鹽提和堿提酸沉兩種方法提取腰果蛋白的結(jié)構(gòu)及其功能性質(zhì)分析

彭 倩，顏小燕，李雨婷，梁 露，劉成梅*，王 芳

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

鹽提和堿提酸沉兩種方法提取腰果蛋白的結(jié)構(gòu)及其功能性質(zhì)分析

彭 倩，顏小燕，李雨婷，梁 露，劉成梅*，王 芳

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

使用鹽提和堿提酸沉兩種提取方法從腰果脫脂粉中提取分離蛋白，并對(duì)比研究鹽提腰果蛋白（CNSPI）和堿提酸沉腰果蛋白（CNPI）的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)。結(jié)果表明CNPI和CNSPI在結(jié)構(gòu)、微觀形態(tài)、功能性質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值等方面有明顯差異，CNSPI蛋白含量較高，溶解性和乳化性也優(yōu)于CNPI，CNPI表現(xiàn)出較好的起泡性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明兩種提取方法對(duì)分離蛋白的亞基組成沒有顯著影響；本研究使用氨基酸分析儀來測(cè)定分離蛋白的營養(yǎng)價(jià)值，結(jié)果表明兩種方法提取的腰果蛋白氨基酸含量無明顯差異，其營養(yǎng)價(jià)值都遠(yuǎn)高于腰果脫脂粉。表面疏水性測(cè)定結(jié)果表明CNPI的表面疏水性顯著高于CNSPI。掃描電子顯微鏡結(jié)果表明CNSPI呈現(xiàn)出大量的片狀微觀結(jié)構(gòu)，而CNPI呈現(xiàn)出少量球狀和薄片結(jié)合成的不規(guī)則形狀。圓二色光譜結(jié)果顯示CNSPI和CNPI中主要二級(jí)結(jié)構(gòu)是β-折疊，CNPI中有較多的無規(guī)卷曲，約占29.3%，CNSPI有較多的α-螺旋（27.0%）。在中性條件下，CNPI的起泡性為119.00%，CNSPI的乳化性達(dá)到30.14 m2/g。

腰果蛋白；功能性質(zhì)；微觀結(jié)構(gòu)；二級(jí)結(jié)構(gòu)；堿提酸沉法；鹽提法

腰果（Anacardium occidentale Linnaeus）又名槚如樹、雞腰果或者介壽果，是一種腎形堅(jiān)果，在全世界范圍內(nèi)廣泛種植，為世界著名四大堅(jiān)果之一[1]。我國是亞洲腰果主要的生產(chǎn)國之一，于20世紀(jì)40年代開始引入種植，目前主要產(chǎn)地分布于云南、海南等地區(qū)[2]。

腰果作為一種經(jīng)濟(jì)型油料作物，具有優(yōu)良的營養(yǎng)功能和藥用價(jià)值，腰果仁含有46%的脂肪，高于常用食用油加工原料大豆（約20%）、花生（約43%）等，可作為制備食用油的原料，脂肪酸分析表明腰果仁油中主要為不飽和脂肪酸，其中油酸和亞油酸的比例高達(dá)73%和11%[3]，且富含多種維生素和微量元素，如VA、VB1、VB2以及錳、鎂、硒等，腰果仁油具有抗氧化、防衰老和抗腫瘤的作用[4]。此外，腰果仁中還含有21%的蛋白質(zhì)，與花生（約23%）、葵花籽（約20%）等堅(jiān)果種子蛋白含量相當(dāng)，榮瑞芬[5]的研究表明，腰果蛋白的氨基酸種類和含量與人體氨基酸模式十分相近，是一種營養(yǎng)價(jià)值很高的優(yōu)質(zhì)蛋白。

