人催乳素受體蛋白在肛周膿腫患者中的表達及其與預后的關系

陶勇 楊關根 裘建明 徐侃 王東 汪鴻濤

人催乳素受體蛋白在肛周膿腫患者中的表達及其與預后的關系

陶勇 楊關根 裘建明 徐侃 王東 汪鴻濤

目的 探討人催乳素受體蛋白在肛周膿腫組織中的表達及其與臨床病理特征的關系，預測可能作為肛周膿腫預后的一個生物標志物。方法 收集2015年08月至2016年08月杭州市第三人民醫(yī)院肛腸外科收治的肛周膿腫行手術切排并經(jīng)病理證實的60例患者的肛管黏膜組織標本（肛周膿腫組）及臨床資料。另取年齡、性別、體重相匹配的8例單純痔病患者的肛管黏膜組織標本作為對照（對照組）。運用免疫組織化學（免疫組化）和Western blot方法檢測兩組標本中催乳素受體蛋白表達水平，并結合臨床病理資料進行統(tǒng)計分析。同時采用單因素及多因素Logistic回歸分析探討組織中PRLR表達水平與肛周膿腫預后的相關性。結果 免疫組化結果顯示，PRLR蛋白陽性的棕色顆粒主要彌漫性分布在細胞膜中，部分可見于細胞質。其中在膿腫組肛管黏膜中低表達率為68.33%（41/60）及高表達率31.67%（19/60），與對照痔病組PRLR蛋白高表達相比，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=5.701，p＜0.05）；同時Western Blot結果顯示PRLR蛋白在膿腫組中的表達灰度比值（0.515±0.067）明顯低于對照組灰度比值（0.836±0.035）（t=3.14，p＜0.01）；全組患者未愈為34例，占56.67%。其中PRLR低表達與高表達，分別為79.41%（27/41）和20.59%（7/19）。單因素及多因素分析顯示，膿腫性質（OR=7.911，95% CI：1.115~20.161，P=0.039）、膿腫切口（OR=3.246，95%CI：0.774~5.742，P=0.042）及 PRLR 低表達量（OR=9.099，95%CI：1.727~14.426，P=0.016）是肛周膿腫患者預后不良的獨立危險因素（均p＜0.05）。結論 PRLR蛋白在肛周膿腫患者肛管黏膜組織中表達顯著降低，同時低表達的PRLR對判斷手術后肛周膿腫患者預后具有較好的參考價值。

肛管； 預后； 催乳素受體； 肛周膿腫

肛周膿腫是肛腸外科常見病，每年新發(fā)病例逐漸上升，多見于年輕男性，急性發(fā)作時往往表現(xiàn)為局部紅腫熱痛，嚴重影響青壯年的生活質量［1］。目前，多認為系經(jīng)典的肛腺感染學說，關于其發(fā)病分子機制鮮有新的探索［2］。因此，進一步研究肛周膿腫形成的相關分子病理機制，尋找有助于臨床治療的指標或新靶點，是目前研究的熱點與難點。催乳素受體（prolactin receptor，PRLR），是由位于人第五號染色體的短臂（5p13-14）基因表達的產(chǎn)物，屬于Ⅰ型細胞因子受體超家族，與激素及細胞因子等信號傳遞密切相關［3］。近來研究發(fā)現(xiàn)，PRLR在多種炎性疾病組織中高表達，提示其可影響局部組織免疫微環(huán)境，在參與刺激免疫細胞增殖及產(chǎn)生炎性細胞因子機制中可能起到重要作用［4-6］。本研究采用免疫組織化學（免疫組化）和免疫印跡（Western blot）方法同時檢測肛周膿腫患者的膿腫壁組織和膿腫旁組織中PRLR蛋白的表達，結合患者的臨床資料，旨在分析人肛周膿腫壁組織PRLR蛋白的表達以及與臨床病理機制的關系。

資料與方法

一、 研究對象

肛周膿腫患者入選標準：（1）初次確診肛周膿腫［1］，且未經(jīng)任何治療；（2）排除其他感染性疾病比如炎癥性腸炎、肛管炎等；（3）排除合并嚴重的心肺肝腎疾病及溶血性疾病等。根據(jù)以上標準，收集2015年08月至2016年08月杭州市第三人民醫(yī)院肛腸外科收治的60例肛周膿腫行手術切排并經(jīng)病理證實的肛管黏膜組織標本（肛周膿腫組）及臨床資料；其中男34例，女26例，年齡21~55（35.0±7.4）歲。另取年齡、性別、體重相匹配的8例單純痔病患者的肛管黏膜組織標本作為對照（對照組）。

