云貴高原銀星竹鼠的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)研究

丁雪梅， 顏岳輝， 劉潮， 王海波， 唐利洲*

(1.西南林業(yè)大學(xué)，昆明 650224； 2. 曲靖師范學(xué)院，云南高原生物資源保護與利用研究中心，云南曲靖 655011)

云貴高原銀星竹鼠的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)研究

丁雪梅1， 2， 顏岳輝1， 2， 劉潮2， 王海波2， 唐利洲2*

(1.西南林業(yè)大學(xué)，昆明 650224； 2. 曲靖師范學(xué)院，云南高原生物資源保護與利用研究中心，云南曲靖 655011)

作為一類營地下生活的嚙齒動物，銀星竹鼠Rhizomyspruinosus具有較高的食用價值和藥用價值，已成為我國南方地區(qū)特種經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)的重點發(fā)展物種。以核內(nèi)重組蛋白激活基因1(RAG1)的基因片段為分子標(biāo)記，采用分子生物學(xué)方法，本研究對來自12個采樣點的173個銀星竹鼠個體進行群體遺傳分析，探討該物種群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。序列多態(tài)性分析結(jié)果顯示，銀星竹鼠RAG1基因部分序列848 bp，共檢測出多態(tài)性位點18個，其中單突變位點3個，簡約信息位點15個。遺傳多樣性分析表明，173份樣本共統(tǒng)計出RAG1基因單倍型11個，單倍型多樣性為0.712±0.025，核苷酸多樣性為0.002 64±0.003 71，顯著低于其他嚙齒動物。最大似然法、鄰接法和貝葉斯法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，銀星竹鼠群體分化為3個分支，其譜系地理格局出現(xiàn)明顯分化。同時，分子變異分析結(jié)果證實，銀星竹鼠種群間的遺傳變異極顯著高于種群內(nèi)的，說明該物種存在顯著的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化水平。上述研究結(jié)果綜合表明，銀星竹鼠群體的遺傳多樣性水平較低，遺傳分化結(jié)構(gòu)較為顯著，這可能與該物種的地下生活方式、擴散能力弱、山脈河流阻隔作用、地質(zhì)氣候事件等因素有關(guān)。本研究結(jié)果將為云貴高原地區(qū)物種多樣性、生物多樣性保護提供科學(xué)的參考依據(jù)。

銀星竹鼠；重組激活蛋白基因1；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)；云貴高原

銀星竹鼠Rhizomyspruinosus，又名花白竹鼠、粗毛竹鼠，隸屬嚙齒目Rodentia鼴形鼠科Spalacidae竹鼠亞科Rhizomyinae竹鼠屬Rhizomys，為營地下生活的小型哺乳動物，主要分布于我國華南、西南廣大地區(qū)以及東南亞等國的竹林和芒草地生境(徐龍輝，1984；Wilson & Reeder，2005；Linetal.，2014；胡舒展，2016)。該物種擴散遷移能力較弱，大多數(shù)棲息生境處于海拔1 000 m以下，且必須有主要食物——竹類和芒類植物分布(徐龍輝，1984；陳松等，2000；卓智龍，2012)。有關(guān)銀星竹鼠的基礎(chǔ)研究主要涉及其行為學(xué)、動物地理學(xué)和形態(tài)學(xué)等，并已基本探明了該物種的形態(tài)特征、分布區(qū)域、棲息環(huán)境、洞穴結(jié)構(gòu)、行為習(xí)性、食性和繁殖特性(黃季琦等，1957；張榮祖等，1958；徐龍輝，1984；卓智龍，2012)。亦有研究人員對該物種的染色體組型、體內(nèi)寄生的馬爾尼菲青霉菌、生理生化指標(biāo)及人工馴養(yǎng)等進行了相關(guān)研究(徐龍輝，1984；李菊裳，1986；黃滿盈，陸含華，1990；張旋等，1996；吳易等，2004；羅宏等，2008；莊曉晟，2008；宋興超，2009；張容芳等，2011；張勇等，2012；卓智龍，2012；陳永軍等，2014；何國慶等，2015)，但研究工作尚較為基礎(chǔ)。Zhao等(2013)采用分子生物學(xué)方法測定了銀星竹鼠的線粒體基因組，并與盲鼴鼠Spalaxcarmeli和高原鼢鼠Eospalaxbaileyi進行了比較分析。除此之外，有關(guān)銀星竹鼠分子生態(tài)學(xué)和群體遺傳學(xué)等的研究工作還未見報道。

