一種超靈敏檢測(cè)17β- 雌二醇電化學(xué)核酸適配體傳感器構(gòu)建方法

平 婧， NUANAPA Chaisuwan， 柳建設(shè)

(東華大學(xué) a． 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院；b． 國(guó)家環(huán)境保護(hù)紡織污染防治工程技術(shù)中心， 上海 201620)

一種超靈敏檢測(cè)17β- 雌二醇電化學(xué)核酸適配體傳感器構(gòu)建方法

平 婧a， b， NUANAPA Chaisuwana， b， 柳建設(shè)a， b

(東華大學(xué) a． 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院；b． 國(guó)家環(huán)境保護(hù)紡織污染防治工程技術(shù)中心， 上海 201620)

采用石墨烯(GS)-Nafion- 納米金(AuNPs)復(fù)合膜修飾玻碳電極(GCE/GS-Nafion-AuNPs)，構(gòu)建一種靈敏度高且穩(wěn)定性好的電化學(xué)核酸適配體傳感器，應(yīng)用于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物——17β- 雌二醇(E2)的快速檢測(cè).運(yùn)用透射掃描電子顯微鏡(TEM)、循環(huán)伏安(CV)法和差分脈沖伏安(DPV)法，對(duì)該傳感器的形貌和電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征.研究表明，在GS、 Nafion和AuNPs協(xié)同作用下，修飾電極的電化學(xué)性能明顯提高.在優(yōu)化試驗(yàn)條件下，傳感器的電流信號(hào)(Ip)與17β- 雌二醇(E2)的濃度(c)的對(duì)數(shù)在0．002 5～0．300 0 μmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為Ip=8．899 4+ 1．049 4 logc，相關(guān)系數(shù)為0．994 1， E2濃度檢出限為0．83 nmol/L.該傳感器制作簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢出限極低以及具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，有望應(yīng)用于環(huán)境樣品中E2的檢測(cè).

核酸適配體； 石墨烯； 納米金； 17β- 雌二醇

近幾年，由于內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals， EDCs)會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康造成不良影響而備受關(guān)注.其中雌二醇(Estradiol)是這類物質(zhì)中活性最高的天然雌激素[1]，并且極低濃度的雌二醇就可能造成生物體生殖系統(tǒng)異常[2].在實(shí)際研究中，考慮到17β- 雌二醇(E2)的活性比17α- 雌二醇強(qiáng)，一般采用17β- 雌二醇作為研究對(duì)象[3].常規(guī)E2的檢測(cè)方法主要有免疫分析方法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[5]、液相色譜法(LC)[6]等，由于這些方法一般需要較為復(fù)雜的前處理，等待時(shí)間長(zhǎng)，分析成本高，且儀器一般體積較大不易移動(dòng)，所以不能實(shí)現(xiàn)原位檢測(cè)，不適合方法的推廣和實(shí)際樣品的應(yīng)用[7-10].因此，發(fā)展一種快速、簡(jiǎn)便且高靈敏度的17β- 雌二醇(E2)分析檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.

核酸適配體(aptamer)是利用體外指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)獲得的單鏈脫氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)序列[11-12]，與抗體相比，其具有易修飾，特異性強(qiáng)，易于保存運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)[13-14]，有望取代抗體成為新一代的生物識(shí)別分子.利用核酸適配體構(gòu)建生物傳感器，并結(jié)合電化學(xué)分析方法的成本低廉、操作簡(jiǎn)便、響應(yīng)速度快等特點(diǎn)，特別適合環(huán)境痕量污染物的分析檢測(cè)[15-16].

本文以17β- 雌二醇為研究對(duì)象，采用石墨烯(GS)-Nafion- 納米金(AuNPs)復(fù)合膜修飾電極，制備一種無(wú)標(biāo)記的核酸適配體傳感器.利用成膜性好的Nafion來(lái)分散GS，隨后修飾AuNPs，在增強(qiáng)導(dǎo)電性的同時(shí)，結(jié)合適配體5’端修飾的巰基(—SH)鍵來(lái)增加適配體的固定量.優(yōu)化試驗(yàn)條件，依據(jù)結(jié)合傳感器界面電流變化與E2濃度的對(duì)數(shù)成正比來(lái)定量測(cè)定17β- 雌二醇.與其他方法相比，該傳感器具有制作過(guò)程簡(jiǎn)單、檢出限低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，有望實(shí)現(xiàn)大面積的推廣與應(yīng)用.

