchyme of alveolar wall was thickened， the hyaline membrane was formed； after treatment by XBJ， the alveolar structures in all groups were still existed， the inflammatory cells infiltration in the lung was reduced， pulmonary mesenchyme and alveolar space showed moderate edema， less cataclysm and bleeding could be seen. Western blot of lung tissue showed that， the activity of NF-κB in ALI model group was significantly higher than that of normal control group （P < 0.01）； compared with ALI model group and normal saline group， the activity of NF-κB in lung tissue of low， medium， high dose of XBJ treatment groups were all decreased， the differences were all highly statistically significant （P < 0.01）， among which， medium dose of XBJ treatment group was decreased most significantly， which had statistically significant differences compared with those of low， high dose of XBJ treatment groups （P < 0.05， P < 0.01）. Conclusion XBJ injection has protective effects on rabbits with ALI induced by firearm injury， and the protective effect of medium dose of XBJ is the most obvious.endprint

[Key words] Acute lung injury； Xuebijing Injection； Nuclear factor kappa B； Cytokines

急性肺損傷（ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是機體受到感染、誤吸、創(chuàng)傷和膿毒癥等致病因素損傷以后，肺組織產(chǎn)生的廣泛而過度的炎性反應，病理學特點是肺組織出現(xiàn)大量的炎癥細胞浸潤和肺血管通透性增加，其發(fā)病機制復雜，病死率高，是近年來研究的熱點。近年來在動物實驗中研究發(fā)現(xiàn)使用血必凈（XBJ）注射液對大鼠ALI具有保護作用[1]，因此，本研究選用火器傷制作兔ALI模型，采用XBJ干預治療，測量兔肺組織中核因子-κB（NF-κB）的活性，旨在探討XBJ注射液治療火器致兔ALI康復價值及對肺組織NF-κB表達的影響，現(xiàn)將結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

由安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院動物實驗中心提供SPF級健康兔60只，雄性，體重1.80～2.20 kg，月齡1～4個月，合格證號為101193，倫理審批批號為20140319。

1.2 主要實驗試劑

XBJ注射液由上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號20150911，每支10 mg（2 mL）。NF-κB免疫印跡檢測試劑盒由上海博苑生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 將SPF級健康雄性兔60只采取隨機數(shù)字表法分為六組：正常對照組、ALI模型組、生理鹽水組、低劑量XBJ治療組、中劑量XBJ治療組、高劑量XBJ治療組，每組各10只。

1.3.2 動物模型制作及處理 使用中國科學技術大學火災國家重點實驗室研制的高溫氣體實驗裝置完成模擬火器傷致兔ALI實驗動物模型[2]。具體方法：將各組兔稱重并記錄體重數(shù)據(jù)，除正常對照組兔外，其余各組均用400 mg/kg的10%水合氯醛注射液注入至實驗兔的腹腔中進行麻醉，將麻醉好的兔放置在高溫氣體實驗裝置內，啟動點火，調節(jié)實驗模型裝置內可變溫度至150℃高溫氣體供給兔吸入，整個ALI的實驗時間控制在3 min，完成兔ALI的動物模型。造模成功與否參考X線以及CT等影像學檢查判斷，在行組織學評估時可見動物模型中出現(xiàn)了ALI時上皮細胞及內皮細胞病理變化特征，同時伴隨出現(xiàn)了不同程度的炎癥表現(xiàn)。建模30 min后向生理鹽水組兔腹腔內注射NaCl 10 mL/kg，分別向低劑量XBJ治療組、中劑量XBJ治療組、高劑量XBJ治療組兔腹腔內注射XBJ 10、20、30 mg/kg，正常對照組和ALI模型組不做處理。

1.3.3 標本采集和處理 建模后12 h，用10%水合氯醛對六組兔進行腹腔麻醉，劑量為400 mg/kg。將麻醉后的兔仰臥，四肢及頭部固定于操作臺上，用手術刀切開胸腔，放血致兔死亡。用剪刀沿兩側腋中線向上至下頜部剖開，掀開胸前壁，暴露出兔的氣管和肺臟，分離左肺上葉，用剪刀剪下，浸入10%福爾馬林溶液中，存儲在0℃低溫中保存，并做好標記。