腰果蛋白具有其他動(dòng)、植物蛋白無可比擬的營養(yǎng)價(jià)值，目前國內(nèi)外對(duì)于腰果加工還停留在初級(jí)階段，關(guān)于腰果的研究主要集中在腰果粉的物化性質(zhì)[6]、腰果仁油的提取分析[7]及腰果仁分離蛋白和濃縮蛋白的功能性[8-9]，蛋白抗原性[10]等。食品工業(yè)中榨油后的腰果粕一般用于動(dòng)物飼料，為了減少資源浪費(fèi)，提高產(chǎn)品附加值，從腰果粕中提取蛋白質(zhì)具有極大的實(shí)用意義。目前對(duì)于油料植物蛋白的提取主要有水提法、有機(jī)溶劑提取法、酶法和膜分離等方法[11]，其中水提法因操作簡單、提取率高而廣泛用于各種植物蛋白的提取中，堿提酸沉法是蛋白提取的經(jīng)典方法，已經(jīng)成功運(yùn)用于大豆、花生和油菜籽等蛋白的提取，鹽提法提取蛋白條件溫和，在保證提取率的同時(shí)能較大程度保持蛋白活性[12]。在本課題組的前期研究中，對(duì)腰果分離蛋白的提取工藝優(yōu)化[13]和腰果蛋白的功能性質(zhì)研究[14]進(jìn)行了報(bào)道。在進(jìn)一步的研究過程中，課題組發(fā)現(xiàn)提取方法的不同會(huì)造成腰果蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的差異性。本研究結(jié)合腰果蛋白的特性，在前期鐘俊楨等[13]關(guān)于腰果蛋白提取工藝優(yōu)化的研究基礎(chǔ)上，選用堿提酸沉和鹽提兩種方法得到分離蛋白，對(duì)比分析蛋白微觀結(jié)構(gòu)變化對(duì)功能性質(zhì)的影響，以期為腰果蛋白加工及新產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生腰果（W320）產(chǎn)自越南，4 ℃下保存待用。

8-苯胺基-1-萘磺酸鈉（8-a n i l i n o-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、Tris、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、過硫酸氨（ammonium persulphate，AP）、N,N,N’,N’-四甲基乙二氨（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED） 北京索萊寶生物科技有限公司；其他所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FreeZone 12-Plus真空冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司；LXJ-IIBB高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；K9840半自動(dòng)凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器有限公司；Ultra-Turrax T25高速分散機(jī) 德國IKA公司；UV-1600PC紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；F-4500熒光分光光度計(jì)、L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀日本Hitachi公司；Mini-Protean Tetra Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司；MOS-450圓二色譜（circular dichroism，CD）儀 法國Bio-Logic公司。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

腰果用高速粉碎機(jī)粉碎，以1∶4（m/V）的料液比加入沸程30～60 ℃的石油醚，室溫下磁力攪拌20 h，布氏漏斗抽濾分離油脂，重復(fù)3 次脫脂后于通風(fēng)櫥中揮干石油醚，過60 目篩后收集，即得腰果脫脂粉（DCNF），保存在4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 堿提酸沉腰果蛋白的制備

將脫脂粉與去離子水以料液比1∶10（m/V）混合，并用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為9.0，室溫下磁力攪拌30 min，4 800 r/min離心30 min后收集上清液，殘?jiān)鼜?fù)提一次，合并兩次上清液，并用1 mol/L HCl溶液調(diào)整pH值為4.6，4 800 r/min離心20 min后收集沉淀，水洗沉淀并調(diào)pH值至中性，4 ℃下經(jīng)6～8 kD透析袋透析72 h，凍干得到堿提酸沉腰果蛋白（CNPI）粉末，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 鹽提腰果蛋白的制備

脫脂粉與0.05 mol/L含有0.1 mol NaCl的Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）以1∶10（m/V）的料液比混合，室溫下磁力攪拌2 h，4 800 r/min離心30 min后收集上清液，重復(fù)離心兩次以便進(jìn)一步分離上清液中的不溶性殘留物，收集上清液于4 ℃下透析（6～8 kD）72 h，再次離心30 min后收集沉淀即為得到鹽提腰果蛋白（CNSPI），凍干后保存在4 ℃下備用。

1.3.4 腰果蛋白的性質(zhì)測(cè)定

1.3.4.1 蛋白質(zhì)提取率的測(cè)定

采用Bradford法[15]，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，考馬斯亮藍(lán)G250染色，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝0.004 5X-0.010 6，R2＝0.996 9。按式（1）計(jì)算蛋白提取率。

1.3.4.2 蛋白質(zhì)純度的測(cè)定

采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量（換算系數(shù)5.30），按式（2）計(jì)算蛋白質(zhì)純度。