銀星竹鼠屬國家保護的有益的或者有重要經(jīng)濟價值和科學(xué)研究價值的陸生野生動物，已被報道兼有較好的食用價值和藥用價值，成為我國南方地區(qū)特種經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)的重點發(fā)展物種(陳永軍等，2014；何國慶等，2015)。目前，人工馴化養(yǎng)殖和規(guī)?；B(yǎng)殖群體的繁殖、病害防控、純繁保種等都必須掌握群體的遺傳背景資料，否則大量的人工馴養(yǎng)和繁殖容易導(dǎo)致銀星竹鼠近交衰退、品種退化、遺傳多樣性喪失等不良后果，嚴(yán)重制約養(yǎng)殖業(yè)及產(chǎn)業(yè)化的持續(xù)健康發(fā)展。值得重視的是，近年來，受到森林砍伐、生境破壞、環(huán)境污染及亂捕濫殺等不良因素的綜合影響，野生動物類群的生存狀況及物種多樣性面臨著巨大的挑戰(zhàn)，野生群體的分布范圍已明顯縮減，地理種群的個體數(shù)量已顯著下降，人類活動干擾的加劇勢必對物種的遺傳多樣性造成不可估量的影響(黃康，2014；劉鑄，2014)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已有研究表明線粒體基因?qū)賳斡H遺傳，而核基因DNA為雙親遺傳標(biāo)記，能夠更全面地代表雙親的進化歷史和遺傳信息，其中DNA重組激活基因1(recombination activating gene 1，RAG1)是脊椎動物特異性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵核基因，已被廣泛用于脊椎動物DNA水平序列分析和生態(tài)學(xué)研究(馬春艷等，2012；袁小愛等，2012；Schenketal.， 2013)，但在銀星竹鼠保護遺傳學(xué)和分子生態(tài)學(xué)的研究中還未見報道。綜上所述，本研究擬基于RAG1基因分析野生銀星竹鼠群體的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)，揭示可能存在的潛在影響因素，從而為銀星竹鼠的物種多樣性保護及養(yǎng)殖業(yè)的遺傳改良和品種選育提供有效的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1樣本采集

173份樣本分別采自云南怒江、大理、保山、德宏、臨滄、紅河、普洱、西雙版納、玉溪、昭通以及四川雅安、福建龍巖(表1)。每份樣品取肌肉組織約20 g，置于1.5 mL EP管中，用95%乙醇固定保存，帶回實驗室。

1.2基因組總DNA提取、PCR擴增與測序

采用北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供的基因組DNA提取試劑盒抽提總DNA。

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫已有銀星竹鼠RAG1基因序列(KC953574.1)，由華大基因公司設(shè)計引物進行PCR擴增，引物序列為：RAG1F(5’-GACCTGGAAAGTCCAGTAAAGTCC-3’)；RAG1R (5’-CTTTTC-GTCATATCCGGTGCCC-3’)。反應(yīng)體系50 μL：1 μL DNA模板，上下游引物各1 μL，25 μL 2×Easy Taq PCR Supermix(TRANSGEN BIOTECH)，22 μL ddH2O。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存。擴增產(chǎn)物混合2 μL 6×Loading buffer凝膠加樣緩沖液在瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。PCR擴增產(chǎn)物送昆明碩擎生物科技有限公司測序。

