葡萄籽原花青素對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織中Caspase-3和TRAF6表達(dá)的影響Δ

宋云梅（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)部，河南南陽473000）

葡萄籽原花青素對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織中Caspase-3和TRAF6表達(dá)的影響Δ

宋云梅＊（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)部，河南南陽473000）

目的：研究葡萄籽原花青素對(duì)腎缺血再灌注損傷（RIRI）大鼠腎組織中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和腫瘤壞死因子相關(guān)受體（TRAF6）表達(dá)的影響，探討葡萄籽原花青素對(duì)RIRI的保護(hù)機(jī)制。方法：將50只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、腎復(fù)康膠囊組（陽性對(duì)照，600 mg/kg）和葡萄籽原花青素低、高劑量組（100、150 mg/kg），每組10只。每天ig給藥1次，連續(xù)7 d。給藥結(jié)束后，除假手術(shù)組的其余各組大鼠均復(fù)制RIRI模型。造模成功24 h后，檢測各組大鼠血清中肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）水平以及腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白表達(dá)，并測定腎小管上皮細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中Cr、BUN水平明顯升高（P＜0.05），腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05），腎小管上皮細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中Cr、BUN水平均明顯降低（P＜0.05），腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白表達(dá)均明顯減弱（P＜0.05），腎小管上皮細(xì)胞凋亡率均明顯降低（P＜0.05），且葡萄籽原花青素高劑量組作用優(yōu)于葡萄籽原花青素低劑量組和腎復(fù)康膠囊組（P＜0.05）。結(jié)論：葡萄籽原花青素能減輕大鼠RIRI，這可能是通過下調(diào)腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白的表達(dá)，從而抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。

葡萄籽原花青素；腎缺血再灌注損傷；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；腫瘤壞死因子相關(guān)受體；大鼠

腎缺血再灌注損傷（RIRI）可在腎移植術(shù)、腎切除術(shù)等手術(shù)中發(fā)生，嚴(yán)重的可導(dǎo)致急性腎功能衰竭，患者病死率較高[1]，因此臨床上有必要采取防治措施。RIRI的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，如缺血缺氧環(huán)境使組織細(xì)胞內(nèi)酸性代謝產(chǎn)物增加，pH值降低，缺血后突然的復(fù)流造成了細(xì)胞內(nèi)外巨大的pH濃度差等，這些因素均可導(dǎo)致的共同結(jié)果，就是腎細(xì)胞，尤其是腎小管上皮細(xì)胞的壞死和凋亡，故腎小管上皮細(xì)胞凋亡在RIRI發(fā)生發(fā)展中有重要作用[2]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）屬于半胱氨酸蛋白酶，具有特異性切割天冬氨酸的特性，在細(xì)胞凋亡中起著非常重要的作用[3]；而腫瘤壞死因子相關(guān)受體（TRAF6）在活性氧介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。葡萄籽原花青素是從葡萄籽中提取的一種有效活性營養(yǎng)成分，具有抗氧化、消除細(xì)胞內(nèi)游離氧自由基等作用[4-7]，可減輕RIRI，但其機(jī)制并不十分清楚。本研究擬通過考察腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白表達(dá)，探討葡萄籽原花青素對(duì)RIRI大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響，從細(xì)胞凋亡層面闡明葡萄籽原花青素改善RIRI的機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

M15全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（上海纖檢儀器有限公司）；Allegerx-12離心機(jī)（美國Beckman公司）；FA1104電子天平（上海天平儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

葡萄籽原花青素原料藥（陜西方晟科技有限公司，批號(hào)：2014BZ016，純度：96%）；血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20150629、20150220）；兔抗Caspase-3免疫組化試劑盒、山羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：201509、201509）；腎復(fù)康膠囊（吉林敖東集團(tuán)力源制藥股份有限公司，批號(hào)：201412，規(guī)格：0.3 g/粒）；TRAF6酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海拜力生物科技有限公司，批號(hào)：201511）；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

