γ干擾素釋放試驗(yàn)在結(jié)核病篩查的價(jià)值評(píng)估

李寶輝，趙 光，王道元，李冬暉

γ干擾素釋放試驗(yàn)在結(jié)核病篩查的價(jià)值評(píng)估

李寶輝，趙 光，王道元，李冬暉＊

目的 探討γ－干擾素釋放試驗(yàn)（IGRA）在結(jié)核病篩查的價(jià)值并構(gòu)建疾病歸屬預(yù)測(cè)模型。方法 對(duì)613例疑似結(jié)核病例進(jìn)行 IGRA 并構(gòu)建檢驗(yàn)庫(kù)，與臨床診療庫(kù)比對(duì)分析。 結(jié)果 NIFN－γ≥8．5 及 TIFN－γ－NIFN－γ≥14，96．2%患者為活動(dòng)期結(jié)核，3．8%患者抗布氏桿菌治療敏感；NIFN－γ＜8．5 及 TIFN－γ－NIFN－γ≥400，73．9%患者為活動(dòng)期結(jié)核，26．1%患者為陳舊性結(jié)核；NIFN－γ＜8．5 及 14≤TIFN－γ－NIFN－γ＜400，53．6%患者為活動(dòng)期結(jié)核，36．4%患者為潛伏期結(jié)核，9．3%患者為陳舊性結(jié)核，0．7%患者抗布氏桿菌治療敏感；TIFN－γ－NIFN－γ＜14，2．8%患者抗結(jié)核治療敏感。 結(jié)論 IGRA 在結(jié)核病篩查具有重要的意義，隨著數(shù)據(jù)庫(kù)病例的增加預(yù)測(cè)模型會(huì)更加準(zhǔn)確可靠。

γ－干擾素釋放試驗(yàn)；結(jié)核??；診斷模型

目前，結(jié)核病是全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。據(jù)2015年WHO估計(jì)，全球1/3人口感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌，每年有800－1000萬(wàn)的新近感染者，同時(shí)每年約有200萬(wàn)人口死于結(jié)核病。我國(guó)不僅是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，更是世界上僅次于印度的第二大結(jié)核病大國(guó)，結(jié)核感染導(dǎo)致的死亡人數(shù)是其他傳染性疾病總死亡人數(shù)的2倍以上［1］。結(jié)核病的臨床表現(xiàn)多樣，可以累及全身各個(gè)系統(tǒng)，以肺部感染為主，但肺外結(jié)核病往往被其他病癥掩蓋，給臨床診斷帶來(lái)極大的困難。結(jié)核菌素皮試（tuberculin test，TST）是長(zhǎng)期以來(lái)用以快速診斷結(jié)核感染的重要手段，然而TST存在諸多缺陷：在易受結(jié)核感染的免疫力低下人群中，其檢驗(yàn)敏感性反 而 越 低［2］。 結(jié) 核 菌 素 純 蛋 白 衍 生 物 （purified protein derivative of tuberculin，PPD） 是20多種蛋白的混合物，其中很多是非結(jié)核分枝桿菌及卡介苗的共同抗原成分，在普遍接種BCG的地區(qū)造成非常高的假陽(yáng)性［3］。此外，皮試的操作和結(jié)果解釋存在主觀依賴性，降低了檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。而目前診斷結(jié)核病的有效指標(biāo)為病原學(xué)檢查，然而抗酸染色檢出率低，培養(yǎng)耗時(shí)，故臨床出現(xiàn)大量的菌陰結(jié)核?。?］。

γ－干擾素釋放試驗(yàn) （interferon－gamma release assays，IGRA）是細(xì)胞免疫的體外診斷技術(shù)，樣本易得，因此被美國(guó)疾病預(yù)防控制中心 （center for disease control，CDC）推薦作為卡介苗接種地區(qū)結(jié)核病篩查的首選方法［5］。該文欲評(píng)估IGRA在結(jié)核疑似病例篩查中的價(jià)值，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法構(gòu)建結(jié)核病預(yù)測(cè)模型。