1.3數(shù)據(jù)分析

利用Chromas 2.62 (Kyte & Doolittle，1982)、Seqman (Allex & Shavlik，1999)進行同源排序，并適當(dāng)手動校對。利用DnaSP 5.10(Rozas & Rozas，1995)統(tǒng)計序列的保守位點、變異位點、單突變位點、簡約信息位點、多態(tài)位點數(shù)。運行DnaSP 5.10分析群體單倍型多樣性、核苷酸多樣性及其標(biāo)準(zhǔn)差。以MrModeltest 2.2(Nylander，2004)估計核苷酸最適模型，以GenBank數(shù)據(jù)庫下載的褐家鼠Rattusnorvegicus(NM053468.1)作為外群，利用MEGA 6.0(Tamuraetal.，2013)和MrBayes 3.2.5(Jahneretal.，2015)分別構(gòu)建銀星竹鼠群體單倍型間的最大似然(Maximum Likelihood，ML)樹、鄰接(Neighbor-Joining，NJ)樹和貝葉斯(Bayesian inference，BI)樹。以 GTR+G為最優(yōu)模型，對各分支置信度進行重復(fù)10 000次的自舉值檢驗(bootstrap)構(gòu)建ML樹，并以距離法(distance method)重復(fù)10 000次構(gòu)建NJ樹。構(gòu)建BI樹選用最適模型GTR+G，運算1 000萬代，每100代取樣一次，去掉(burnin)運算開始25%的不可信區(qū)域，直到鏈的收斂，即分裂頻率平均標(biāo)準(zhǔn)差(the average standard deviation of split frequencies)小于0.01停止運算。用Tree View 1.6.6(Weir，1990)查看并編輯BI樹。運行NETWORK 5.0(Richardsetal.，1996)，利用中連法(Median-joining Method)構(gòu)建銀星竹鼠群體單倍型間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分支圖。利用Arlequin 3.5(Excoffier & Lischer，2010)的分子變異分析(Analysis of molecular variance，AMOVA)(Excoffieretal.，1992)模塊進行群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析。

表1 銀星竹鼠采集樣本的地理信息Table 1 The geographical information of Rhizomys pruinosus samples

2 結(jié)果

2.1序列比對與多樣性信息

銀星竹鼠173份樣本的RAG1基因序列測定結(jié)果顯示，獲得RAG1基因部分序列長度848 bp，其中保守位點830個，變異位點共18個，包括單突變位點3個，簡約信息位點15個，無插入、缺失位點。銀星竹鼠群體的核苷酸多樣性為0.002 64±0.003 71，173條序列共檢測出單倍型11個(Hap1～Hap11，登錄號：MF318512～MF318522)，單倍型多樣性為0.712±0.025。

2.2系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的ML樹、NJ樹、BI樹表明(圖1)，銀星竹鼠群體分化為3個地域性分支，即單倍型Hap1、Hap11組成第一分支，第二分支為Hap9，第三分支由Hap2～8和Hap10組成。NJ樹和BI樹構(gòu)建了與ML樹相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(未顯示)。由中連法構(gòu)建單倍型間的網(wǎng)絡(luò)分支圖顯示出與系統(tǒng)進化樹相同的結(jié)果，銀星竹鼠群體出現(xiàn)明顯的地理種群分化(圖2)。

2.3群體遺傳結(jié)構(gòu)

兩類系統(tǒng)進化樹的群體遺傳結(jié)構(gòu)AMOVA分析結(jié)果顯示(表2)，銀星竹鼠種群間的遺傳變異組分為1.690 20，種群內(nèi)的變異組分為0.279 60，二者占總遺傳變異組分的比率分別為85.81%、14.19%，固定指數(shù)達到0.858 06，二者差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。分析結(jié)果充分說明，種群間的遺傳變異遠遠高于種群內(nèi)，即銀星竹鼠群體存在極顯著的種群遺傳結(jié)構(gòu)與高水平的遺傳分化。