1.3.4.3 溶解度測(cè)定

取50 mg腰果蛋白分散在25 mL去離子水中，常溫下磁力攪拌30 min，用0.1 mol/L的HCl溶液或0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為3～9之后磁力攪拌30 min，再于4 800 r/min離心15 min，使用福林-酚法測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)含量。用BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線，取50 mg腰果蛋白溶于25 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液中，磁力攪拌1 h后離心過濾，測(cè)得溶液中蛋白含量為總蛋白含量。溶解度按照式（3）計(jì)算。

1.3.4.4 起泡性和泡沫穩(wěn)定性測(cè)定

蛋白質(zhì)的起泡性和起泡穩(wěn)定性參照Lassissi等[16]的方法測(cè)定，取50 mg腰果蛋白均勻分散在10 mL 0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buf f ered saline，PBS）中，記錄最初體積為V0/mL，用Ultra-Turrax T25分散機(jī)分散均質(zhì)，轉(zhuǎn)速10 000 r/min高速分散2 min后記錄體積為V1/mL，放置30 min后的體積記為V2/mL。

1.3.4.5 乳化性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[17]測(cè)定腰果蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性。取60 mg腰果蛋白于6 mL 0.01 mol/L pH 7.0的PBS中，攪拌分散30 min后加入2 mL大豆油，然后使用Ultra-Turrax T25分散機(jī)以轉(zhuǎn)速20 000 r/min 均質(zhì)1 min，從底部吸取50 μL，立即與5 mL 0.1 g/100mL SDS 混合5 s，于500 nm波長處測(cè)定吸光度A0。10 min后再次吸取50 μL乳狀液與5 mL 0.1 g/100 mL SDS溶液混合均勻，在500 nm波長處測(cè)吸光度A10。乳化性和乳化穩(wěn)定性計(jì)算如式（6）、（7）所示。

式中：ρ為稀釋前的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）；L為光程（1 cm）；φ為形成乳液的油的體積分?jǐn)?shù)（0.25%）；DF為稀釋倍數(shù)（100）。

1.3.4.6 表面疏水性測(cè)定

表面疏水性采用ANS作熒光探針的方法測(cè)定[18]，即配制1 mg/mL的腰果蛋白溶液，并用磷酸緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度為0.002～0.020 mg/mL，取稀釋后的腰果蛋白溶液4 mL，加入20 μL ANS溶液后渦旋振蕩，避光靜置10 min后搖勻，使用F-4500熒光光度計(jì)測(cè)定蛋白樣品的熒光強(qiáng)度（f l uorescence intensity，F(xiàn)I）。以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)I為縱坐標(biāo)作圖，曲線的斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)（H0），以此表征表面疏水性。

1.3.4.7 氨基酸分析

精確稱量50 mg腰果蛋白，再加入10 mL 6 mol/L的HCl溶液，1 g苯酚進(jìn)行水解，在110 ℃真空條件下水解24 h后冷卻，之后混勻過濾，定容至50 mL。使用L-8800自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4.8 SDS-PAGE分析

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）根據(jù)Laemmli等[19]的方法并略作改動(dòng)。電泳凝膠分別是5%的濃縮膠和12%的分離膠。

1.3.4.9 圓二色光譜分析

蛋白質(zhì)溶于0.01 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖溶液中，制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的腰果蛋白溶液，使用MOS-450圓二色譜儀掃描遠(yuǎn)紫外區(qū)域（190～250 nm），掃描8 次取平均值。用Dichro Web網(wǎng)站Contin程序分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)并進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4.10 微觀結(jié)構(gòu)觀察

根據(jù)參考文獻(xiàn)[20]的方法，使用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)。凍干后的CNPI和CNSPI粉末均勻置于貼有導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，噴金處理，觀察成像時(shí)加速電壓30 kV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有的實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3 次取平均值，使用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析，Tukey法比較平均值之間的差異性（p＜0.05）。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種方法提取腰果蛋白的微觀形貌差異

圖1 兩種方法提取腰果蛋白的SEM圖Fig. 1 SEM images of cashew nut protein obtained by different extraction methods

