生長前期三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)附肢再生系統(tǒng)解析及階段劃分*

付媛媛 劉 磊 母昌考 朱 芳 任志明 李榮華 宋微微 王春琳

(寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315211;浙江海洋高效健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心 寧波 315211)

生長前期三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)附肢再生系統(tǒng)解析及階段劃分*

付媛媛 劉 磊 母昌考 朱 芳 任志明 李榮華 宋微微 王春琳①

(寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315211;浙江海洋高效健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心 寧波 315211)

以三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期幼蟹為材料,采用組織切片等方法研究其大螯斷肢后再生生長規(guī)律。結(jié)果表明,第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期幼蟹大螯一次蛻殼再生率分別為59.9%,75.3%,74.2%,80.4%,69.5%;斷肢組存活率分別為89.4%,84.9%,85.2%,89.4%和74.2%,均低于對照組的98.2%,90.3%,95.1%,90.2%和80.3%,但差異不顯著(P＞0.05);第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期斷肢組在去大螯后平均蛻殼周期分別為3.33d、4.47d和6.27d,顯著長于正常組的2.13d、3.89d和5.63d)(P＜0.05),而第Ⅳ、Ⅴ期斷肢組平均蛻殼周期分別為7.12d和10.86d,極顯著長于對照組的6.11d和8.09d (P＜0.01),且斷肢個(gè)體的生長期越往后,斷肢再生所需時(shí)間越長。本研究依據(jù)再生附肢發(fā)育特點(diǎn)將三疣梭子蟹大螯斷肢再生劃分為6個(gè)標(biāo)志性發(fā)育階段:再生芽基期、肢芽趾縫期、肢芽分化期、肢芽斑點(diǎn)期、肢芽成熟期、肢體出膜期;第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期蟹再生肢芽橫縱比平均值分別達(dá)到0.32、0.318、0.398、0.518、0.538時(shí),斷肢幼蟹可以達(dá)到附肢出膜的臨界點(diǎn)。綜上所述,三疣梭子蟹斷肢后能在1個(gè)蛻殼周期內(nèi)完成大螯再生,第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期斷肢幼蟹蛻殼周期時(shí)間顯著高于正常幼蟹;斷肢組成活率低于對照組,但差異不顯著,第Ⅳ期幼蟹的再生率和存活率均最高;各期幼蟹斷肢再生附肢均經(jīng)過 6個(gè)具有標(biāo)志性事件的發(fā)育階段;各期再生肢芽橫縱比值具有一定臨界值(0.32,0.318,0.398,0.518,0.538)。本研究首次對三疣梭子蟹斷肢再生過程及再生能力進(jìn)行了探究,結(jié)果將有助于甲殼類斷肢再生機(jī)理的闡明。

三疣梭子蟹;斷肢再生;蛻殼周期;發(fā)育;再生肢芽比值

斷肢再生是動物肢體損壞、自然脫落或者自殘之后全部或部分重新生成的現(xiàn)象,是動物的一種自我保護(hù)機(jī)制(Mattoniet al,2015),多種動物均存在斷肢再生的現(xiàn)象(Wilkie,2001;Konstantinideset al,2014;Shibataet al,2016)。已有研究表明,甲殼類,尤其是蟹類在斷肢后具有較強(qiáng)的再生能力,且激素、溫度、光周期等環(huán)境因素對蟹類斷肢再生有較大的影響(Mykles,2001;Gonget al,2015;岳武成等,2016),但相關(guān)研究主要集中在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和生理現(xiàn)象描述層面,關(guān)于蟹類斷肢及再生生理基礎(chǔ)及再生生長能力的研究較少。Hopkins(1993)對招潮蟹(Uca pugilator)附肢再生過程進(jìn)行了研究,描述了斷肢再生肢芽原基的形成及基底的發(fā)育階段。同時(shí),動物再生能力及機(jī)制研究一直是生物醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn),相關(guān)研究集中在小鼠、果蠅、斑馬魚、蠑螈(Bhajaet al,2010;張卓航等,2012)等模式動物上,研究結(jié)果可供人類再生醫(yī)學(xué)研究參考。因此,建立甲殼類斷肢再生動物研究模板,開展甲殼類斷肢再生機(jī)制研究對于再生生物學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、及甲殼類養(yǎng)殖都具有重要意義。