1.3.4 測定兔肺組織中NF-κB的含量 采用免疫印跡（Western blot）測定兔肺組織中NF-κB的含量。實驗過程采用的Western blot每組重復3次，條帶使用Quantity one灰度分析軟件實施精密分析。

1.3.5 病理學檢查 采用10%甲醛溶液對兔的左上肺組織進行固定、石蠟包埋、切片，再行HE染色，在光鏡下對肺組織進行病理學檢查，并及時記錄其病理變化情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組兔肺組織光學顯微鏡下病理學變化情況

正常對照組（圖1A）肺組織中肺泡結構清晰，肺泡壁薄，肺泡內未見水腫液，肺間隙、肺毛細血管均顯示正常的形態(tài)學解剖。ALI模型組（圖1B）、生理鹽水組（圖1C）肺泡結構模糊，肺泡壁斷裂，肺內大量炎癥細胞浸潤，肺組織間質及肺泡腔出現(xiàn)明顯水腫，可見較多的紅細胞，肺泡壁間質增厚，透明膜形成；低劑量XBJ治療組（圖1D）、中劑量XBJ治療組（圖1E）、高劑量XBJ治療組（圖1F）兔肺組織與正常對照組比較，肺內炎癥細胞浸潤減輕，肺組織間質及肺泡腔輕中度水腫，可見少量滲液、出血，其中中劑量XBJ治療組損傷程度最輕，肺組織病理改變接近正常對照組，僅見少部分肺間質及肺泡壁輕度水腫及少量炎癥細胞浸潤。

2.2 Western blot驗證結果

各實驗組肺組織β-actin與NF-κB灰度比較，見圖2～3。由圖2可見，正常對照組β-actin灰度最高，但與ALI模型組及生理鹽水組相比并未呈現(xiàn)出明顯的差別，從低劑量XBJ組開始，至中劑量XBJ治療組及高劑量XBJ治療組，β-actin灰度減少。圖3可見，正常對照組NF-κB灰度最低，ALI模型組及生理鹽水組的NF-κB灰度呈現(xiàn)出較高的水平，但在使用了XBJ后，隨著劑量的增加，NF-κB灰度逐漸減少。

2.3 各組兔肺組織NF-κB變化比較

ALI模型組、生理鹽水組、低劑量XBJ治療組、中劑量XBJ治療組、高劑量XBJ治療組與正常對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；低劑量XBJ治療組、中劑量XBJ治療組、高劑量XBJ治療組與ALI模型組、生理鹽水組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；中劑量XBJ治療組、與低劑量XBJ治療組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；中劑量XBJ治療組與高劑量XBJ治療組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表1。

注：與正常對照組比較，aP < 0.01；與ALI模型組、生理鹽水組比較，bP < 0.01；與低劑量XBJ治療組比較，cP < 0.05；與中劑量XBJ治療組比較，dP < 0.01；ALI：急性肺損傷；XBJ：血必凈；NF-κB：核因子-κBendprint

3 討論

ALI是各種肺內和/或肺外致病因素導致的急性彌漫性炎癥性肺損傷，ARDS是ALI進一步惡化的結果，表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征和急性呼吸衰竭。ALI/ARDS病因多樣，如嚴重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等導致肺泡上皮細胞和肺毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，引起急性呼吸窘迫和呼吸衰竭，其發(fā)病機制錯綜復雜。有研究表明，在ALI/ARDS病情的發(fā)生發(fā)展中，細胞因子和炎性介質的調控失衡起著十分關鍵的作用[3-4]。體內各臟器和肺內的肺上皮細胞、內皮細胞以及巨噬細胞等釋放的白細胞介素（IL）-6、IL-8、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、細胞間黏附因子1、粒巨噬細胞集落刺激因子等細胞因子參與了ALI的發(fā)生、發(fā)展，這些細胞因子構成了肺內炎性反應的細胞因子網(wǎng)絡[5-6]。NF-κB是參與炎性反應的一個重要信號轉導分子，能調節(jié)與免疫及炎癥相關促炎介質的基因轉錄與表達。當機體遭受致病因素損傷后，細胞受到脂多糖、TNF-α等信號刺激后，NF-κB被激活，活化的NF-κB迅速移位到細胞核與靶基因的特異序列相結合，啟動信號通路和基因轉錄，誘導相關基因表達[7-10]。由此可見，ALI的發(fā)病機制涉及大部分細胞因子的表達調控，包括NF-κB的活化。本研究對兔的肺組織經(jīng)Western blot分析，ALI模型組NF-κB活性明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），提示NF-κB參與了兔ALI的發(fā)病過程，且NF-κB的活化可能是構成肺內炎性反應的細胞因子網(wǎng)絡一個中心環(huán)節(jié)。