二、 標本收集

分別取每例患者術中標本的肛管黏膜組織，其中肛周膿腫患者組織命名為A、單純痔病患者組織命名為B，各2份；一份放入液氮中保存，另一份經(jīng)4%多聚甲醛固定后行石蠟包埋。本研究標本的收集均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，患者或其家屬簽署知情同意書。

三、 實驗儀器與試劑

鼠抗人PRLR多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）、鼠抗人α-tubulin多克隆抗體（美國ABclonal公司）、生物素化山羊抗鼠抗體（美國cell signal 公司）、免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒（購于武漢博士德生物工程有限公司）

四、 研究方法

1.免疫組織化學染色（LP方法）：（1）對肛周膿腫及單純痔病患者肛管黏膜組織標本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚5 um，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化，枸櫞酸緩沖液高溫修復抗原，PBS漂洗3次后以0.3%過氧化物氫-甲醇孵育10 min，清除內源性的過氧化物酶活性，PBS漂洗4次后滴加5% BSA封閉液，室溫孵育60 min，傾去，滴加1：100鼠抗人PRLR多克隆抗體，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS漂洗3次后，再滴加二抗，室溫孵育20 min，PBS漂洗4次，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，PBS代替一抗作陰性對照；（2）結果判斷：陰性為無染色或小于等于5%細胞胞質染色；陽性為細胞質內棕黃色顆粒（弱陽性：淡棕色胞質染色或小于25%細胞棕黃色染色；強陽性：大于或等于25%細胞胞質棕黃色）。

2.Western blot 檢測：從60例配對的肛周膿腫患者中采用隨機數(shù)表法隨機抽取挑出8例患者及全部的8例單純痔病患者，并均從標本庫中取出相應的凍存組織，用細胞蛋白裂解液提取D0和D5組織的總蛋白，測定蛋白濃度。配制分離及濃縮膠的丙烯酰胺溶液。電泳分離蛋白后濕轉法冰浴環(huán)境轉移至PVDF膜。轉移后的PVDF用5% TBSA脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后加入鼠抗人PRLR多克隆抗體（1:1 000）室溫孵育1 h。洗膜后加入生物素化山羊抗鼠抗體（1:5 000）孵育1 h。洗膜后滴加ECL試劑室溫孵育2~5 min，在暗房中曝光，顯影定影后膠片保存攝片，掃描保存為電腦文件。每例樣品均分別進行3次檢測，image J灰度分析軟件將3次獨立實驗的Western blot 結果圖片上每個特異條帶灰度值數(shù)字化，其中PRLR表達水平以PRLR和α-tubulin灰度比值表示。

五、 隨訪方法

隨訪由專門的隨訪小組通過電話、信函及復診的方式完成。療效判定標準：（1）痊愈：癥狀消失，膿腫腔和創(chuàng)面愈合；（2）未愈：治療后局部創(chuàng)面未愈，或存在局部膿腔，演變?yōu)楦丿?；或者肛周膿腫已經(jīng)治愈。但在原部位復發(fā)。隨訪3月終止。

六、 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，催乳素受體蛋白的表達量與肛周膿腫患者的臨床病理參數(shù)的關系采用χ2檢驗。采用單因素二分類Logistic回歸預測分析影響肛周膿腫預后相關的因素，將單因素分析得到的有統(tǒng)計學意義的變量納入多項Logistic回歸進行多因素分析，計算比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（95% CI），以p＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、 免疫組化結果兩組標本PRLR表達比較

免疫組化結果顯示，PRLR蛋白在肛周膿腫組（A）低表達（弱陽性）率為68.33%（41/60）及高表達（強陽性）率31.67%（19/60），與單純痔病對照組（B）PRLR蛋白高表達（強陽性）相比，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=5.701，p＜0.05）。陽性的棕色顆粒主要彌漫性分布在細胞膜中，部分可見于細胞質。圖1。

圖1 免疫組化檢測PRLR結果×100（箭頭指示）：1A肛周膿腫患者肛管黏膜標本高表達；1B肛周膿腫患者肛管黏膜標本低表達；1C痔瘡患者肛管黏膜標本高表達；1D痔瘡患者肛管黏膜標本低表達

