魏 鳳,李 峰,張文通,苗立中,沈志強(qiáng),
(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東 濱州 256600;2.山東綠都生物科技有限公司,山東 濱州 256600)
一例豬圓環(huán)病毒3型病料的PCR檢測
魏 鳳1,李 峰1,張文通2,苗立中1,沈志強(qiáng)1,2
(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東 濱州 256600;2.山東綠都生物科技有限公司,山東 濱州 256600)
為弄清引起山東省沾化縣某養(yǎng)豬場病豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的病原,采用PCR檢測及序列測序分析,確診病原含有豬圓環(huán)病毒3型。這個病例的確診,顯示該區(qū)域有豬圓環(huán)病毒3型的流行,為當(dāng)?shù)胤酪卟块T開展針對該病防控提供理論依據(jù)。
豬圓環(huán)病毒3型;PCR;檢測
2015年6月,研究人員從美國北卡羅萊納州某養(yǎng)豬場利用宏基因組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一種新型豬圓環(huán)病毒,即豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)[1]。2016年至今,我國多個研究機(jī)構(gòu)如華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病研究室、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家生豬育種工程中心、山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所等都報道了豬圓環(huán)病毒3型在我國流行的情況[2]。
PCV3基因組有2 000個堿基組成,主要編碼Cap和Rep兩個基因。PCV3 Cap基因編碼214個氨基酸殘基,Rep基因編碼297個氨基酸殘基[3]。PCV3 Cap基因編碼的氨基酸殘基較PCV2少19~20個。PCV3毒株主要分為3a和3b兩群,其中3a和美國報道PCV3毒株處于同一進(jìn)化分支[4]。
目前研究表明,PCV3在我國豬場抗原陽性率高達(dá)12.7%,而血清陽性率高達(dá)48.02%[4]。PCV3對豬致病性及PCV2疫苗能否阻止PCV3的侵襲已成為從事生豬疫病研究人員迫切需要研究的課題。筆者于2017年9月10日,利用PCR及測序,確診了從山東省沾化縣某豬場送檢濱州畜牧獸醫(yī)研究院門診的病死豬組織中含有PCV3。
山東省沾化縣某豬場病死豬(約60日齡)肺臟及腹股溝淋巴結(jié)。
病毒DNA基因組提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;TaKaRa Ex Taq、10×Ex Taq Buffer、dNTP Mixture、pMD18-T、BamHI、HindШ 載 體 均購自寶生物工程(大連)有限公司;UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司;DH5a菌種由濱州畜牧獸醫(yī)研究院保存。
參照文獻(xiàn)[5]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成PCV3檢測引物,PCR擴(kuò)增核苷酸預(yù)期為338 bp。引物序列為:P1:5′-CCACAGAAGGCGCTAT GTC-3′,P2:5′-CCGCATAAGGGTCGTCTTG-3′。
將無菌采集的病料組織,按照1∶3比例添加滅菌的0.85%氯化鈉水溶液,用勻漿器進(jìn)行研磨;懸液反復(fù)凍融3次;然后以12 000 r/min離心處理;離心的上清液用0.22 μm濾器過濾除菌并保存?zhèn)溆?。過濾后的菌液一部分用作提取DNA基因組的模板。
取部分濾液用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。以該基因組為模板,用P1和P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增 25 μL 體系,具體為:10×Ex Taq Buffer 2.5 μL、dNTP Mixture(20 mmol/L)1 μL、P1 和 P2(引物濃度均 20 μmol/L) 各 0.5 μL、TaKaRa Ex Taq 0.5 μL、模板DNA 5 μL,添加水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min,94 ℃ 45 s,62 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,35個循環(huán)后,72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。
將擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收,具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。將回收到的PCR產(chǎn)物,連接到pMD18-T載體上,經(jīng)BamHⅠ和HindШ雙酶切鑒定正確后,送往上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。用DNAStar軟件對測序結(jié)果與GenBank上報道的PCV2基因核苷酸序列同源性進(jìn)行分析。