健康清潔級(jí)Wistar大鼠50只，♀♂各半，體質(zhì)量200～250 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCKX（豫）2015-0004]，購入后基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將50只大鼠稱體質(zhì)量后采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組、模型組、腎復(fù)康膠囊組（陽性對(duì)照，600 mg/kg，根據(jù)臨床用量等效換算而得）和葡萄籽原花青素低、高劑量組（100、150 mg/kg，分別根據(jù)臨床成人劑量的6、9倍換算而得），每組10只。于造模前1周，假手術(shù)組和模型組大鼠每天ig 1次生理鹽水，各給藥組大鼠每天ig 1次含相應(yīng)藥物的生理鹽水溶液。給藥7 d后，模型組和各給藥組大鼠按照文獻(xiàn)[8]中方法進(jìn)行造模：造模前大鼠禁食不禁水6 h，然后采用3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）ip麻醉，當(dāng)用鉗夾大鼠鼠尾無疼痛后，將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮后常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)域。采用腹部正中切口，推開肝、腸管等組織，暴露雙側(cè)腎組織，對(duì)腎筋膜進(jìn)行鈍性分離，游離腎蒂后分離腎動(dòng)靜脈，無創(chuàng)動(dòng)脈夾把雙側(cè)腎動(dòng)脈阻斷60 min復(fù)制RIRI模型。造模成功后（造模成功標(biāo)志：5 min內(nèi)腎從紫黑色轉(zhuǎn)為紅色）縫合切口，涂抹紅霉素軟膏預(yù)防切口感染。假手術(shù)組大鼠處理、分離腎動(dòng)靜脈后，不夾閉腎動(dòng)脈。

2.2 血清中Cr、BUN水平的測定

造模成功24 h后，各組大鼠分別從下腔靜脈穿刺取血2 mL，1 000×g低溫離心10 min，分離血清，置于－20℃冰箱中保存。按照試劑盒說明書操作檢測大鼠血清中Cr、BUN水平。

2.3 腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白表達(dá)的檢測

大鼠取血后，ip 3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，處死大鼠，取出腎組織，清洗處理后將部分腎組織制備成10%組織勻漿。采用ELISA法檢測大鼠腎組織中TRAF6表達(dá)，具體操作方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。另取部分腎組織，采用免疫組化法檢測大鼠腎組織中Caspase-3蛋白表達(dá)，具體操作如下：將石蠟包埋的組織切片置于120℃微波爐中烤片40 min，脫蠟、水化，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，之后進(jìn)行封閉，分別進(jìn)行一抗（1∶300）和二抗（1∶500）的孵育；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，每張切片隨機(jī)采集5個(gè)高倍視野，輸入醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)BI-2000進(jìn)行圖像處理，檢測Caspase-3的平均光密度值。

2.4 腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的檢測

采用TUNEL法測定大鼠腎組織中腎小管上皮細(xì)胞凋亡率。將經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定的腎組織細(xì)胞石蠟切片脫蠟至水，蛋白酶K消化，然后置于37℃濕盒中孵育30 min，并加混合液，37℃濕盒中孵育60 min。玻片放入20×SSC雜交處理溶液的染色缸中終止反應(yīng)，室溫放置15 min；3%過氧化氫室溫處理30 min，加稀釋的抗生物素蛋白鏈菌素辣根過氧化物酶溶液，室溫反應(yīng)30 min，DAB顯色，封片。觀察、拍照，腎小管上皮細(xì)胞核棕黃色染色為陽性，采用BI-2000圖像處理系統(tǒng)對(duì)總細(xì)胞和凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)。將每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取3張切片，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)不同視野，取平均值，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%）。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠血清中Cr、BUN水平測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，其余各組大鼠血清中Cr、BUN水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中Cr、BUN水平均明顯降低，且葡萄籽原花青素高劑量組大鼠血清中Cr、BUN水平明顯低于葡萄籽原花青素低劑量組和腎復(fù)康膠囊組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見表1。