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)味鮮美,營養(yǎng)豐富,是我國的重要經(jīng)濟(jì)蟹類(薛俊增等,1997;陳晨等,2015),2015年海水養(yǎng)殖產(chǎn)量近12萬噸(農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局,2016)。然而,在三疣梭子蟹苗種培育、養(yǎng)殖、運(yùn)輸過程中存在因蟹互相攻擊及其它物理損傷造成的附肢斷肢現(xiàn)象,影響了蟹的攝食和運(yùn)動能力,且斷肢處易發(fā)生感染,造成蟹的成活率和養(yǎng)殖產(chǎn)量下降,經(jīng)濟(jì)損失巨大,因此斷肢個(gè)體能否成功再生出附肢對提高三疣梭子蟹存活率和經(jīng)濟(jì)效益具有重要作用。目前,關(guān)于三疣梭子蟹斷肢再生的報(bào)道極少,對不同生長期三疣梭子蟹的斷肢再生生理學(xué)和再生能力的研究也尚未見報(bào)道。因此,針對三疣梭子蟹斷肢再生生理過程及能力的認(rèn)識和研究具有重要的基礎(chǔ)及應(yīng)用意義。

本研究應(yīng)用人工外力斷肢法將不同生長期的蟹斷肢后,研究其附肢再生和發(fā)育能力,并采用組織切片法觀察再生肢的發(fā)育狀態(tài),研究結(jié)果將為進(jìn)一步探究三疣梭子蟹及其它甲殼類斷肢再生機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用蟹的養(yǎng)殖管理

取同一家系的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Ⅰ期幼蟹5000只,飼養(yǎng)于6000升循環(huán)水養(yǎng)殖池中作為實(shí)驗(yàn)材料。海水鹽度控制在25,溫度28℃,然后根據(jù)圖1方法進(jìn)行分組,其中對斷肢組采用壓力法迫使其自切掉其 1只大螯(左右隨機(jī)),每天早晚各投喂1次飼料,每3天換水1次,試驗(yàn)期間各個(gè)水族箱的養(yǎng)殖環(huán)境保持一致。期間觀察記錄蛻殼和再生肢發(fā)育情況,統(tǒng)計(jì)記錄蟹蛻皮、附肢再生和存活數(shù)。每12h觀察各期幼蟹斷肢肢芽的發(fā)育情況,并拍照記錄,統(tǒng)計(jì)各生長時(shí)期螃蟹附肢再生的時(shí)間。平均蛻殼周期定義為三疣梭子蟹所有個(gè)體完成一次蛻殼所經(jīng)歷的平均天數(shù)。斷肢再生率=再生出完整附肢幼蟹數(shù)/斷肢幼蟹總數(shù);存活率=實(shí)驗(yàn)組幼蟹存活數(shù)/飼養(yǎng)總數(shù);第一次蛻殼未生附肢率=蛻殼未再生附肢存活的幼蟹數(shù)/斷肢幼蟹總數(shù)。

圖1 實(shí)驗(yàn)用蟹的養(yǎng)殖管理Fig.1 The experiment with crab culture management

1.2 樣品取得

試驗(yàn)期間,另?、羝谟仔?0只隨機(jī)斷掉其1只大螯,分別單獨(dú)放養(yǎng)在50個(gè)長13cm*寬7cm*高7cm的孵化盒里,每天早晚各投喂1次飼料,每3天換水1次,試驗(yàn)期間各個(gè)孵化盒的養(yǎng)殖環(huán)境保持一致,分別于斷肢后第1d,2d,3d,4d,5d各取5只幼蟹,置于解剖顯微鏡(novel)下觀察其肢芽發(fā)育情況,并用HDCE-X3系列攝像頭及ScopeImage 9.0軟件測出肢芽實(shí)際橫向生長長度和縱向生長長度,并且取其肢芽,于 1.5ml含有 1ml的 4%多聚甲醛溶液中固定保存,用于組織切片。

1.3 組織石蠟包埋切片和H.E染色

1.3.1 組織石蠟包埋切片

取材:取固定于 4%多聚甲醛 24h以上的肢芽,在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)刀將目的部位組織修平整,將修切好的組織和對應(yīng)的標(biāo)簽放于脫水盒內(nèi)。