疑似PCV3感染病料的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴(kuò)增到了與預(yù)期大小338 bp相符的片段,結(jié)果見圖1。根據(jù)PCR鑒定結(jié)果初步判定該豬場的病料為PCV3陽性。
圖1 PCV3的PCR擴(kuò)增結(jié)果
將鑒定正確克隆質(zhì)粒送去上海生工測序。測序結(jié)果顯示:PCV3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物338 bp,序列如下:CGACGATTCCACAGAAGGCGCTATGTCAGA AGAAAACTATTCATTAGGAGGCCCACAGCTGGC ACATACTACACAAAGAAATACTCCACCATGAAC GTCATTTCCGTTGGAACCCCTCAGAATAACAAGC CCTGGCACGCCAACCACTTCATTACCCGCCTAAA CGAATGGGAAACTGCGATTAGCTTTGAATATTAT AAGATACTAAAGATGAAAGTTACACTCAGCCCT GTAATTTCTCCGGCTCAGCAAACAAAAACTATGT TCGGGCACACAGCCATAGATCTAGACGGCGCCT GGACCACAAACACTTGGCTCCAAGACGACCCTTA TGCGGA;將測序結(jié)果在 NCBI里進(jìn)行 Blast,該核苷酸序列與搜索到的其他PCV同源性在97%~99%。
利用PCR及測序確診感染PCV3的養(yǎng)豬場來自山東省沾化縣。該養(yǎng)豬場規(guī)模50多頭母豬,發(fā)病豬零星死亡,多保育階段仔豬死亡。剖檢病變主要為腹股溝淋巴結(jié)腫大,切面嚴(yán)重出血;肺臟間質(zhì)性肺炎;腎臟有壞死點。使用多種抗生素治療無效。該豬場未進(jìn)行PCV2苗的免疫。
下一步工作:一是需要弄清該豬場PCV3的來源;二是跟蹤調(diào)查附近區(qū)域豬場PCV3流行情況;三是開展PCV3分離及全基因組測序研究。開展下一步工作的同時,需向有關(guān)部門通報PCV3的研究結(jié)果,以引起豬場及行業(yè)主管的重視。
[1] 翁善鋼.一種新的豬圓環(huán)病毒—豬圓環(huán)病毒3型[J].養(yǎng)豬,2017(4):64.
[2] 賀會利,李軍,潘艷,等.廣西首例豬圓環(huán)病毒3型的發(fā)現(xiàn)及其衣殼蛋白序列分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2017(8):1499-1503.
[3] 湛洋,王東亮,王乃東,等.豬圓環(huán)病毒3型檢測及其Cap結(jié)構(gòu)序列和抗原性預(yù)測分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2017,48(6):1076-1084.
[4] 咸文,梁海英,曾智勇,摘譯.豬圓環(huán)病毒3型的鑒定與遺傳特征分析[J].豬業(yè)科學(xué),2017,34(7):32-33.
[5] Palinski R,Pi?eyro P,Shang P,et al.A novel porcine circovirus distantly related to known circoviruses is associated with porcine dermatitis and nephropathy syndrome and reproductive failure[J/OL].J Virol,2016,doi:10.1128/JVI.01879-16.
PCR Detection for One Case of Porcine Circovirus Type 3
WEI Feng1,LI Feng1,ZHANG Wentong2,MIAO Lizhong1,SHEN Zhiqiang1,2
(1.Shandong Binzhou Animal Science&Veterinary Medicine Academe,Binzhou 256600,China;2.Shandong LvDu Biological Technology Co.,Ltd.,Binzhou 256600,China)
To find out pathogen of multisystem failure case from a scale pig farm in Zhanhua county,Shandong Province,the pathogen was diagnosed with porcine circovirus type 3 by polymerase chain reaction diagnosis and sequence sequencing analysis.The diagnosis of this case shows that the area has the prevalence of porcine circovirus 3 and provides a theoretical basis for the prevention and control of the disease in the local epidemic prevention department.
porcine circovirus type 3;polymerase chain reaction;detection
S858.282.65+9.2
A
1002-1957(2017)06-0099-02
2017-10-10
山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊項目(SDAIT-08-17)
魏 鳳(1979-),女,河南遂平人,助理研究員,碩士,主要從事獸用生物制品研究.E-mail:hzndzwt1@163.com
(編輯:富春妮)