金屬蛋白酶7及金屬蛋白酶19在膽道閉鎖幼鼠動(dòng)物模型肝臟組織中的表達(dá)

劉亭睜，張志波

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒外科，沈陽(yáng) 110004）

金屬蛋白酶7及金屬蛋白酶19在膽道閉鎖幼鼠動(dòng)物模型肝臟組織中的表達(dá)

劉亭睜，張志波

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒外科，沈陽(yáng) 110004）

目的檢測(cè)金屬蛋白酶家族中金屬蛋白酶7 （MMP-7）和金屬蛋白酶19 （ MMP-19）在幼鼠膽道閉鎖動(dòng)物模型中的表達(dá)情況，探討其在膽道閉鎖肝纖維化中的作用及機(jī)制。方法選取出生3 d 的Wistar幼鼠132只作為實(shí)驗(yàn)組，采用肝外膽管結(jié)扎的方法制作膽道閉鎖動(dòng)物模型，62只幼鼠作為對(duì)照組，僅行開腹探查術(shù)。于術(shù)后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d取肝臟組織，應(yīng)用免疫組化、Western blotting及實(shí)時(shí)PCR等方法分別檢測(cè)MMP-7及MMP-19在2組肝臟組織中的分布和表達(dá)情況。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組幼鼠在術(shù)后24 h即表現(xiàn)出梗阻性黃疸的臨床癥狀；HE染色及Masson染色均發(fā)現(xiàn)肝臟組織纖維化逐漸加重；免疫組化、Western blotting、實(shí)時(shí)PCR等均發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組MMP-7的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，且逐漸升高；MMP-19在各時(shí)間段表達(dá)逐漸增強(qiáng)，但均低于對(duì)照組。結(jié)論MMP-7和MMP-19在膽道閉鎖肝纖維化中可能發(fā)揮重要作用。

金屬蛋白酶7； 金屬蛋白酶19； 膽道閉鎖； 肝纖維化

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是嬰幼兒梗阻性黃疸最常見的原因之一，晚期可致不可逆性肝硬化［1］，不經(jīng)治療很難生存至1歲?，F(xiàn)通過(guò)肝門空腸吻合術(shù)（Kasai術(shù)式）重建膽道，引流膽汁。但即使在Kasai術(shù)后成功建立膽汁引流通路，多數(shù)患兒肝內(nèi)膽管損害和肝纖維化仍呈漸進(jìn)性進(jìn)展，最終發(fā)展成為終末期肝硬化。BA已成為兒童期肝移植最常見的原因［2-3］。影響B(tài)A預(yù)后的主要原因?yàn)殡y以控制的進(jìn)行性肝纖維化，其發(fā)生原因尚不清楚。

本研究組對(duì)BA患者肝臟組織進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族成員MMP-7和MMP-19表達(dá)差異顯著。本研究檢測(cè)不同處理時(shí)期的膽總管結(jié)扎（bile duct ligation，BDL）幼鼠動(dòng)物模型肝臟組織MMP-7和MMP-19表達(dá)水平的變化特點(diǎn)，探討二者在BA肝纖維化中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 BDL動(dòng)物模型及標(biāo)本處理

選取出生3 d，體質(zhì)量9～11 g的Wistar幼鼠132只，采用已有方法制作BDL膽道閉鎖模型［4］，全麻下于劍突左側(cè)2 mm作一長(zhǎng)約1 cm的縱行切口，暴露膽總管并結(jié)扎；對(duì)照組62只幼鼠僅行開腹探查。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究與新技術(shù)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理編號(hào)為2015PS229K。

于術(shù)后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d處死小鼠，左心室灌注生理鹽水至肝臟蒼白，無(wú)菌下取肝臟組織2塊（約100 mg），分別置于無(wú)菌EP管內(nèi)，-80℃冰箱保存，用于提取蛋白質(zhì)及RNA，其余組織浸入4%多聚甲醛內(nèi)固定，用于組織學(xué)染色。

1.2 方法

1.2.1 HE及Masson染色：組織切片厚度4 μ m，常規(guī)HE及Masson染色，觀察各組肝臟組織及肝內(nèi)小膽管結(jié)構(gòu)的改變，行組織纖維化分析。

1.2.2 免疫組化染色：根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫組化染色，一抗分別為1∶15兔抗大鼠MMP-7（美國(guó)RD公司）及1∶50兔抗大鼠MMP-19抗體（美國(guó)ProteintechTM公司）。