1 資料與方法

1.1 一般資料 該研究納入了2015年10月—2017年2月于解放軍150中心醫(yī)院住院的疑似結(jié)核病例613例，其中結(jié)核分枝桿菌T細(xì)胞檢測(cè)試驗(yàn)陽(yáng)性患者252例（男 169例，女83例），陰性患者361例（男237例，女124例）。兩組病例年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0．73）。項(xiàng)目經(jīng)該院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) （1）活動(dòng)性結(jié)核病例。依據(jù)臨床指征，通過(guò)菌培、涂片染色、結(jié)核菌素試驗(yàn)或X線、CT或MRI檢查診斷活動(dòng)性結(jié)核，最重要的是抗結(jié)核治療有效的病例。（2）陳舊性結(jié)核病例。臨床無(wú)潮熱、盜汗和午后低熱等結(jié)核中毒病癥，菌培、涂片染色無(wú)結(jié)核桿菌蹤跡，并且X線、CT或MRI檢查病灶與之前無(wú)變化的自愈或治愈病例。（3）潛伏性結(jié)核病例。排除活動(dòng)性結(jié)核、陳舊性結(jié)核、其他微生物感染，并且結(jié)核分枝桿菌T細(xì)胞檢測(cè)試驗(yàn)陽(yáng)性的病例。

在 γ－干擾素（interferon－γ，IFN－γ）釋放試驗(yàn)陽(yáng)性樣本中，活動(dòng)性結(jié)核病173例，平均年齡（50．3±21．6）歲；陳舊性結(jié)核病 20 例，平均年齡（53．1±18．2）歲；潛伏性結(jié)核病 55 例，平均年齡（52．4±20．3）歲。

1.3 IFN-釋放試驗(yàn) 結(jié)核分枝桿菌T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（體外釋放酶聯(lián)免疫法，北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司），基本步驟如下：取待檢患者外周靜脈血4 ml于BD肝素鋰抗凝真空采血管，檢驗(yàn)技師需在2 h內(nèi)分別取1 ml分裝入試劑盒的N、T、P三個(gè)培養(yǎng)管；將培養(yǎng)管置入37℃恒溫箱溫育 （22±2）h后，置于5000 rpm離心機(jī)中離心10 min得待測(cè)N、T、P三個(gè)培養(yǎng)管血漿。將20 μl樣品稀釋液和50 μl N、T、P血漿依次依序加入微孔板的 N、T、P三孔，置入37℃恒溫箱溫育1 h；取出微孔板并分別加入50 μl酶標(biāo)試劑 （辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IFN－γ抗體），再次置入37℃恒溫箱溫育1 h；取出微孔板并用稀釋20倍的洗滌液（不低于2．5%的表面活性劑）洗滌微孔板5次后，拍干微孔板中殘余液體，依次加入50 μl顯色液A （不低于0．3 g/L的過(guò)氧化物）和 50 μl顯色液 B （不低于 0．2 g/L 的 3，3'，5，5'－四甲基聯(lián)苯胺），并再次置入37℃恒溫箱溫育15 min；取出微孔板并加入50 μl終止液（濃度不高于2 mol/L的硫酸）后，用酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出N、T、P三個(gè)培養(yǎng)管中IFN的含量。

結(jié)果判定：當(dāng) NIFN－γ≤400，無(wú)論 PIFN－γ－NIFN－γ為何值，TIFN－γ－NIFN－γ≥14，并且≥NIFN－γ/4，結(jié)果為陽(yáng)性；當(dāng)NIFN－γ≤400， 并且 PIFN－γ－NIFN－γ≥20，TIFN－γ－NIFN－γ＜14，或＜NIFN－γ/4，結(jié)果為陰性；其他結(jié)果為不確定。 TIFN－γ－NIFN－γ=結(jié)核 T 細(xì)胞檢測(cè)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 該研究所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均由Matlab 7．0 軟件計(jì)算。P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)陰性病例研究 該研究納入病例613例，檢測(cè)陰性361例，占58．9%。其中10例符合活動(dòng)性結(jié)核病例的診斷標(biāo)準(zhǔn) （見(jiàn)1．2），γ－干擾素釋放試驗(yàn)的診斷特異度為97．2%。此10例抗結(jié)核治療敏感病例詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

2.2 檢測(cè)陽(yáng)性病例研究 該研究納入病例613例，檢測(cè)陽(yáng)性252例，占41．1%。其中活動(dòng)性結(jié)核病173例，陳舊性結(jié)核病20例，潛伏性結(jié)核病55例，抗布氏桿菌治療敏感病例4例。見(jiàn)表2。