脫水:將脫水盒放進(jìn)吊籃里于脫水機(jī)內(nèi)依次梯度酒精進(jìn)行脫水。75%酒精4h-85%酒精2h-90%酒精2h-95%酒精1h-無水乙醇I 30min-無水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蠟I 1h-蠟 II 1h-蠟 III 1h。

包埋:將浸好蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋。先將融化的蠟放入包埋框,待蠟?zāi)讨皩⒔M織從脫水盒內(nèi)取出按照包埋的要求放入包埋框并貼上對應(yīng)的標(biāo)簽。于–20°凍臺冷卻,蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出并修整蠟塊。

切片:將修整好的蠟塊置于石蠟切片機(jī)上切片,片厚 4μm。切片漂浮于攤片機(jī) 40℃溫水上將組織展平,用載玻片將組織撈起,并放進(jìn)60℃烘箱內(nèi)烤片。待水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 H.E染色

石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-無水乙醇Ⅰ10min-無水乙醇Ⅱ10min-95%酒精 5min-90%酒精 5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗。

蘇木素染細(xì)胞核:切片入Harris蘇木素染3-8min,自來水洗,1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒,自來水沖洗,0.6%氨水返藍(lán),流水沖洗。

伊紅染細(xì)胞質(zhì):切片入伊紅染液中染色1—3min。

脫水封片:將切片依次放入 95%酒精 I 5min-95%酒精I(xiàn)I 5min-無水乙醇Ⅰ5min -無水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min中脫水透明,將切片從二甲苯拿出來稍晾干,中性樹膠封片。

1.4 鏡檢

將切片置于40×、400×的顯微鏡下觀察、拍片。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS20.0、Excel 2013、ScopeImage 9.0等處理軟件,分析不同生長期的幼蟹再生能力和Ⅳ期幼蟹肢芽發(fā)育分期及分期的組織切片。

統(tǒng)計(jì)5期再生附肢肢芽比值,再生附肢肢芽比值=橫向生長L1/縱向生長L2。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同生長期幼蟹斷肢后第一次蛻殼再生率和存活率,及未再生附肢蛻殼率分析

如表1所示,不同發(fā)育時(shí)期的幼蟹斷肢后經(jīng)過第一次蛻殼均可再生,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期幼蟹的第一次蛻殼后附肢再生率分別為59.9%,75.3%,74.2%,80.4%,69.5%,再生率隨著發(fā)育時(shí)期呈現(xiàn)逐漸上升后下降的變化趨勢,Ⅳ期最高;各發(fā)育期第一次蛻殼未生附肢率分別為14.1%,9.7%,9.9%,15.2%,4.9%,斷肢組的存活率分別為89.4%,84.9%,85.2%,89.4%,74.2%。其中,第Ⅳ期的存活率(89.4%)和附肢再生率(80.4%)均比其余各組高,且差異顯著(P＜0.05)。三疣梭子蟹第Ⅰ期與第Ⅴ期斷肢幼蟹存活率相同,均為89.4%,但第Ⅰ期附肢再生率顯著低于第Ⅴ期附肢再生率(P＜0.05),而第Ⅰ期蟹未再生存活率(即第一次蛻皮未生附肢率)比第Ⅴ期幼蟹要高,說明第Ⅰ期幼蟹大螯即使不能再生,但是存活的能力仍然較強(qiáng)。通過對平均蛻殼周期數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期斷肢組在去大螯后到完成第1次蛻殼所需的平均天數(shù)分別為3.33d,4.47d和6.27d,顯著高于正常組的2.13d,3.89d和5.63d (P＜0.05),而Ⅳ、Ⅴ期完成第1次蛻殼所需的平均天數(shù)(7.12d、10.86d)極顯著的高于正常組(6.11d、8.09d)(P＜0.01),且隨著發(fā)育期的增加斷肢再生的時(shí)間也隨之延長。