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器試劑

儀器：電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司， chi 760D型；移液槍，上海禾汽玻璃儀器有限公司；pH測(cè)試儀，德國(guó)WTW公司， Multi340i型；功率可調(diào)式超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)， SK2200HP型；磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司， X85-2S型恒溫版；超純水，美國(guó)賽默飛公司， EASY pure Ⅱ RF/UV型.

試劑：17β-雌二醇適配體，生工生物工程(上海)股份有限公司，其堿基序列[18]如下：

5’-SH-GCT-TCC-AGC-TTA-TTG -AAT-TAC-ACG - CAG-AGG-GTA-GCG-GCT-CTG-CGC-ATT-CAA- TTG-CTG-CGC-GCT-GAA-GCG-CGG-AAG- C-3’.

17β-雌二醇(97%+，美國(guó)Sigma)、石墨烯(南京先鋒納米材料科技有限公司)、 HAuCl4·4H2O、 K3Fe(CN)6、 Nafion(5%，美國(guó)Sigma)、無(wú)水乙醇(97%，上海禾汽化工科技有限公司)、硝酸、檸檬酸三鈉、硫酸(98%)、氯化鉀(分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司)、6- 巰基己醇(美國(guó)Sigma)、 Tris-HCl緩沖溶液(pH=7．4， Tris/EDTA(10 mmol/L/1 mmol/L))、雙酚A(>99%，生工生物工程(上海)股份有限公司)、4- 壬基酚(97%+，阿法埃莎(中國(guó))化學(xué)有限公司).

1．2 納米金制備方法

制備納米金的玻璃器皿首先在王水中浸泡24 h， 然后經(jīng)多次沖洗干凈并干燥后使用.配置1%的氯金酸水溶液于50 mL超純水(電阻率>18．2 MΩ·cm) 中，得到0．01 g/mL 氯金酸溶液.取一個(gè)圓底燒杯(100 mL)， 加入50 mL超純水，用移液槍準(zhǔn)確移取0．5 mL配置好的溶液注入其中，加入磁子，將此燒杯放入(92±4) ℃油浴鍋中，在磁子劇烈攪拌下恒溫加熱.溫度保持在92 ℃，并在持續(xù)攪拌過(guò)程中加入1．6 mL的檸檬酸三鈉[17].前1～3 min 沒(méi)有明顯變化，3～5 min之后溶液開始變藍(lán)，隨后轉(zhuǎn)為藍(lán)偏紫色，繼續(xù)恒溫?cái)嚢?，大約25～ 30 min 之后溶液變紅，隨即變?yōu)槌吻逋噶恋某燃t色，若氯金酸溶液放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，制備的溶液偏紫色.注意制備過(guò)程中須迅速加入檸檬酸三鈉溶液，并保持溫度恒定，避免制備的納米金顆粒過(guò)小.

1．3 石墨烯-Nafion復(fù)合膜的制備

在室溫條件下，將體積分?jǐn)?shù)為5%的Nafion溶液用無(wú)水乙醇稀釋至體積分?jǐn)?shù)為0．5%.用移液槍移取5 μL體積分?jǐn)?shù)為5%的Nafion溶液緩慢加入到995 μL的無(wú)水乙醇中，然后在此溶液中加入分析天平稱量好的1 mg石墨烯，放入超聲波儀器中，超聲分散2 h，得到分散均一的GS-Nafion復(fù)合膜待用.

1．4 修飾電極的制備

分別用粒徑為0．10和0．05 μm的氧化鋁粉末打磨拋光玻碳電極(GCE， 4 mm)至鏡面程度，超聲清洗10 min后晾干(室溫)，晾干過(guò)程中始終保持電極清潔．

準(zhǔn)確移取10 μL的GS-Nafion混合溶液滴于電極表面，室溫下自然晾干.取10 μL已分散好的AuNPs溶液滴涂，孵化30 min后，移取10 mL E2適配體覆蓋電極表面，恒溫孵育4 h，最后將電極浸泡在6- 巰基己醇溶液(MCH)中50 min，以封閉剩余的活性位點(diǎn).將得到的GS-Nafion-AuNPs修飾電極置于4 ℃冰箱中保存待用.