CNSPI純度（蛋白質(zhì)含量）為80.7%，提取率為40.12%，CNSPI純度為91.4%，提取率為24.10%。由圖1可知，3 種物質(zhì)在微觀形態(tài)上面差異明顯，如圖1A中DCNF有明顯的簇狀球形蛋白，分子直徑約為4 μm；圖1B中CNSPI顆粒較小，形狀不規(guī)則，部分蛋白質(zhì)出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，表面凹凸不平；圖1C中CNPI呈現(xiàn)較大的片狀結(jié)構(gòu)，無球狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，表面較平整。對(duì)比兩種提取方法下蛋白的微觀形貌可以看出，酸堿處理蛋白使其結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，多肽鏈展開使它從團(tuán)聚的球狀變?yōu)檩^大的片狀結(jié)構(gòu)，螺旋展開使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更為疏松，可能會(huì)暴露出較多的疏水基團(tuán)。同時(shí)，毛曉英[21]指出這種片狀結(jié)構(gòu)有利于蛋白質(zhì)溶解度的增加。

2.2 表面疏水性分析結(jié)果

圖2 兩種方法提取腰果蛋白的表面疏水性質(zhì)Fig. 2 Surface hydrophobicity of cashew nut extracted by different methods

H0反映了蛋白質(zhì)分子疏水基團(tuán)的暴露程度，與內(nèi)部蛋白的球狀結(jié)構(gòu)和變性程度有關(guān)，如圖2所示，CNPI的H0為2 171.00，顯著高于CNSPI（1 706.11）（p＜0.05），DCNF的H0最低，僅為1 592.25，在Papalamprou等[22]報(bào)道的關(guān)于鷹嘴豆分離蛋白的研究中，堿提酸沉蛋白的表面疏水性也高于超濾法和酸提與超濾相結(jié)合提取的蛋白，堿提酸沉蛋白的H0更高，可能是由于在蛋白提取過程中，堿提酸沉蛋白經(jīng)過酸堿處理后暴露出更多的疏水基團(tuán)與ANS結(jié)合，從而得到較高的表面疏水性指數(shù)，這種現(xiàn)象可能暗示著變性程度越高，蛋白的表面疏水性越高[23-24]。Karaca等[12]的研究也表明酸沉處理易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使天然結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的疏水基團(tuán)。而鹽提蛋白是通過蛋白質(zhì)吸附鹽離子后彼此排斥并使其與水之間的相互作用增強(qiáng)而達(dá)到提取蛋白的目的，蛋白能較大程度地保持天然構(gòu)象[25]，因而表現(xiàn)出較低的表面疏水性。蛋白質(zhì)的表面疏水性能顯著影響其功能性質(zhì)，田斌強(qiáng)等[26]的研究表明燕麥蛋白起泡性變化趨勢(shì)與疏水性較為一致。

2.3 SDS-PAGE分析結(jié)果

圖3 兩種方法提取腰果蛋白在非還原（A）和還原（B）條件下的SDS-PAGE圖譜Fig. 3 SDS-PAGE pro fi les of cashew nut protein under non-reducing (A) and reducing (B) conditions

生腰果蛋白、DCNF、CNPI、CNSPI在非還原條件（圖3A）和還原條件下（圖3B）的SDS-PAGE圖譜如圖3所示。在非還原條件下，所有的條帶都表現(xiàn)出很高的相似性，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量在19～53 kD之間，出現(xiàn)了7 個(gè)主要條帶，分子質(zhì)量分別為19、21、32、34、40、45、53 kD，其中53 kD的條帶濃度最大，加入β-巰基乙醇后，蛋白質(zhì)的亞基分布發(fā)生了變化，40、45 kD的條帶消失，在原來的基礎(chǔ)上新增了23、24、26、27 kD 4 條小分子條帶，53 kD條帶的濃度明顯變小，而21 kD和32 kD的條帶明顯加深，這是因?yàn)?3 kD的肽鏈斷開了二硫鍵，形成了兩條分子質(zhì)量分別為21 kD和32 kD的條帶。

DCNF、CNPI和CNSPI的亞基組成沒有明顯區(qū)別，這表明不同提取方法對(duì)腰果蛋白質(zhì)亞基組成沒有顯著性差異，由此可推測(cè)CNPI和CNSPI在功能性質(zhì)上的差異可能是由于在提取過程中構(gòu)象發(fā)生了改變。

2.4 氨基酸分析結(jié)果

表1 兩種方法提取腰果蛋白的氨基酸組成對(duì)比分析Table 1 Comparative amino acid compositions of DCNF, CNPI and CNSPI