2.2 三疣梭子蟹Ⅳ期幼蟹再生附肢發(fā)育分期和對應(yīng)組織切片分析

如圖2所示,在解剖鏡下觀察肢芽外部形態(tài)變化,三疣梭子蟹Ⅳ期幼蟹從大螯斷肢到再生附肢大致經(jīng)歷6個(gè)發(fā)育時(shí)期,分別是:A-再生芽基、 B-肢芽趾縫期、C-肢芽分化期、D-肢芽斑點(diǎn)期、E-肢芽成熟期、F-肢體出膜期。三疣梭子蟹的幼蟹大螯被截?cái)嗪?傷口逐漸愈合封閉,并在其下形成一個(gè)再生芽即再生芽基期,此時(shí)再生肢芽透明沒有明顯的外部特征;隨著細(xì)胞的不斷分化,B期會出現(xiàn)一條明顯的趾縫,這個(gè)趾縫即為圖2-F再生大螯附肢的長節(jié)(圖2-F-f)和掌節(jié)(圖2-F-d)分節(jié)線;再生肢芽不斷的發(fā)育,C期外部形態(tài)分化顯著,出現(xiàn)腕節(jié)(圖2-C-c)及大螯可動趾(圖2-C-e)的分化,肢芽仍然是透明的,這時(shí)肢芽的細(xì)胞分化已經(jīng)結(jié)束;在C期的基礎(chǔ)上,各分化細(xì)胞在原有的細(xì)胞構(gòu)架上繼續(xù)增殖,最明顯的特征為D期出現(xiàn)色素沉淀(圖2-D-g),色素不斷聚集增多,變暗直至深黑色,再生肢芽為成熟E期;經(jīng)過蛻皮伸展出再生附肢 F期,再生肢體的外部形態(tài)接近正常肢體水平,但能觀察到顯著的大小差異。

表1 不同發(fā)育時(shí)期的斷肢幼蟹與正常幼蟹斷肢再生率、存活率,第一次蛻殼未生附肢率和蛻殼時(shí)間Tab.1 The reproduction rate,survival rate,the rate of the first molting of undeveloped appendages,and the molting time of larval limbs and normal juvenile crabs in different developmental stages

圖2 第Ⅳ幼蟹斷肢再生肢芽外部形態(tài)示意圖Fig.2 The external morphology of limb buds regenerated from the fourth juvenile crab

通過對外部發(fā)育及其對應(yīng)切片進(jìn)行分析,如圖2-A所示在大螯附肢被截?cái)嗨查g,創(chuàng)傷的修復(fù)從傷口邊緣表皮擴(kuò)展并且覆蓋切口表面,傷口愈合表皮增殖,產(chǎn)生一個(gè)多層的細(xì)胞團(tuán)形成去分化的細(xì)胞,在斷肢24h內(nèi),形成再生的肢芽。如切片圖3-A2-a箭頭所指,在新生的芽基中出現(xiàn)大片的組織溶解,細(xì)胞形成松散的間質(zhì),出現(xiàn)結(jié)締組織,結(jié)締組織細(xì)胞呈現(xiàn)類似胚胎期間質(zhì)細(xì)胞形態(tài),有去分化的功能。隨著肢芽迅速分裂增生形成B期,對應(yīng)組織切片圖3-B2顯示結(jié)締組織逐漸被分化的細(xì)胞所代替,出現(xiàn)顆粒性的類似血細(xì)胞的嗜酸性細(xì)胞,為其他細(xì)胞提供營養(yǎng),隨后再生附肢細(xì)胞組織(圖3-C2)發(fā)生分化現(xiàn)象,在切片顯示上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞排列整齊,按照已經(jīng)分化好的細(xì)胞團(tuán)的位置形成分化支架,再生肢芽不斷依靠支架(圖3-F2)進(jìn)行成熟發(fā)育。總體上說,三疣梭子蟹大螯再生附肢所經(jīng)歷的6個(gè)發(fā)育時(shí)期,按照發(fā)育順序進(jìn)行組織切片發(fā)現(xiàn),A期有大量未分化的結(jié)締組織(圖3-A2-a);結(jié)締組織逐漸出現(xiàn)分化的細(xì)胞團(tuán),可以分辨出有營養(yǎng)功能的嗜酸性顆粒細(xì)胞(圖3-B2-b);緊接著的C期中,細(xì)胞團(tuán)逐漸增殖分化,肢芽明顯分出三層:一層是中性粒細(xì)胞脫顆粒、第二層是松散組合的細(xì)胞和第三表皮細(xì)胞;最終松散組合的細(xì)胞充滿肢芽,表皮細(xì)胞也從最初的不規(guī)則,經(jīng)過不斷增殖遷移形成規(guī)則的上皮細(xì)胞;到D期初現(xiàn)肌纖維細(xì)胞,此時(shí)肢芽骨架已經(jīng)形成(圖3-F2),稱之為上皮-間質(zhì)系統(tǒng),再生肢芽不斷依靠支架進(jìn)行組織分化,最終完善附肢的各個(gè)組織系統(tǒng)。