3.2 大鼠腎組織中TRAF6蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，其余各組大鼠腎組織中TRAF6蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中TRAF6蛋白表達(dá)水平均明顯降低，且葡萄籽原花青素高劑量組大鼠腎組織中TRAF6表達(dá)水平明顯高于葡萄籽原花青素低劑量組和腎復(fù)康膠囊組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。假手術(shù)組、模型組、腎復(fù)康膠囊組和葡萄籽原花青素低、高劑量組大鼠腎組織中TRAF6蛋白表達(dá)測定結(jié)果依次為（0.86±0.58）、（8.46±2.65）、（4.64±0.21）、（3.14±0.16）、（5.82±0.23）ng/L（n＝10）。

表1 各組大鼠血清中Cr、BUN水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1Determination results of the levels of Cr，BUN in serum of rats in each group（±s，n＝10）

表1 各組大鼠血清中Cr、BUN水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1Determination results of the levels of Cr，BUN in serum of rats in each group（±s，n＝10）

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與葡萄籽原花青素低劑量組和腎復(fù)康膠囊組比較，ΔP＜0.05Note：vs.shamoperationgroup，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.procyanidins low-dose group and Shengfukang capsules group，ΔP＜0.05

組別假手術(shù)組模型組腎復(fù)康膠囊組葡萄籽原花青素低劑量組葡萄籽原花青素高劑量組BUN，mmol/L 8.45±0.57 42.60±3.96＊28.21±3.04＊#29.49±2.43＊#21.23±3.56＊#Δ劑量，mg/kg 600 100 150 Cr，μmol/L 42.29±6.05 115.90±18.98＊74.21±5.47＊#86.27±4.11＊#61.03±3.16＊#Δ

3.3 大鼠腎組織中Caspase-3蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，其余各組大鼠腎組織中Caspase-3表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中Caspase-3表達(dá)水平明顯降低，且葡萄籽原花青素高劑量組大鼠腎組織中Caspase-3表達(dá)水平明顯低于葡萄籽原花青素低劑量組和腎復(fù)康膠囊組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。假手術(shù)組、模型組、腎復(fù)康膠囊組和葡萄籽原花青素低、高劑量組大鼠腎組織中Caspase-3蛋白檢測平均光密度值依次為0.190±0.07、0.564±0.02、0.436±0.06、0.422±0.03、0.377±0.02（n＝10）。免疫組化圖見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織中Caspase-3蛋白檢測免疫組化圖（×400）Fig1ImmunohistochemistryoftheCaspase-3 proteinexpressioninrenaltissueof rats in each group（×400）

3.4 大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，其余各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率明顯降低，且葡萄籽原花青素高劑量組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率明顯低于葡萄籽原花青素低劑量組和腎復(fù)康膠囊組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。假手術(shù)組、模型組、腎復(fù)康膠囊組和葡萄籽原花青素低、高劑量組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率依次為（3.3±0.9）%、（24.4±2.6）%、（19.6±3.2）%、（20.8±31）%、（13.9±2.1）%。切片圖見圖2。

圖2 各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率切片圖（×400）Fig 2Section pictures of the apoptotic rate ofrenaltubularepithelialcellsof rats in each group（×400）

4 討論

RIRI可導(dǎo)致腎功能衰竭，其發(fā)生機(jī)制與氧源性自由基的產(chǎn)生、腎細(xì)胞凋亡等因素相關(guān)。血清中Cr、BUN和胱抑素C水平是反映腎小球?yàn)V過率的敏感標(biāo)志物。腎復(fù)康膠囊治療RIRI的效果在臨床應(yīng)用中已經(jīng)得到了肯定[9]，故以此為陽性對(duì)照藥。本研究結(jié)果顯示，夾閉腎蒂后大鼠腎顏色由鮮紅色變?yōu)榘导t色，夾閉一定時(shí)間后，松開動(dòng)脈夾，之后腎顏色逐漸恢復(fù)鮮紅色，且各手術(shù)組大鼠血清中Cr、BUN水平均明顯升高，這提示腎組織發(fā)生明顯病理損傷，表明RIRI大鼠模型制備成功。