表1 檢驗(yàn)陰性特殊病例

表2 檢測(cè)陽(yáng)性群體中抗布氏桿菌治療敏感病例信息

2.3 高活動(dòng)期結(jié)核診斷區(qū)間 將NIFN－γ分割成以0．5 為間距的區(qū)間（［2 2．4］、［2．5 2．9］等），以 NIFN－γ為橫坐標(biāo)，并分別以各區(qū)間內(nèi)檢驗(yàn)陽(yáng)性病例數(shù)和臨床活動(dòng)性結(jié)核病例數(shù)為縱坐標(biāo)作圖。當(dāng)NIFN－γ≥8．5時(shí)，各區(qū)間內(nèi)檢驗(yàn)陽(yáng)性病例數(shù)和臨床陽(yáng)性病例數(shù)趨于相等。 但是， 在區(qū)間 ［9．5 9．9］、［14．5－14．9］和［36．5 36．9］分別有一例臨床不符活動(dòng)期結(jié)核病例，而這三例也在隨后的檢查檢驗(yàn)中被證實(shí)為布氏桿菌感染，并且抗布氏桿菌治療敏感。也就是說(shuō)，當(dāng)NIFN－γ≥8．5時(shí)，檢驗(yàn)陽(yáng)性病例排除了陳舊性結(jié)核病例和潛伏性結(jié)核病例，該法檢驗(yàn)特異度為96．0%。同時(shí)，納入的78例病例中，96．2%被確診為活動(dòng)期結(jié)核。見(jiàn)圖1。

圖1 檢驗(yàn)陽(yáng)性病例和臨床陽(yáng)性病例在NIFN-γ區(qū)間分布圖

2.4 低潛伏期結(jié)核診斷區(qū)間 檢驗(yàn)陽(yáng)性患者中NIFN－γ≥8．5 的病例剔除后， 將 PIFN－γ分割成以 0．5 為間距的區(qū)間，以此為橫坐標(biāo)，并分別以各區(qū)間內(nèi)檢驗(yàn)陽(yáng)性病例數(shù)和臨床活動(dòng)性病例數(shù)及陳舊性病例數(shù)為縱坐標(biāo)。當(dāng)PIFN－γ≥400時(shí)，各區(qū)間內(nèi)檢驗(yàn)陽(yáng)性病例數(shù)和臨床活動(dòng)性病例和陳舊性病例數(shù)相等。也就是說(shuō)，當(dāng)PIFN－γ≥400時(shí)，檢驗(yàn)陽(yáng)性病例排除了潛伏性結(jié)核病例，特異度為100%。同時(shí)，納入的23例病例中，73．9%被確診為活動(dòng)期結(jié)核。見(jiàn)圖2。

圖2 活動(dòng)期結(jié)核和陳舊性結(jié)核在PIFN-γ≥400上分布圖

2.5 一般陽(yáng)性病例 剔除高活動(dòng)期結(jié)核診斷區(qū)間和低潛伏期結(jié)核診斷區(qū)間病例后，該組共納入151例檢驗(yàn)陽(yáng)性病例（59．9%）。其中，81例被診斷為活動(dòng)期結(jié)核，55例被確診為潛伏期結(jié)核，14例被確診為陳舊性結(jié)核。同時(shí)，1例經(jīng)抗布氏桿菌治療有效。

3 討論

結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)寄生菌，侵入機(jī)體后，被巨噬細(xì)胞吞噬后引發(fā)機(jī)體固有免疫發(fā)應(yīng)，而吞噬了結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞被纖維包裹形成肉芽腫而使感染局限；但是固有免疫不足以抑制大多數(shù)活動(dòng)期結(jié)核患者體內(nèi)結(jié)核菌的生長(zhǎng)增殖；待巨噬細(xì)胞凋亡后，樹(shù)突狀細(xì)胞將其釋放的結(jié)核菌特異性抗原加工并呈遞給CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和rdT細(xì)胞，引發(fā)機(jī)體獲得性免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生特異性效應(yīng)T細(xì)胞和記憶細(xì)胞［6］。IGRA是細(xì)胞免疫的體外診斷技術(shù)，其原理正是基于人體感染結(jié)核菌后，可產(chǎn)生特異性T細(xì)胞，這些T細(xì)胞再次接觸結(jié)核特異性抗原后可被激活，并分泌INF－γ。目前，已有25個(gè)國(guó)家（美國(guó)、瑞士、英國(guó)等）和2個(gè)國(guó)際組織（世界衛(wèi)生組織和歐盟疾病預(yù)防控制中心）將IGRA列入結(jié)核診療指南。