二、 Western blot結果兩組標本PRLR表達比較

Western Blot結果顯示PRLR蛋白在肛周膿腫患者肛管黏膜組織（A）中的表達灰度比值為（0.515±0.067）明顯低于對應的單純痔病對照組（B）灰度比值（0.836±0.035）（t=3.14，P＜0.01）。見圖2。

圖2 A 兩組標本W(wǎng)estern blot相對灰度比值 圖2B兩組患者Western blot檢測PRLR蛋白電泳結果

三、 PRLR表達與肛周膿腫患者臨床病理特征的關系

PRLR蛋白表達與膿腫患者膿腫范圍（χ2=6.406，P=0.011）、膿腫性質（χ2=6.782，P=0.009）相關（均P＜0.05），而與年齡（χ2=0.960，P=0.327）、性別（χ2=0.477，P=0.490）、BMI指數(shù)（χ2=2.330，P=0.127）、藥物治療史（χ2=2.080，P=0.179）及膿腫位置（χ2=0.960，P=0.327）等無相關（均P＞0.05）（見表1）。

四、 PRLR表達與肛周膿腫預后的關系

60例肛周膿腫隨訪期間，無失訪病例。全組患者未愈為34例，占56.67%。其中PRLR低表達與高表達，分別為65.85%（27/41）和36.84%（7/19），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.450，P＜0.05）（見圖3）。單因素二分類Logistic回歸預測分析結果顯示，膿腫范圍、膿腫性質、膿腫切口及PRLR低表達量與患者預后相關（均P＜0.05）（見表2）。進一步多項Logistic回歸進行多因素分析結果顯示，膿腫性質（OR=7.911，95%CI：1.115~20.161，P=0.039）、膿腫切口（OR=3.246，95%CI：0.774~5.742，P=0.042） 及 PRLR 低表 達 量（OR=9.099，95%CI：1.727~14.426，P=0.016）是肛周膿腫患者預后不良的獨立危險因素（均P＜0.05）（見表3）。

表1 PRLR表達與肛周膿腫患者臨床病理特征的關系

圖3 PRLR高表達與低表達總體治愈率的比較

表2 PRLR表達與肛周膿腫預后的單因素關系

表3 PRLR表達與肛周膿腫預后的多因素關系

討 論

盡管對于肛周膿腫的感染機制及手術方式的研究已經(jīng)取得了較好的進展，但要闡明其分子機制仍有大量的工作需要完成，而分析肛周膿腫組織與正常組織中的蛋白差異性表達是研究其發(fā)病機制的重要途徑之一。催乳素受體（PRLR）屬于Ⅰ型細胞因子受體超家族成員，由三種不同的短型、中間型和長型結構域蛋白串聯(lián)而組成的一種模體。其中通過結構域介導蛋白質之間的相互作用，使得配體/受體結合，傳遞生物信號，調控基因表達，實現(xiàn)復雜的生物功能［7-8］。

據(jù)文獻報道，在關節(jié)炎、自身免疫性炎癥、動脈硬化、心肌炎等多種組織中，PRLR在炎性組織中表達具有特異性變化［9-12］。本研究從臨床表型入手，60例肛周膿腫肛管黏膜標本通過免疫組化和Western blot兩種實驗方法分析PRLR的表達情況。免疫組化實驗結果顯示，陽性棕色顆粒彌漫分布在細胞各處，主要以胞膜為主，也有部分分布在細胞質中，提示PRLR可能起到胞膜上的受體信號傳遞作用。而肛周膿腫組織PRLR多數(shù)成低表達，推測PRLR低表達量可能促進了肛周炎性的發(fā)展變化。相關病理亦證實［13］，PRLR受體蛋白低表達于巨噬細胞膜表面，傳遞第二信號，增強炎癥因子的表達。近年來，巨噬細胞在炎癥組織中高表達，可預測疾病的預后情況［14］。Feuerstein等［15］人研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞高度存在皮膚黏膜感染組織中。因此，本研究嘗試對比肛周膿腫患者的臨床病理資料，解釋PRLR蛋白表達與肛周膿腫的關系。結果顯示，PRLR低表達與患者的肛周膿腫范圍及膿腫復雜程度相關，進一步提示PRLR蛋白低表達與肛周膿腫形成及進展機制關系密切。Soto等［16］在研究細菌感染機制時，發(fā)現(xiàn)PRLR低表達可通過抑制對SHK-1細胞TLR1和TLR5M的免疫刺激，參與感染形成，與本實驗結果一致。而同時，Vicent Goff i n等［17］人提出PRLR表達情況可作為疾病預后的獨立指標。因此，為了進一步研究PRLR低表達情況與肛周膿腫預后關系，本研究通過建立在隨訪臨床資料與PRLR表達量的數(shù)據(jù)基礎上，進行了單因素及多因素的Logistic回歸分析。結果顯示，膿腫復雜程度、膿腫單切口及PRLR低表達量是肛周膿腫患者預后的獨立危險因素?？蛇M一步分析得出，PRLR低表達量與肛周膿腫患者未俞關系密切。已有研究表明［18］，長期未愈/復發(fā)炎癥病灶存在刺激局部組織免疫微環(huán)境，通過調節(jié)PRLR低表達量，減少誘導內源性TNF-α、IL-6和IL-β等細胞因子釋放，進而促使炎癥惡化。因此，我們推測低表達量PRLR可減少誘導或調節(jié)免疫細胞釋放炎性因子，進而參與肛周膿腫感染機制的形成及預后不良密切相關。雖然本研究的實驗結果也從臨床角度分析了上述基礎實驗的結論，但PRLR低表達受多種調節(jié)因素影響，可能需要聯(lián)合其他指標提高預測復發(fā)的敏感性和特異性。