3 討論

遺傳多樣性分析結(jié)果表明，基于核基因RAG1的銀星竹鼠群體單倍型多樣性為0.712±0.025，核苷酸多樣性為0.002 64±0.003 71。與此同時，云貴高原地區(qū)嚙齒動物類群的遺傳多樣性研究結(jié)果顯示，瀾滄江姬鼠Apodemusilex群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.993、0.021，分別為銀星竹鼠群體的1.39倍和7.95倍(Liuetal.，2012)。其次，青藏高原東南緣橫斷山區(qū)相關(guān)譜系地理研究結(jié)果同樣表明，中華姬鼠Apodemusdraco群體的遺傳分化明顯，單倍型多樣性和核苷酸多樣性均較高，分別達到0.989和0.036 8(Fanetal.，2012)，為銀星竹鼠群體的1.39倍和11.36倍。而同屬地下嚙齒動物類群的青藏高原高原鼢鼠和甘肅鼢鼠Eospalaxcansus的遺傳多樣性則有較大差異，高原鼢鼠群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.964和0.053，而甘肅鼢鼠的僅為0.953 2、0.006 36(Tang & Hafner，2010；蔡振媛等，2015)。銀星竹鼠群體的核苷酸多樣性顯著低于地上鼠類(如姬鼠類)，亦低于同類地下鼠類(如鼢鼠類)且表現(xiàn)出極顯著的譜系地理遺傳結(jié)構(gòu)。這種偏低的遺傳多樣性和明顯的譜系格局可能與地下鼠類特殊的生活習(xí)性、擴散遷移能力、地質(zhì)氣候歷史等密切相關(guān)(Tang & Hafner，2010；Fanetal.，2012；Liuetal.，2012；蔡振媛等，2015)。首先，與其他地下嚙齒動物相似，銀星竹鼠營地下掘土生活，具有較強的領(lǐng)域性，主要依賴地下洞道系統(tǒng)擴散和尋找食物，擴散遷移能力相對較弱，可能造成其群體內(nèi)基因交流相對受限，繼而出現(xiàn)顯著的群體譜系地理分化格局(蔡振媛等，2015；劉麗，2016；蘇軍虎等，2017)。其次，銀星竹鼠的生境為云貴高原地區(qū)的高山竹林區(qū)和芒草分布區(qū)，而此類區(qū)域相對地質(zhì)地貌獨特、氣候環(huán)境多樣、山脈河流分布集聚，獨特的典型生境特征可能造成其群體內(nèi)種群間的地理隔離，而隔離生境有可能成為群體顯著性遺傳結(jié)構(gòu)形成的主要外在因素，這在其他地下嚙齒動物類群的相關(guān)研究中得到了證實(蔡振媛等，2007，2015；周樂等，2007；方鐵，2009；Tang & Hafner，2010；劉鑄，2014；蘇軍虎等，2017)。最后，已有研究表明，云貴高原及其毗鄰地區(qū)更新世的氣候變化、地質(zhì)運動及主要冰期事件成為影響該地域動物類群種群爆發(fā)、遺傳分化、譜系結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性形成的主要原因(Chenetal.，2010；Lietal.，2012；Liuetal.，2012；Yueetal.，2012)，這也同樣有可能成為銀星竹鼠遺傳多樣性較低和顯著性遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的重要歷史因素，這有待在今后的研究中進一步驗證。

表2 銀星竹鼠群體遺傳結(jié)構(gòu)AMOVA分析Table 2 AMOVA analysis of genetic structure in Rhizomys pruinosus populations

圖1 銀星竹鼠群體單倍型間的最大似然樹Fig. 1 The Maximum Likelihood tree of Rhizomys pruinosus haplotypes

分支以上的數(shù)字分別是鄰接樹和貝葉斯樹的自舉值； 而最大似然樹自舉值顯示在分支的下面。

The numbers above the branches are the bootstrap values of Neighbor-Joining tree and Bayesian inference tree， respectively； Maximum Likelihood tree bootstrap values are shown under the branches.

圖2 銀星竹鼠群體的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖
Fig. 2 The median-joining network relationship ofRhizomyspruinosushaplotypes

每個實心圓圈代表一種單倍型； 實心圓大小與單倍型頻率呈正比； 圓圈代表缺失單倍型； 每條線代表1步突變。

Each solid cycle means a haplotype； the size of solid circles is proportional to haplotype frequency； the cycle represents missing haplotypes (not sampled or extinct)； each line represents one mutation step.

