miR-124對(duì)皮層神經(jīng)細(xì)胞活力的影響

劉得水，趙阿勐，趙麗暉，王 娜，，何志磊，梁雪梅?

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

·基礎(chǔ)研究·

miR-124對(duì)皮層神經(jīng)細(xì)胞活力的影響

劉得水2，趙阿勐2，趙麗暉1，王 娜1，2，何志磊2，梁雪梅1?

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

目的探討miR-124對(duì)原代培養(yǎng)乳鼠的皮層神經(jīng)細(xì)胞活力的影響。方法原代培養(yǎng)乳鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-124或anti-miR-124并設(shè)定對(duì)照實(shí)驗(yàn)，采用LDH試劑盒分別測(cè)定1 h，3 h，6 h，12 h，24 h的LDH釋放率和神經(jīng)活力。結(jié)果過(guò)表達(dá)miR-124后的神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放率顯著低于對(duì)照組，而且神經(jīng)細(xì)胞活力顯著高于對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論miR-124可以減少神經(jīng)細(xì)胞損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

MiR-124；神經(jīng)細(xì)胞；神經(jīng)保護(hù)

microRNA（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度約為21～23個(gè)核苷酸構(gòu)成的調(diào)控性小RNA分子，它可以通過(guò)堿基配對(duì)的方式結(jié)合到靶基因mRNA 3'非翻譯區(qū)（3'UTR），從而對(duì)靶基因進(jìn)行負(fù)性調(diào)控[1]。miRNA不僅影響著機(jī)體的正常生命活動(dòng)，而且參與疾病發(fā)生的病理過(guò)程[2-3]。miRNA在機(jī)體的表達(dá)具有組織特異性，因此對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控也具有針對(duì)性[4]。神經(jīng)組織當(dāng)中也具有豐富miRNA，并對(duì)神經(jīng)突觸可塑性發(fā)揮著重要的作用。大腦miR-124表達(dá)異常與多種神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病相關(guān)[5]。本項(xiàng)目為揭示miR-124在神經(jīng)系統(tǒng)中所發(fā)揮作用，采用原代培養(yǎng)腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞并通過(guò)miR-124和其抑制劑anti-miR-124進(jìn)行干擾，觀察其對(duì)皮層神經(jīng)細(xì)胞活力的影響。

1 材料與儀器

1.1 材料

購(gòu)買(mǎi)于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)部的9周齡SPF級(jí)Sprague-Dawley（SD）大鼠，經(jīng)雌雄合籠獲得子代新生24 h的SD乳鼠。

1.1.1 試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone公司）；滅活胎牛血清（Hyclone）；miR-124 mimics，mimics control，anti-miR-124 inhibitor，anti-miRNA control（Ambion公司）；LDH試劑盒（Andy Bio公司）。

1.1.2 儀器

酶標(biāo)儀（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞及鑒定

新生24 h SD乳鼠，剝離皮質(zhì)，剪碎，800轉(zhuǎn)/min*3離心棄上清，消化。加入含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，過(guò)濾，離心棄上清。加入培液混勻，置于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，換成含神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。72 h后，加入阿糖胞苷，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組

按照不同的處理分為pre-miRNA control，premiR-124，anti-miRNA control，anti-miR-124，共4組，同時(shí)設(shè)三組平行對(duì)照。

1.2.3 轉(zhuǎn)染

接種2×105/mL個(gè)神經(jīng)細(xì)胞接種至6孔板中。細(xì)胞密度長(zhǎng)至60～70%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。配置溶液Opti-MEM培養(yǎng)基+ Lipofectamine 2000溶液，Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋pre-miRNA control/pre-miR-124或anti-miRNA control/anti-miR-124，二者輕輕混勻，室溫放置20 min。棄培液，加入Opti-MEM培養(yǎng)基，并將上述混合液加入培養(yǎng)液中。6 h后換液，置37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

采用LDH試劑盒檢測(cè)LDH釋放率轉(zhuǎn)染24 h后，重新鋪96孔板，于1 h，3 h，6 h，12 h，24 h檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-124及其抑制劑anti-miR-124對(duì)神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放率的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，體外轉(zhuǎn)染miR-124的神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放率降低，而轉(zhuǎn)染anti-miR-124顯著提高了神經(jīng)細(xì)胞的LDH釋放率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見(jiàn)圖1）。

圖1 miR-124和anti-miR-24對(duì)神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放率的影響（n=3，±s）

3 討 論

miRNA是普遍存在于生物體內(nèi)一類(lèi)小RNA，它具有非常廣的調(diào)控作用[2]。在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)細(xì)胞中也存在大量的miRNAs，它們對(duì)于神經(jīng)分化和神經(jīng)突觸可塑性具有相當(dāng)重要的作用，從而影響機(jī)體的學(xué)習(xí)與記憶等神經(jīng)系統(tǒng)功能[3]。

在顳葉癲癇患者和動(dòng)物模型腦組織中miR-124的表達(dá)均降低，這些改變提示miR-124可能參與癲癇的發(fā)生和形成過(guò)程[6]。在帕金森病中，多巴胺能神經(jīng)元的miR-124通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR通路調(diào)節(jié)神經(jīng)的細(xì)胞凋亡和自噬和保護(hù)[7]，提高腦的修復(fù)功能[8]。

本項(xiàng)目采用LDH試劑盒檢測(cè)經(jīng)miR-124及其抑制劑anti-miR-124對(duì)神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放率的影響。LDH釋放率越高，表明細(xì)胞損傷越重。隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-124能夠延緩神經(jīng)細(xì)胞的LDH的釋放率上升，提示其可能對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。而給予miR-124抑制劑anti-miR-124顯著提高了LDH的釋放率，提示其可能對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有損傷作用。本研究進(jìn)一步解釋了miR-124在神經(jīng)系統(tǒng)的功能中可能發(fā)揮重要的作用。但是miR-124表達(dá)異常在疾病發(fā)生中的作用還有待今后通過(guò)不同的動(dòng)物和細(xì)胞模型及不同的分子生物學(xué)方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

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R749.94

B

ISSN.2095-8242.2017.067.13092.02

齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（No.SFGG-201529）

梁雪梅

本文編輯：趙小龍