當(dāng)缺血再灌注時(shí)，可通過多種途經(jīng)使細(xì)胞發(fā)生病理改變，這其中首先就是線粒體途徑。當(dāng)外界刺激過于劇烈時(shí)，線粒體膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，三磷酸腺苷生成量顯著減少，線粒體功能喪失，將直接誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。在死亡受體通路中，死亡受體Fas可與Fas相關(guān)結(jié)構(gòu)死亡域（Fas-associated death domain，F(xiàn)ADD）結(jié)合，F(xiàn)ADD又參與了Caspase-3的激活，從而造成細(xì)胞凋亡。TRAF6在氧自由基介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮著重要的作用，減少氧自由基的產(chǎn)生或減少TRAF6蛋白的表達(dá)，均可減少氧自由基導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[10-11]。葡萄籽原花青素為從葡萄籽中提取的帶酚羥基的多酚化合物，具有極強(qiáng)的抗氧化活性[12]。本研究結(jié)果顯示，大鼠腎缺血再灌注期間，腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，腎小管上皮細(xì)胞凋亡率明顯升高；預(yù)防性給予葡萄籽原花青素后，大鼠腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白表達(dá)明顯減弱，腎小管上皮細(xì)胞凋亡率降低，同時(shí)血清中Cr、BUN水平也顯著降低。這說明葡萄籽原花青素可以減輕大鼠RIRI，可能是通過抑制腎小管上皮細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，葡萄籽原花青素減輕RIRI可能與下調(diào)腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白的表達(dá)，從而抑制腎小管上皮細(xì)胞的凋亡有關(guān)，但其更確切的作用機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Effect of Grape Seed Procyanidins on Protein Expressions of Caspase-3 and TRAF6 in Renal Tissue of Rats with Renal Ischemia-reperfusion Injury

SONG Yunmei（Dept.of Basic，Nanyang Medical College，Hennan Nanyang 473000，China）

OBJECTIVE：To study the effect of grape seed procyanidins on protein expressions of cysteine aspartic protease 3（Caspase-3），tumor necrosis factor-related receptors（TRAF6）in renal tissue of rats with renal ischemia-reperfusion injury（RIRI），and explore the protective mechanism of procyanidins on RIRI.METHODS：50 rats were randomly divided into sham operation group，model group，Shenfukang capsules group（positive control，600 mg/kg），procyanidins low-dose，high-dose groups（100，150 mg/kg），10 in each group.All rats were intragastrically administrated once a day，for 7 d.After administration，rats in other groups except for sham operation group were established the RIRI model.After the modeling successed of 24 h，levels of creatinine（Cr），urea nitrogen（BUN）in serum，and protein expressions of Caspase-3，TRAF6 in renal tissue of rats in each group were detected，and apoptotic rate of renal tubular epithelial cells was determined.RESULTS：Compared with sham operation group，levels of Cr，BUN in serum in model group were significantly increased（P＜0.05）；protein expressions of Caspase-3，TRAF6 in renal tissue were obviously enhanced（P＜0.05）；apoptotic rate of renal tubular epithelial cells was obviously increased（P＜0.05）.Compared with model group，levels of Cr，BUN in serum in each administration group were obviously decreased（P＜0.05）；protein expressions of Caspase-3，TRAF6 in renal tissue were obviously weakened（P＜0.05）；apoptotic rate of renal tubular epithelial cells was obviously decreased（P＜0.05）；and procyanidins high-dose group showed superior effect to low-dose group and Shenfukang granules group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Grape seed procyanidins can relieve the RIRI of rats，which may be achieved by reducing protein expressions of Caspase-3 and TRAF6 to inhibit the apoptotic rate of renal tubular epithelial cells.

Grape seed procyanidins；Renal ischemia-reperfusion injury；Cysteine aspartic protease 3；Tumor necrosis factor-related receptors；Rats

R285

A

1001-0408（2017）34-4811-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.15

南陽市科技攻關(guān)項(xiàng)目（No.2014GG040）

＊講師，碩士。研究方向：腎缺血再灌注。電話：0377-63526123。E-mail：songsm@163.com

2017-04-10

2017-10-17）

（編輯：林靜）