2.3 不同生長期三疣梭子蟹再生附肢肢芽比值變化

由圖4可以看出,肢芽沿著縱向方向不斷延伸,在短時(shí)間(A期、B期和C期)內(nèi)變化幅度較大,到D期和E期時(shí)生長速度放緩,而橫向生長也有所增長(A期和B期),但是變化幅度不明顯,直至橫向生長有顯著的變化(C期、D期和E期),可能與細(xì)胞的分化先后順序及基因的調(diào)控有關(guān)系,有待后續(xù)研究證實(shí)。

圖3 第Ⅳ幼蟹斷肢再生肢芽外部形態(tài)組織切片F(xiàn)ig.3 Histopathological observation on limb buds of the fourth juvenile crab

圖4 第Ⅳ幼蟹斷肢再生肢芽橫縱生長數(shù)據(jù)測量示意圖Fig.4 Measurement of cross-longitudinal growth data of the limb buds regenerated from amputation of juvenile crab

按照圖4所示的測量方法(再生附肢肢芽比值=橫向生長L1/縱向生長L2),統(tǒng)計(jì)計(jì)算第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期各 20只幼蟹肢芽橫縱生長比值,繪制了不同生長期三疣梭子蟹再生附肢肢芽比值變化趨勢圖(圖5)。由圖5可得,斷肢2天后Ⅰ期幼蟹肢芽比值顯著下降,到第三天時(shí)就趨于平衡達(dá)到臨界點(diǎn),Ⅱ期幼蟹與Ⅰ期幼蟹變化趨勢相似,而Ⅱ期幼蟹完全生出附肢的時(shí)間要比Ⅰ期晚1天;Ⅲ、Ⅳ期幼蟹肢芽的比值在第2天也顯著降低,接下來的變化趨于緩和,直至第7天實(shí)驗(yàn)組完全生出附肢;第Ⅴ期幼蟹的肢芽比值沒有顯著下降的過程這個(gè)與其余各期有顯著的差別。各期斷肢幼蟹附肢再生比值隨著時(shí)間的變化而逐漸降低,且第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期變化趨勢相似,且當(dāng)比值分別達(dá)到 0.32、0.318、0.398、0.518、0.538斷肢幼蟹完全再生出附肢。

圖5 不同生長期三疣梭子蟹再生附肢肢芽比值變化趨勢圖Fig.5 The trends of limb buds ratio in different developmental stages of P.trituberculatus