1.2.3 Western blotting：組織剪碎、勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。測(cè)定蛋白濃度后將各組蛋白濃度調(diào)至同一水平，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉緩沖液室溫封閉后，分別加入一抗MMP-7（1∶2 000）或MMP-19（1∶2 000），β-actin為內(nèi)參照，4 ℃過(guò)夜，加入1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗孵育2 h，發(fā)光。凝膠圖像處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.2.4 實(shí)時(shí)PCR：試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，采用Primer5.0軟件參考GeneBank設(shè)計(jì)引物，由TaKaRa公司合成。TRIzol 法提取肝臟組織RNA，經(jīng)紫外分光度法檢測(cè)濃度，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，GAPDH作為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)體系20 μ L，包括cDNA 2 μ L，SYBR Premix Ex Taq（ Tli RNaseH Plus）10.0 μ L，ROX Reference DyeⅡ（50×） 0.4 μ L，上游引物 0.4 μ L，下游引物 0.4 μ L，ddH2O 6.8 μ L 。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)各樣品的Ct值，相對(duì)定量每個(gè)樣品的ΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，根據(jù)ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組計(jì)算2-ΔΔCt。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以±s表示，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型大體表現(xiàn)

術(shù)后24 h實(shí)驗(yàn)組皮膚黃染（圖1A），隨后出現(xiàn)毛發(fā)油亮（圖1B）、尿黃、白便等梗阻性黃疸的癥狀，且生長(zhǎng)發(fā)育明顯落后于對(duì)照組。

術(shù)后3 d解剖肝外膽管，見實(shí)驗(yàn)組肝臟變黃、表面粗糙結(jié)節(jié)狀、質(zhì)地變硬，結(jié)扎線以上膽管明顯擴(kuò)張（圖1C），正常對(duì)照組肝臟表面光滑、質(zhì)地柔軟、膽管呈透明管狀結(jié)構(gòu)（圖1D）。

圖1 動(dòng)物模型大體表現(xiàn)Fig.1 General physical characteristics of the animal model

2.2 HE染色

術(shù)后3 d實(shí)驗(yàn)組肝臟組織肝細(xì)胞條索及膽管上皮細(xì)胞水腫明顯，細(xì)胞脹大，結(jié)構(gòu)紊亂，包膜不清楚；術(shù)后7 d結(jié)構(gòu)紊亂進(jìn)一步加重，部分細(xì)胞表現(xiàn)為皺縮、壞死、結(jié)構(gòu)破壞，纖維細(xì)胞增多，肝細(xì)胞條索不清；術(shù)后14 d水腫消失，壞死范圍增大，小葉間纖維組織增生，分割肝細(xì)胞，形成假小葉；21 d、28 d纖維病變進(jìn)一步加重，假小葉形成更為明顯，見圖2。

圖2 各組肝臟組織HE染色結(jié)果 ×200Fig.2 HE staining of liver tissues in each group ×200

2.3 Masson 染色結(jié)果

術(shù)后3 d開始匯管區(qū)可見少許藍(lán)色纖維，術(shù)后14 d小葉間纖維樣條索出現(xiàn)，開始形成假小葉；術(shù)后21 d纖維條索增多，連接成纖維分隔，假小葉形成；28 d肝細(xì)胞纖維病變進(jìn)一步加重，假小葉形成更加明顯。對(duì)照組肝細(xì)胞間及小葉間無(wú)纖維條索形成，見圖3。

2.4 免疫組化染色結(jié)果

圖3 各組肝臟組織Masson染色結(jié)果 ×100Fig.3 Masson staining of liver tissues in each group ×100

實(shí)驗(yàn)組肝臟組織及膽管組織中MMP-7的表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，且隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)水平總體呈增高趨勢(shì)（圖4）。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間段中MMP-19表達(dá)均低于對(duì)照組（圖5）。

圖4 各組肝臟MMP-7免疫組化結(jié)果×200 Fig.4 Immunohistochemical staining analysis of MMP-7 in liver tissues of each group ×200

圖5 各組肝臟MMP-19免疫組化結(jié)果×200Fig.5 Immunohistochemical staining analysis of MMP-19 in liver tissues of each group ×200

2.5 Western blotting檢測(cè)結(jié)果

除14 d外，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間段MMP-7的蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組（圖6A）；而實(shí)驗(yàn)組MMP-19的蛋白表達(dá)量均低于對(duì)照組，14 d時(shí)差異尤為明顯（圖6 B）。

2.6 實(shí)時(shí)PCR結(jié)果

MMP-7 mRNA在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)均高于正常對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組MMP-19 mRNA的表達(dá)均低于對(duì)照組，見表1。

圖6 各組肝臟Western blotting結(jié)果Fig.6 Western blotting for MMP-7 and MMP-19 carried out on liver samples from each group

表1 MMP-7 mRNA及MMP-19 mRNA在幼鼠肝臟中的表達(dá)Tab.1 Expression of MMP-7 and MMP-19 mRNAs in the liver from each group