總而言之，本研究中的銀星竹鼠群體存在顯著的譜系地理結(jié)構(gòu)和較低的遺傳多樣性水平，其成因可能與其地下生物學(xué)特征有關(guān)，同樣有來自地質(zhì)歷史氣候事件和地理隔離作用的綜合影響。然而，本研究僅用了核基因為標(biāo)記進行銀星竹鼠群體遺傳多樣性水平、遺傳結(jié)構(gòu)及其成因的分析，其分子標(biāo)記可能存在一定的局限性，可以采取多態(tài)性更高和信息量更大的分子標(biāo)記方法，如微衛(wèi)星、單核苷酸多態(tài)性、簡化基因組測序等。因此，今后的研究還需要將多個分子標(biāo)記相結(jié)合，以更廣泛的樣點覆蓋區(qū)域，獲取更全面的銀星竹鼠群體遺傳學(xué)信息，為其保護遺傳學(xué)和分子生態(tài)學(xué)等研究工作的開展及家養(yǎng)群體的遺傳改良提供更有效的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

致謝：本研究受云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進化重點實驗室、云南省高校云南特境內(nèi)生菌資源開發(fā)與利用科技創(chuàng)新團隊的資助，在此一并予以感謝!

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StudyonGeneticDiversityandGeneticStructureofRhizomyspruinosus

DING Xuemei1， 2， YAN Yuehui1， 2， LIU Chao2， WANG Haibo2， TANG Lizhou2*

(1. Southwest Forestry University， Kunming 650224， China； 2. Center for Yunnan Plateau Biological Resources Protection and Utilization， Qujing Normal University， Qujing， Yunnan Province 655011， China)

As a subterranean fossorial rodent，Rhizomyspruinosushas high edible and medicinal value and has become an important animal species for the development of special economic animal breeding industry in South China. By using molecular biological methods， this research intends to adopt a molecular marker of nuclear recombination activating gene 1 (RAG1) to investigate the population genetics of 173 individuals from 12 sampling sites， as well as the genetic diversity and phylogeographical structure ofR.pruinosus. Polymorphism analysis ofR.pruinosusRAG1 gene showed that there were 18 polymorphic sites in the total 848 bp， including 3 single mutation sites and 15 parsimony informative sites. The results of genetic diversity analyses discovered that there were 11 haplotypes from 173 individuals’ estimation. The haplotype diversity and nucleotide diversity were 0.712±0.025 and 0.002 64±0.003 71， respectively， and these were all significantly lower than that from the estimates of other rodents. The phylogenetic trees constructed by the methods of Maximum Likelihood， Neighbor-Joining and the bayesian tree showed that，R.pruinosusgroups diverged to three clades， indicating that obvious differentiation happened in the phylogeographical pattern of this species. In addition， the results of molecular variance analyses approved that the genetic variation among the populations ofR.pruinosuswas extreme significantly higher than that within populations. This suggested that there were significant differentiation of genetic diversity and genetic structure in total groups of this species. These results comprehensively showed that there were low genetic diversity and remarkable genetic structure inR.pruinosusgroups， and these were related with the important factors of subterranean life style， weak distribution ability， mountain river barrier and geological events. These findings will provide a scientific basis for the species diversity and biodiversity protection in the Yunnan-Guizhou Plateau.

Rhizomyspruinosus； recombination activating gene 1； genetic diversity； genetic structure； Yunnan-Guizhou Plateau

10.11984/j.issn.1000-7083.20170168

2017-05-23接受日期2017-08-11

國家自然科學(xué)基金項目(31260087， 31460561)

丁雪梅(1995—)， 女， 碩士研究生， 主要從事野生動物多樣性及保育研究， E-mail：13769857574@163.com

*通信作者Corresponding author， E-mail：tanglizhou@163.com

Q75； Q959.837

A

1000-7083(2017)06-0657-06