1．5 測(cè)試方法

1．5．1 修飾電極的表征方法

選擇3電極體系進(jìn)行循環(huán)伏安法的測(cè)量來(lái)表征不同修飾過(guò)程中的電流電壓特征.玻碳電極為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，氯化銀為參比電極，掃速為50 mV/s，從電位-0．2～0．6 V范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到循環(huán)伏安曲線圖并進(jìn)行下一步分析.

1．5．2 修飾電極對(duì)E2的響應(yīng)檢測(cè)

在室溫下，修飾電極在不同濃度的E2標(biāo)準(zhǔn)溶液(0．300 0、 0．050 0、 0．025 0、 0．005 0、 0．002 5 μmol/L)中于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min，然后置于5 mmol/L K3Fe(CN)6(0．1 mol/L KCl， pH=7．0)的測(cè)試底液中，選擇差分脈沖伏安(DPV)法進(jìn)行測(cè)量，間隔時(shí)間為50 ms，在電位-0．2～0．6 V范圍內(nèi)循環(huán)掃描，以峰電流值Ip對(duì)應(yīng)E2標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2 結(jié)果與討論

2．1 電極修飾材料的形態(tài)表征

GS-Nafion和GS-Nafion-AuNPs復(fù)合膜的透射電鏡圖如圖1所示.由圖1(a)可知，GS和Nafion形成了均一的復(fù)合膜.由圖1(b)可知， AuNPs被成功地修飾在的GS-Nafion復(fù)合膜上，其粒徑為12 nm左右，顆粒呈球形，分散良好，大小均勻.

(a) GS-Nafion

(b) GS-Nafion-AuNPs圖1 GS-Nafion和GS-Nafion-AuNPs復(fù)合膜的透射電鏡圖Fig．1 TEM images of the GS-Nafion and GS-Nafion-AuNPs

2．2 傳感器的電化學(xué)表征

a—GCE； b—GCE/GS-Nafio； c—GCE/GS-Nafion-AuNPs； d—GCE/GS-Nafion-AuNPs-aptamer； e—GCE/GS-Nafion-AuNPs-aptamer-MCH圖2 不同傳感器的循環(huán)伏安圖Fig．2 Cyclic voltammograms of different sensors

GCE、 GCE/GS-Nafion、 GCE/GS-Nafion-AuNPs、 GCE/GS-Nafion-AuNPs aptamer和GCE/GS-Nafion-AuNPs-aptamer-MCH在5 mmol/L K3Fe(CN)6的測(cè)試底液中的循環(huán)伏安曲線如圖2所示,掃速為50 mV/s.由圖2可知， Fe3+/Fe2+的氧化還原峰分別出現(xiàn)在+0．26和+0．19 V，F(xiàn)e3+/Fe2+電子對(duì)在電極上展現(xiàn)了最好的電流響應(yīng).根據(jù)Randles-Sevcik方程[18]，計(jì)算GCE、 GCE/GS-Nafion和GCE/GS-Nafion-AuNPs的電活性面積分別為0．076、 0．140和0．184 cm2. GS-Nafion修飾的GCE電極活性面積為未修飾的2倍， GS提高了修飾電極的比表面積和電化學(xué)性能； GS-Nafion-AuNPs修飾后的GCE電極活性面積為未修飾的3倍，證明AuNPs進(jìn)一步提高了GCE電極的電化學(xué)性能，也提高了電化學(xué)檢測(cè)方法的靈敏性.修飾上適配體后，如圖2中曲線d所示，電極的氧化/還原峰電流有所下降.這可能由于適配體本身不導(dǎo)電，阻礙了電極表面的電子傳遞，因而導(dǎo)致電流下降，說(shuō)明適配體已被成功修飾在電極上.由圖2中曲線e可知，峰電流繼續(xù)下降，證明非導(dǎo)電的MCH也已被成功修飾在電極表面.

2．3 掃速對(duì)傳感器的影響

GCE/GS-Nafion-AuNPs核酸適配體傳感器在相同測(cè)試底液中以不同掃速(50～300 mV/s)進(jìn)行掃描得到的循環(huán)伏安圖如圖3所示.由圖3可知，隨著掃速增加，峰電流明顯增加，電流與掃速成良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為Ipc=13．335 1v+1．738 7，R2=0．991 8和Ipa=-8．249 8v-1．802 54，R2=0．979 9，其中，v為掃速，Ipc為氧化電流，Ipa為還原電流. 該電極反應(yīng)受吸附過(guò)程控制.