3 討論

BA是一種累及肝內(nèi)外膽管的嚴(yán)重疾病，主要病理表現(xiàn)為肝內(nèi)外膽管炎癥、纖維化、消失，肝臟發(fā)生漸進(jìn)性加重的膽汁淤積性肝硬化。雖然目前對(duì)BA研究很多，但其病因仍不清、病理發(fā)生機(jī)制不詳。有研究認(rèn)為，出生前后的病毒感染與BA的發(fā)生有關(guān)，并推測(cè)在此過(guò)程中，病毒感染誘發(fā)了針對(duì)膽管上皮細(xì)胞的特異性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞持續(xù)破壞、修復(fù)，最終纖維化、消失，在此過(guò)程中涉及炎癥、免疫、凋亡等多個(gè)病理過(guò)程，多個(gè)信號(hào)通路系統(tǒng)與該過(guò)程密切相關(guān)。

眾多研究［5-7］證明，組織器官慢性損傷、炎癥纖維化過(guò)程中，MMPs發(fā)揮著重要作用。MMPs調(diào)節(jié)的蛋白水解是損傷的上皮重塑過(guò)程中改變細(xì)胞-基質(zhì)連接狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，MMPs降解細(xì)胞外基質(zhì)、分泌鈣黏蛋白、整合素等黏連分子，使細(xì)胞獲得移位功能、參加組織修復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)BDL幼鼠動(dòng)物模型肝臟組織發(fā)生了纖維化，隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，纖維化程度逐漸加重，MMP-7表達(dá)水平也隨之逐漸增加，相反，MMP-19表達(dá)持續(xù)低于正常組。

有研究［8-11］表明MMP-7在不同的細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且是多種纖維化疾病的重要調(diào)節(jié)因子。文獻(xiàn)［7，9-10］報(bào)道中提出將MMP-7作為術(shù)后檢測(cè)肝纖維化程度的一個(gè)指標(biāo)，認(rèn)為MMP-7可以作為進(jìn)展期及晚期肝纖維化的重要指標(biāo)。其他組織器官特異性纖維化過(guò)程進(jìn)展的研究［6］也發(fā)現(xiàn)了MMP-7表達(dá)水平的升高，且與較差的預(yù)后相關(guān)，如特發(fā)性肺纖維化、腎小管上皮纖維化等。MMP-19是MMPs相應(yīng)較新的成員，關(guān)于MMP-19在纖維化中的作用機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為MMP-19對(duì)組織器官的纖維化有保護(hù)作用［11-13］。

綜上所述，組織器官損傷的修復(fù)過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，其中涉及到細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑、細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)和創(chuàng)面重新上皮化，在此過(guò)程中MMPs成員作為重要的纖維化調(diào)節(jié)家族參與其中，各自發(fā)揮的作用不同，而纖維化促進(jìn)因素的增強(qiáng)與纖維化保護(hù)因素的表達(dá)減弱是與膽汁淤積性肝損傷過(guò)程中肝纖維化的逐漸進(jìn)展密切相關(guān)的。在組織器官慢性纖維化的研究中，怎樣保持兩者的平衡，使損傷的組織器官得到適當(dāng)修復(fù)、且又不過(guò)度纖維化將是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)內(nèi)容。

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Expression of Matrix Metalloproteinase-7 and -19 in Liver Tissues of Rats with Biliary Atresia

LIU Tingzheng，ZHANG Zhibo
（Department of Pediatric Surgery，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo detect the expression of matrix metalloproteinase （MMP）-7 and MMP-19 in the liver tissue of young rat models with biliary atresia （BA） and to explore their roles in progressive fibrosis.MethodsTotally 132 Wistar newborn rats were subjected to common bile duct ligation （BDL） at day 3 after birth to establish animal models of biliary atresia. Sixty-two young rats served as the control group. Liver tissues were collected at days 3，7，14，21，and 28. Immunohistochemistry，Western blotting，and RT-PCR were used to detect the expression of MMP-7 and MMP-19.ResultsThe BA models manifested cholestasis as early as 24 h after BDL. HE and Masson staining revealed progressive hepatic fibrosis. The expression of MMP-7 was observed to increase with time and was significantly higher in the experimental group when compared to control. The expression of MMP-19 was also found to gradually increase with time；however，it was lower than the control group.ConclusionMMP-7 and MMP-19 may be involved in the fibrosis of biliary atresia.

matrix metalloproteinase-7； matrix metalloproteinase-19； biliary atresia； hepatic fibrosis

R765.2

A

0258-4646（2017）12-1071-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20171130.1758.008.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.12.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（81270437）

劉亭睜（1989-），女，醫(yī)師，碩士研究生.

張志波，E-mail：zhangzb@sj-hospital.org

2017-04-10

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-11-30 17:58

（編輯 于 溪）