呂云峰等［7］納入125例患者用于評(píng)價(jià)IGRA在兒童結(jié)核病診斷中準(zhǔn)確性，結(jié)果示IGRA法敏感度為85．1%，特異度為94．1%，均明顯高于PPD試驗(yàn)，且不受年齡、卡介苗接種與否以及接觸史等影響。舒景等［8］納入68例患者用于比較IGRA與TST在早期肺結(jié)核者診斷中的準(zhǔn)確性，結(jié)果示IGRA的靈敏度為90．3%，明顯優(yōu)于TST，可適用于老齡患者以及低齡患者，有助于活動(dòng)性肺結(jié)核的早期快速診斷。趙磊等［9］納入 52例患者用于比較 IGRA、PPD 以及結(jié)核抗體試驗(yàn)在診斷人獲得性免疫缺陷綜合征合并結(jié)核病患者中的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示IGRA陽(yáng)性率為80．77%，明顯高于其他三組，是診斷HIV感染合并TB的敏感方法。

IGRA一直被應(yīng)用于機(jī)體是否感染過(guò)結(jié)核菌的篩查，是結(jié)核菌感染的輔助診斷手段，不能區(qū)分判別機(jī)體現(xiàn)結(jié)核菌感染狀態(tài)［10］。然而，本文將臨床診療庫(kù)和IGRA檢驗(yàn)庫(kù)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了IGRA用于判別活動(dòng)期結(jié)核、潛伏期結(jié)核或陳舊性結(jié)核的一些方法， 并給出以下疾病歸屬預(yù)測(cè)：（1）NIFN－γ≥8．5 ＆TIFN－γ－NIFN－γ≥14，96．2%患者為活動(dòng)期結(jié)核，3．8%患者抗布氏桿菌治療敏 感 ；（2）NIFN－γ＜8．5 ＆ TIFN－γ－NIFN－γ≥400，73．9%患者為活動(dòng)期結(jié)核，26．1%患者為陳 舊 性 結(jié) 核 ； （3）NIFN－γ＜8．5 ＆ 14≤TIFN－γ－NIFN－γ＜400，53．6%患者為活動(dòng)期結(jié)核，36．4%患者為潛伏期結(jié)核，9．3%患者為陳舊性結(jié)核，0．7%患者抗布氏桿菌治療敏感；（4）TIFN－γ－NIFN－γ＜14，2．8%患者抗結(jié)核治療敏感。

當(dāng)肺外結(jié)核（胸膜、脊柱）感染，痰液細(xì)菌學(xué)檢測(cè)無(wú)能為力時(shí)，IGRA血液學(xué)檢查為結(jié)核診斷提供了新的途徑；菌陰、結(jié)核抗體陰性，IGRA為結(jié)核診斷提供了新的證據(jù)；菌培周期長(zhǎng)，迫切需要調(diào)整用藥，IGRA為結(jié)核治療提供了保障。相信IGRA在結(jié)核病的篩查、診斷和治療中會(huì)扮演越來(lái)越重要的角色。

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Value evaluation on interferon-gamma release assays in screening of tuberculosis LI Bao－h(huán)ui，ZHAO

Guang，WANG Dao－yuan，et al．Department of Central Laboratory，the 150th Central Hospital of PLA，Luoyang，Henan 471031，China

Objective To explore the value of interferon－gamma release assays（IGRA） used in screening of tuberculosis （TB），and to build its diagnostic model．Methods Comparing with their database of clinical diagnosis and treatments，authors enrolled 613 suspected tuberculosis patients and created database of IGRA laboratory diagnostics．Results NIFN－γ≥8．5 ＆ TIFN－γ－NIFN－γ≥14，96．2%was active TB，3．8%was sensitive to anti－Brucella therapy；NIFN－γ＜8．5 ＆ TIFN－γ－NIFN－γ≥400，73．9% was active TB，26．1%was old TB；NIFN－γ＜8．5 ＆ 14≤TIFN－γ－NIFN－γ＜400，53．6%was active TB，36．4%was latent TB，9．3%was old TB，0．7%was sensitive to anti－brucella therapy；TIFN－γ－NIFN－γ＜14，2．8% was sensitive to anti－TB therapy．Conclusion There is significant value of IGRA in screening tuberculosis，and with the rise of database，the diagnostic model would be more accurate．

IGRA；Tuberculosis；Diagnostic model

R730．43

A

10．14172/j．issn1671－4008．2017．10．011

471031河南洛陽(yáng)，解放軍150醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（李寶輝，趙光，王道元，李冬暉）

李冬暉，Email：bjhmli@163．com

［2017－05－08 收稿，2017－06－03 修回］ ［本文編輯：劉一洋］