DCNF、CNPI、CNSPI的氨基酸組成如表1所示，并以FAO/WHO/UNU推薦兒童和成人標(biāo)準(zhǔn)作為參照，脫脂粉與分離蛋白的氨基酸組成表現(xiàn)出明顯差異，DCNF各種氨基酸含量普遍偏低，CNPI和CNSPI的必需氨基酸含量較高，纈氨酸、異亮氨酸含量都能達(dá)到兒童標(biāo)準(zhǔn)，芳香族氨基酸、含硫氨基酸、亮氨酸和蘇氨酸含量能滿足成人需求，而DCNF中必需氨基酸含量僅能滿足成人需求。谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸占腰果蛋白氨基酸比例較高，這與許多植物種子儲(chǔ)藏蛋白一致，賴氨酸是腰果蛋白的第一限制性氨基酸。有研究表明，精氨酸與賴氨酸比越高，越能降低心血管疾病的發(fā)生幾率，CNSPI具有較高的精氨酸與賴氨酸比，有降低人體膽固醇含量、保護(hù)心血管的作用。從氨基酸含量來看，兩種方法提取的腰果蛋白無明顯差異，進(jìn)一步說明提取方法不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)組成造成顯著影響。

2.5 腰果蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

表2 兩種方法提取腰果蛋白與市售大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成Table 2 Secondary structures of cashew nut protein prepared by different methods compared with SPI

CD用來估計(jì)腰果蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，并以研究較為成熟的市售大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）作為對(duì)照，二級(jí)結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CNPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)由11.9% α-螺旋、35.0%的β-折疊、23.8%的β-轉(zhuǎn)角和29.3%的無規(guī)卷曲組成，而CNSPI的α-螺旋含量高于CNPI，為15.8%，β-折疊含量為34.9%，與CNPI相當(dāng)，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量分別為22.3%和27.0%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明β-折疊和無規(guī)卷曲是腰果蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)，這與大豆蛋白、蕎麥種子蛋白和白木通蛋白等相似。與CNSPI相比酸堿處理后的CNPI在α-螺旋含量上呈顯著性降低（p＜0.05），無規(guī)卷曲含量呈顯著性升高（p＜0.05），說明CNPI結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，失去了有序的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這可能是蛋白提取的環(huán)境所致[27]。CNPI和CNSPI在二級(jí)結(jié)構(gòu)組成上的差異說明酸堿處理后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化，進(jìn)而影響了功能性質(zhì)。

2.6 腰果蛋白溶解度測(cè)定結(jié)果

圖 4 兩種方法提取腰果蛋白溶解度曲線Fig. 4 Solubility prof i les of cashew nut protein extracted by different methods

溶解度是蛋白質(zhì)發(fā)揮功能性質(zhì)的先決條件，蛋白質(zhì)需形成溶液才能更好地表現(xiàn)出功能性質(zhì)[28]，起泡性、乳化性和凝膠性質(zhì)都與溶解性密切相關(guān)，因此，探究不同pH值下的蛋白質(zhì)溶解度對(duì)其功能性質(zhì)的研究和應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。由圖4可知，在pH 3～9之間，CNPI和CNSPI的溶解度呈“V”型曲線，CNPI和CNSPI的溶解度在pH 5.0左右都達(dá)到最小值，分別為4.02%和1.12%，這一結(jié)果與Ogunwolu等[9]報(bào)道的腰果蛋白在等電點(diǎn)處溶解度最低相同，這是由于等電點(diǎn)附近分子凈電荷較低，分子之間作用力減弱，容易凝聚產(chǎn)生沉淀，由此造成了溶解度的降低。另外，CNSPI在pH 3和pH 9附近幾乎接近完全溶解，pH 3時(shí)溶解度高達(dá)98.10%，在酸性環(huán)境中的溶解度優(yōu)于堿性；CNPI在pH 10時(shí)獲得最大溶解度為70.42%，低于CNSPI，但在中性pH值下CNPI的溶解度顯著高于CNSPI（p＜0.05），分別為35.36%和25.85%，這表明CNSPI對(duì)pH值更敏感，這一結(jié)果也與CNPI SEM圖呈現(xiàn)出較多有利于蛋白質(zhì)溶解的片狀結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)。兩種蛋白質(zhì)在溶解性質(zhì)上差異明顯，與CNPI相比，CNSPI表現(xiàn)出更好的溶解性。CNSPI在pH 3和pH 9的狀態(tài)下溶解度遠(yuǎn)高于CNPI，在蛋白提取過程中使用酸處理會(huì)降低蛋白溶解度，這與劉大川等[29]的發(fā)現(xiàn)一致，這種現(xiàn)象可被解釋為在提取過程中，酸處理使蛋白分子展開，提高了表面疏水性。