圖3 核酸適配體傳感器在不同掃速(a～i：50～300 mV)下的循環(huán)伏安圖；插圖顯示的是氧化還原峰電流與掃描速率的依賴關(guān)系Fig．3 Cyclic voltammograms of the aptasensor at different scan rates： 50～300 mV/s; the inset shows the dependence of redox peak currents of scan rate

2．4 優(yōu)化試驗(yàn)條件

2．4．1 pH值對(duì)傳感器的影響

采用差分脈沖伏安法測(cè)量溶液pH值對(duì)E2檢測(cè)的影響，結(jié)果如表1所示，其中，I0表示適配體修飾電極峰電流值，I表示適配體與E2標(biāo)準(zhǔn)溶液結(jié)合后的峰電流值， ΔI(ΔI=I0-I)表示扣除空白后傳感器對(duì)E2的電流響應(yīng).由表1可知，當(dāng)pH=7．0時(shí)，ΔI最高，即傳感器電流響應(yīng)最好，因此測(cè)試底液選擇pH=7．0.

表1 不同pH值對(duì)適配體傳感器的影響Table 1 Effects of pH on the aptasensor

2．4．2 孵化時(shí)間對(duì)傳感器的影響

為測(cè)試適配體與樣品孵育時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響，將電化學(xué)核酸適配體傳感器放入質(zhì)量濃度為40 ng/mL的E2溶液中，在37 ℃條件下分別反應(yīng)5、 10、 15、 25、 35、 45、 55 min，用循環(huán)伏安方法測(cè)定相同條件下傳感器的電流變化，結(jié)果如圖4所示.由圖4可知，在孵育開始階段，適配體與待測(cè)物需要反應(yīng)一定時(shí)間，峰電流的變化幅度隨著時(shí)間的推移而逐漸減小，在25 min后，整個(gè)曲線區(qū)域平緩，說(shuō)明溶液中的反應(yīng)已基本達(dá)到平衡.因此，選擇試驗(yàn)的孵育時(shí)間為25 min.

圖4 孵化時(shí)間對(duì)核酸傳感器的影響Fig．4 Effects of incubation time on the aptasensor

2．5 傳感器的性能表征

將E2用Tris-HCl緩沖溶液(pH=7．4)配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(0．002 5、 0．005 0、 0．025 0、 0．050 0、 0．300 0 μmol/L)，在5 mmol/L K3Fe(CN)6的測(cè)試底液中，在優(yōu)化條件下(適配體質(zhì)量濃度為1 mg/L， 溶液pH=7．0，孵育時(shí)間為25 min)，得到差分脈沖伏安圖如圖5所示，在0．002 5～0．300 0 μmol/L 范圍進(jìn)行線性擬合得到線性回歸方程為Ip=8．899 4+1．049 4 logc，如圖6所示，其中c為E2濃度，相關(guān)系數(shù)為0．994 1，證明峰電流與E2濃度的對(duì)數(shù)之間有良好的線性關(guān)系.根據(jù)臨界檢測(cè)信號(hào)值要落在單鏈修飾電極信號(hào)的3σ偏差外的原理，計(jì)算出本文方法的E2濃度檢測(cè)限為0．83 nmol/L.

a～e代表E2濃度，分別為：0．300 0、 0．050 0、 0．025 0、 0．005 0、 0．002 5 μmol/L圖5 傳感器差分脈沖伏安曲線Fig．5 Differential pulse voltammetry of the aptasensor

圖6 擬合峰電流對(duì)E2濃度logc的線性關(guān)系圖Fig．6 Linear fitting curves of Ip and logarithm concentration of E2

2．6 傳感器的選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

為了考察核酸適配體傳感器的選擇性，考慮到實(shí)際環(huán)境中典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物并非單獨(dú)存在[19-20]，特選取其中較為典型的并且與E2結(jié)構(gòu)相似的4- 壬基酚和雙酚A作為干擾物進(jìn)行檢測(cè).在相同試驗(yàn)條件下將傳感器分別放置在相同濃度的空白樣品、4- 壬基酚和雙酚A溶液中，測(cè)定其電化學(xué)阻抗響應(yīng)值，結(jié)果如表2所示，其中，R1表示適配體與E2結(jié)合后的電極表面阻抗值，R0表示適配體修飾電極表面阻抗值， ΔR=R1-R0表示扣除空白后E2的電化學(xué)阻抗響應(yīng)值.由表2可知， ΔR越大，說(shuō)明適配體與E2的特異性結(jié)合更好， E2的阻抗響應(yīng)值遠(yuǎn)高于雙酚A和4- 壬基酚，傳感器具有良好的選擇性.