現(xiàn)代戰(zhàn)爭常使用火器或者各種燃燒物質作為武器，導致人體ALI非常常見，且火器導致ALI有其自身的特征[11-13]。本研究中，由病理圖片可見，正常對照組實驗動物，顯示正常健康兔的肺解剖組織，其肺泡壁、肺泡腔、肺間隙、肺毛細血管均顯示正常的形態(tài)學解剖，ALI模型組實驗兔其肺泡壁斷裂，肺泡腔融合變大，肺間質增寬，肺毛細胞血管明顯充血、水腫，大量的炎癥細胞浸潤，透明膜形成，提示肺組織結構已嚴重受損。故本課題成功制作了野戰(zhàn)狀態(tài)火器傷致ALI的實驗動物模型，并提示火器傷引起的ALI是直接對肺組織的損傷，可瞬間引起肺泡廣泛斷裂、肺間質明顯水腫，肺組織結構受損嚴重，導致急性氣體交換功能障礙，表現(xiàn)出嚴重的呼吸困難和呼吸窘迫等臨床癥狀。

XBJ注射液是紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸等中藥材的提取物，主要成分為紅花黃色素A等，其中紅花、赤芍、丹參等具有活血化瘀功效，赤芍還能有效抑制急性炎癥引起的滲出，促進炎癥吸收等[14-16]；丹參能明顯改善微循環(huán)，促進組織修復與再生，對過度增生的纖維母細胞有抑制作用[17-19]；當歸具有活血、調節(jié)機體免疫功能、抑菌、抗動脈硬化和抗缺氧等功效[20]。XBJ注射液具有拮抗內毒素、調節(jié)免疫功能、拮抗炎性因子、改善微環(huán)循、保護內皮細胞等作用[21-22]，臨床上可應用于急性化膿性扁桃體炎、化膿性支氣管炎、細支氣管炎、腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎、腹腔內感染引起的全身炎癥反應綜合征及因感染、創(chuàng)傷、燒傷等引起的多器官功能障礙綜合征等。一項XBJ治療膿毒癥及多器官功能障礙綜合征的前瞻性多中心的臨床研究表明XBJ具有控制炎性損傷的作用，其作用機制可能與調節(jié)促炎因子與抗炎因子的平衡、抑制中性粒細胞在肺組織中的滲出和炎癥介質的過度表達有關[23]。本研究對火器致兔ALI模型進行XBJ干預治療，發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量XBJ治療組兔肺組織中NF-κB活性明顯降低，分別與ALI模型組、生理鹽水組相比均有統(tǒng)計學差異（P < 0.05），提示XBJ對ALI具有保護作用，生理鹽水沒有這種保護作用。低、中、高劑量XBJ治療組兔肺組織中NF-κβ活性以中劑量XBJ治療組降低最明顯，低劑量XBJ治療組與中劑量XBJ治療組、中劑量XBJ治療組與高劑量XBJ治療組比較均有顯著差異（P < 0.05），但低劑量XBJ治療組與高劑量XBJ治療組結果比較，無統(tǒng)計學差異（P > 0.05）。從病理上觀察，ALI模型組、生理鹽水組、低劑量XBJ治療組、高劑量XBJ治療組兔肺組織與正常對照組比較，其肺泡壁、肺泡腔、肺間隙、肺毛細血管均發(fā)生明顯的病理變化，中劑量XBJ治療組肺泡壁毛細血管輕度充血，肺間質及肺泡壁輕度水腫，可見少量炎癥細胞浸潤。

綜上所述，XBJ對ALI具有保護作用，在一定范圍內，XBJ對ALI的保護效果是隨著劑量增加而增強，且中等劑量XBJ對肺組織的保護作用效果最好，但超過中等劑量的XBJ對肺組織的保護作用則減弱。

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（收稿日期：2017-08-04 本文編輯：張瑜杰）endprint