2.7 腰果蛋白功能性質(zhì)測(cè)定結(jié)果

表3 兩種方法提取腰果蛋白的功能性質(zhì)Table 3 Functional properties of CNPI and CNSPI compared with BSA

兩種方法提取的蛋白質(zhì)和脫脂粉起泡性和起泡穩(wěn)定性差異如表3所示，并以起泡性質(zhì)和乳化性質(zhì)優(yōu)良的BSA作為對(duì)照[27]。如表3所示，中性條件下BSA起泡性為249.00%，遠(yuǎn)高于CNPI（119.00%）、CNSPI（89.70%）和DCNF（23.33%），蛋白質(zhì)的起泡性能表征蛋白質(zhì)擴(kuò)散、吸水和分子在空氣-水相界面快速展開重排的能力，因此較好的溶解性和松散的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)的起泡性質(zhì)至關(guān)重要，CNPI在中性條件下具有較高的溶解度，蛋白與水相的相互作用較密集，提高了蛋白質(zhì)分子包裹空氣的能力[30]，相對(duì)的其起泡性質(zhì)也較好，CNSPI與DCNF中可能含有更多的非柔性球狀蛋白，限制了它在空氣-水相界面的展開重排，從而降低了起泡能力。這一推測(cè)與SEM顯示的DCNF有明顯的簇狀球蛋白，CNSPI中蛋白質(zhì)出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象相一致。起泡穩(wěn)定性是由蛋白質(zhì)溶液的流變學(xué)性質(zhì)決定的，BSA的起泡穩(wěn)定性最好，為169.00%，CNPI的起泡穩(wěn)定性為86.70%，顯著高于CNSPI（60.00%）（p＜0.05）。在中性條件下，CNPI的溶解度大于CNSPI，溶液中CNPI的蛋白濃度較高，蛋白質(zhì)間分子作用較強(qiáng)，溶液中黏度較大，因而呈現(xiàn)出較好的泡沫穩(wěn)定性[31]。

2.8 腰果蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

蛋白的乳化性質(zhì)主要包括乳化性和乳化穩(wěn)定性，乳化性是衡量蛋白質(zhì)幫助形成穩(wěn)定乳液的能力，乳化穩(wěn)定性是衡量乳液在一定時(shí)間內(nèi)保持其結(jié)構(gòu)的能力[17]，腰果脫脂粉及分離蛋白在中性環(huán)境下的乳化性質(zhì)如表3所示。用不同方法提取的腰果蛋白在中性環(huán)境下的乳化性和乳化穩(wěn)定性具有顯著性差異（p＜0.05），CNSPI表現(xiàn)出顯著較高的乳化性（30.14 m2/g），顯著高于CNPI（20.21 m2/g）和BSA（22.67 m2/g）（p＜0.05）。這一結(jié)果與鹽溶法提取南非班巴拉花生蛋白一致[32]。蛋白質(zhì)溶解性和疏水性是決定蛋白吸附能力和乳化性質(zhì)的重要因素，較高的溶解度和較低的表面疏水性可能是CNSPI具有優(yōu)良乳化性的原因。