表2 核酸適配體傳感器特異性分析Table 2 Specificity of the aptasensor for different analytes Ω

為了考察核酸適配體傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，測(cè)試不同批次制備的20支修飾電極在優(yōu)化條件下(適配體質(zhì)量濃度為1 mg/L，溶液pH=7．0，孵育時(shí)間為25 min)對(duì)濃度為0．5 μmol/L E2溶液的電流響應(yīng)，ΔI的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3．2%，顯示重現(xiàn)性較好.將電化學(xué)核酸適配體傳感器置于測(cè)試底液中，掃描20圈，循環(huán)伏安圖譜顯示峰電流有所偏離，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3．8%.將制備好的電化學(xué)核酸適配體傳感器置于4 ℃條件下密閉保存，每隔3 d取出進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，測(cè)試兩周之后電流值為初始電流值的91．6%，室溫下放置的修飾電極的阻抗響應(yīng)值只有最初的67%.這是由于電極經(jīng)GS-Nafion-AuNPs修飾后，表面更加穩(wěn)定，從而可以借由適配體一端修飾的Au—S鍵提高該傳感器的穩(wěn)定性.但在室溫條件下，外界溫度變化較大，可能會(huì)引起電極表面復(fù)合膜的變化，導(dǎo)致穩(wěn)定性下降.

3 結(jié) 語(yǔ)

本文以石墨烯(GS)-Nafion-納米金(AuNPs)復(fù)合膜修飾玻碳電極，制備了一種超靈敏的核酸適配體傳感器.該傳感器利用Nafion成膜性好的特點(diǎn)來(lái)分散GS，再利用AuNPs來(lái)修飾，在增強(qiáng)導(dǎo)電性的同時(shí)，利用Au—S鍵來(lái)增加適配體的固定量，而GS的特殊結(jié)構(gòu)也提供了更多的電子轉(zhuǎn)移通道，這樣可以更好地增加傳感器的靈敏度.該傳感器具有極強(qiáng)的特異型，與其他方法相比，具有靈敏度高、成本低廉、前處理簡(jiǎn)便快捷以及可以實(shí)現(xiàn)原位檢測(cè)等特點(diǎn)，具有很好的應(yīng)用前景和實(shí)際價(jià)值，對(duì)其他環(huán)境痕量污染物的快速檢測(cè)具有借鑒意義.

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AMethodfortheUltra-sensitiveDetectionof17β-estradiolBasedonElectrochemicalAptasensor

PINGJinga， b，NUANAPAChaisuwana， b，LIUJianshea， b

(a． College of Environmental Science and Engineering；b． State Environmental Protection Engineering Center for Pollution Treatment and Control in Textile Industry， Donghua University， Shanghai 201620， China)

The graphene (GS) and nano-gold (AuNPs) were both introduced into the Nafion film to develop a new matrix as the aptasensor platform for ultrasensitive detection of typical endocrine pollutants-17β-estradiol (E2)． The morphology and electrochemical properties of the proposed sensors were characterized by transmission electron microscopy (TEM)， cyclic voltammetry (CV) and differential pulse voltammetry (DPV)． Due to the synergistic effect of GS, Nafion and AuNPs， biosensor modified by GS-Nafion-AuNPs composites exhibits excellent electrochemical performance． Under the optimized conditions， the current response of the proposed aptasensor have good linearity with the logarithm concentration of 17β-estradiol from 0．002 5 to 0．300 0 μmol/L， and the detection limit is 0．83 nmol/L． With the advantages of simple preparation， high sensitivity， low detection limit， excellent reproducibility and stability， the proposed method could be used in the determination of E2 in environmental sample．

aptamer; graphene; nano-gold; 17β-estradiol

1671-0444(2017)05-0668-06

2017-04-13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21377033，51508083)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2232015D3-22)；上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)資助項(xiàng)目(B604)

平 婧(1988—)，女，山東濟(jì)南人，博士研究生，研究方向?yàn)樗h(huán)境檢測(cè)及環(huán)境電化學(xué)生物傳感器． E-mail：pj-2011@163．com

柳建設(shè)(聯(lián)系人)，男，教授，E-mail：liujianshe@dhu．edu．cn

O 657．1

A

(責(zé)任編輯：徐惠華)