綜上所述，人PRLR在肛周膿腫患者組織中表達顯著降低，同時低表達的PRLR對判斷術后肛周膿腫患者預后具有較好的參考價值。但是因為PRLR調節(jié)機制復雜，其是否可以作為臨床上可應用的肛瘺復發(fā)的預測指標，尚需要進一步的深入研究。

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Association of prolactin receptor experssion in human perianal abscess with postoperative prognosis

Tao Yong, Yang Guangen, Qiu Jianming, Xu Kan, Wang Dong, Wang Hongtao.
Department of Colorectal Surgery, Zhejiang Chinese Medicine University Aff i liated No.3 Hangzhou Hospital, Hangzhou 310009, China

Xu Kan, Email: 15168427344@qq.com

Objective To investigate the association of prolactin receptor (PRLR) expression in human perianal abscess with its prognosis,which may be a new prognosis biomarker of perianal abscess-related.Methods Clinical data and resection samples of 60 patients with perianal abscess identif i ed by pathology undergoing resection in our department from August 2015 to August 2016 were collected as well as 8 patients receiving only hemorroidectomy (control group), matching with perianal abscess group in age, gender and body weight. The PRLR expression in perianal abscess tissues and matched nonabscess tissues collected was detected by immunohistochemical staining and Western blotting. The associations of PRLR level with overall prognosis,clinicopathological features were analyzed, univariate and multivariate logistic regression analysis. Results Immunohistochemical staining showed that the positive brown granules were mainly distributed on the cell membrane,and also in cytoplasm partially. And the low expression of PRLR protein in perianal abscess group was 81.67% (41/60) and high espression wsa 31.67% (19/60), which was significantlyhigher than that of control group (p＜0.05). The relative gray value of Western blotting in perianal abscess tissues were 0.515±0.067, which were significantly lower than those of matched nonabscess tissues(0.836±0.035 andp＜0.05). Patients with low expression of PRLR protein had poor prognosis than those with low expression (68.85% vs. 36.84%,p＜ 0.05). Univariate and Multivariate logistic regression analysis showed that the complexity of abscess (OR=7.911, 95%CI: 1.115~20.161, P=0.039), the number of surgical incision (OR=3.246, 95%CI: 0.774~5.742, P=0.042) and the expression of PRLR protein (OR=9.099,95%CI: 1.727~14.426, P=0.016) were independent risk factors for poor prognosis of patients with perianal abscess (allp＜0.05). Conclusions PRLP expression in perianal abscess patient was low, which may be a valuable in predicting prognosis.

Anal canal; Prognosis; Prolactin receptor; Perianal abscess

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2017.06.009

杭州市科技局重點?？茖２№椖浚∟o.20160533B27；No.20150733Q28）；浙江省自然科學基金項目（No.LY15H030001；LY15H160001）

310009 杭州，浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州第三人民醫(yī)院肛腸科

徐侃，Email：15168427344@qq.com

2017-05-22）

楊明）

陶勇, 楊關根, 裘建明, 等. 人催乳素受體蛋白在肛周膿腫患者中的表達及其與預后的關系 [J/CD]. 中華結直腸疾病電子雜志, 2017, 6(6): 488-493.