CNSPI乳化穩(wěn)定性最好，可達(dá)138 min，其次是CNPI，乳化穩(wěn)定性為61 min，均遠(yuǎn)高于BSA的乳化穩(wěn)定性（27 min）（p＜0.05）。本研究中乳化能力和乳化穩(wěn)定性呈正相關(guān)關(guān)系，相似的結(jié)論在紫蘇分離蛋白中也有報(bào)道，減提酸沉蛋白出現(xiàn)這種相對(duì)的不穩(wěn)定性可能是因?yàn)榇嗳醯慕缑婺ひ鹆擞偷伍g不利的交互作用，這種界面交互作用有助于減小兩相間的接觸面積，導(dǎo)致小油滴合并變大，最終兩相分離[33]。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)比了CNPI和CNSPI在結(jié)構(gòu)（微觀形貌、表面疏水性、氨基酸組成、亞基組成、二級(jí)結(jié)構(gòu)）和功能特性（溶解性、起泡性及起泡穩(wěn)定性、乳化性及乳化穩(wěn)定性）方面的區(qū)別。研究結(jié)果表明，不同提取方法對(duì)腰果蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性產(chǎn)生了顯著性差異（p＜0.05）。SEM結(jié)果表明提取過程中會(huì)使腰果蛋白的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，CNPI呈現(xiàn)表面光滑的大片狀結(jié)構(gòu)，而CNSPI微觀形貌呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，有較小的球狀顆粒。通過SDS-PAGE和氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)不同提取方法得到的腰果蛋白在組成上無顯著性差異。CD結(jié)果表明，CNPI相比CNSPI含有較少的α-螺旋和較多的無規(guī)卷曲。CNSPI純度更高，乳化性及乳化穩(wěn)定性更好。而在中性環(huán)境下，CNPI具有更好的溶解性、起泡性及起泡穩(wěn)定性。綜上所述，在提取蛋白時(shí)，堿提酸沉法比鹽提法對(duì)腰果蛋白結(jié)構(gòu)改變程度更大，CNPI變性程度更高，多肽鏈從球狀展開為片狀，暴露出較多的疏水基團(tuán)，因此在功能性質(zhì)上表現(xiàn)出差異。CNSPI作為功能性食品成分更適合應(yīng)用于乳液、酸性飲料等食品中，而CNPI更適合應(yīng)用于冰淇淋等對(duì)起泡性質(zhì)要求高的食品中。

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Structure and Functional Characterization of Cashew Nut Protein Prepared by Salt Extraction Method and Alkaline Extraction and Subsequent Isoelectric Precipitation Method

PENG Qian, YAN Xiaoyan, LI Yuting, LIANG Lu, LIU Chengmei*, WANG Fang
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Proteins isolated from defatted cashew nut fl our by salt extraction method (CNSPI) and alkaline extraction and subsequent isoelectric precipitation method (CNPI) were evaluated to compare their structural (molecular weight, secondary structure, amino acid composition), micromorphological and functional (solubility, foaming capacity and foam stability,emulsifying activity index and emulsion stability) properties. The results showed CNSPI and CNPI dif f ered signif i cantly in structure, micromorphology, and functional properties. CNSPI exhibited significantly higher protein content, better solubility and emulsifying properties compared with CNPI, while the foaming properties were lower. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis revealed that the preparation methods had no impact on the primary structure of protein isolates. The nutritive value of protein isolates was evaluated by amino acid composition analysis. Scanning electron microscopy revealed that CNSPI exhibited a massive fl aky microstructure while CNPI appeared in an irregular shape as a combination of only a few globules and some fl aky plates. Circular dichroism (CD) spectroscopy demonstrated that β-sheet was the major secondary structure in CNSPI and CNPI. CNPI had relatively more random coil (29.3%) and less α-helix(11.9% vs. 27.0%) than CNSPI, which was possibly because alkaline treatment destroyed protein structure and consequently changed functional properties. Under neutral pH condition, the foaming capacity of CNPI was 119.00%, and the emulsion capacity could reach 30.14 m2/g.

cashew nut protein; functional properties; micromorphology; secondary structure; alkaline extraction and subsequent isoelectric precipitation method; salt extraction method

10.7506/spkx1002-6630-201723013

TS255.6

A

1002-6630（2017）23-0075-07

2016-10-08

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303077）

彭倩（1993—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭こ獭-mail：pengqian_ncu@163.com

*通信作者：劉成梅（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭澄镔Y源利用與開發(fā)。E-mail：chengmeiliu@yahoo.com.cn

彭倩, 顏小燕, 李雨婷, 等. 鹽提和堿提酸沉兩種方法提取腰果蛋白的結(jié)構(gòu)及其功能性質(zhì)分析[J]. 食品科學(xué), 2017,38(23): 75-81.

10.7506/spkx1002-6630-201723013. http://www.spkx.net.cn

PENG Qian, YAN Xiaoyan, LI Yuting, et al. Structure and functional characterization of cashew nut protein prepared by salt extraction method and alkaline extraction and subsequent isoelectric precipitation method[J]. Food Science, 2017, 38(23):75-81. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723013. http://www.spkx.net.cn