3 討論

以Ⅳ期三疣梭子蟹幼蟹斷肢再生為例,可將斷肢再生過程描述如下:幼蟹首先會在斷肢的部位形成“棒狀”的肢芽,有膜包被,其長節(jié)和掌節(jié)迂回彎曲,有明顯趾縫出現(xiàn);在肢芽膜內(nèi)前端,出現(xiàn)大螯不動趾和大螯動趾的分化,趾縫和腕節(jié)明顯;當(dāng)膜蛻去后,附肢各個(gè)節(jié)蛻皮展開來,這與紀(jì)成林(1980)的研究相似。本研究數(shù)據(jù)結(jié)果表明,第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期幼蟹斷肢后均會再生出肢芽,再生肢體的外部形態(tài)與正常附肢相同,但顯著小于正常附肢。螃蟹蛻殼是隨著個(gè)體的大小不同而有差異,個(gè)體越小蛻殼的時(shí)間越短,如果在蛻殼過程發(fā)生障礙,蛻殼的時(shí)間就會延長,甚至而致螃蟹死亡。本研究發(fā)現(xiàn)斷肢的各期幼蟹蛻殼時(shí)間均比正常幼蟹時(shí)間要長,且斷肢組幼蟹的死亡率也比正常的幼蟹要高。張瓊宇等(2005)研究發(fā)現(xiàn)一齡、二齡的草魚抵抗細(xì)菌和病毒的能力要低于三齡的,斷肢對幼蟹有機(jī)械性的損傷,同時(shí)不同發(fā)育時(shí)期幼蟹免疫能力也是有差別的,通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,Ⅴ期幼蟹斷肢存活率和正常組相比差異不顯著(P＞0.05),且蛻皮附肢再生率高于其余各組且差異顯著(P＜0.01),Ⅴ期幼蟹展示出了較強(qiáng)的附肢再生能力及存活能力,這可能是表達(dá)或增強(qiáng)了Ⅰ、Ⅱ期一些斷肢相關(guān)基因,從而構(gòu)建了一個(gè)較健全的斷肢再生系統(tǒng);本研究還發(fā)現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期斷肢組的存活率高于Ⅴ期幼蟹,這可能與 V期斷肢組幼蟹在機(jī)械性損傷期間恢復(fù)能力差,蛻殼時(shí)間長,抵抗細(xì)菌和病毒的能力較弱有關(guān)。同時(shí),每一期幼蟹都有蛻一次殼未再生大螯的情況發(fā)生,已有研究表明,幼蟹斷肢后存在第2次蛻殼后肢體也無法完成再生的情況(Yasudaet al,2014)。上述現(xiàn)象可能與斷肢后機(jī)體物質(zhì)及能量在不同器官的分配以維護(hù)動物的生存機(jī)制有關(guān)(Wrinnet al,2007),另一方面還可能與蟹本身所處的蛻殼時(shí)期和體內(nèi)代謝產(chǎn)物有關(guān),如視磺酸等(岳武成等,2016)。已有研究的是花背蟾蜍、斑馬魚等通過特殊的遺傳機(jī)制(肖能文等,2009;Deimlinget al,2009),用視黃酸控制胚基形成從而完成鰭的再生,斷肢招潮蟹的肢芽用視黃酸處理后,蛻殼產(chǎn)出的步足會產(chǎn)生畸形(Hopkins,1986)。

有研究顯示,甲殼類動物在受到外界傷害后,與肢體連接處的關(guān)節(jié)在壓力作用下可自動斷掉(McVean,1982),本研究中當(dāng)三疣梭子蟹大螯受到外力傷害時(shí)絕大部分個(gè)體都可自動脫掉,且在相同養(yǎng)殖條件下的同一生長期的幼蟹,斷肢組存活率均低于正常組(表1),主要原因可能是蟹斷肢時(shí)肌肉等組織受損,并伴有少量失血,且斷肢處易感染細(xì)菌。在斷肢后短短的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)生長出的肢芽明顯分出三層(圖3-C2切片結(jié)果顯示):第一層主要中性粒細(xì)胞;第二層是松散組合的細(xì)胞,這層細(xì)胞最終充滿整個(gè)肢芽;第三為表皮遷移細(xì)胞,這與 Hopkins(1986)對招潮蟹斷肢再生研究結(jié)果相似。斷肢后 24h,有一些伸長和運(yùn)動的表皮細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂,許多遷移表皮細(xì)胞在肢芽突出處開始有絲分裂(Emmel,1910),這些表皮細(xì)胞發(fā)育構(gòu)成了肢芽的新表皮,并分泌產(chǎn)生角質(zhì)層(Adiyodi,1972)。此時(shí),新產(chǎn)生的芽基是具有表皮殼的空心結(jié)構(gòu),內(nèi)部細(xì)胞尚未開始分裂(圖2-A)。通過本研究發(fā)現(xiàn),三疣梭子蟹斷肢后的 2—3天內(nèi),斷肢處充滿了新的細(xì)胞:其中有一些新的表皮細(xì)胞,也有新生出有絲分裂細(xì)胞。再生的肌肉組織(圖3-D2)落后表皮 1—2天,這可能和基因的調(diào)控順序有關(guān)系(McCroskeryet al,2005;Wagneret al,2005)。兩棲類蠑螈的再生肌纖維來自于機(jī)體相應(yīng)組織的前體細(xì)胞,通過肌纖維相應(yīng)的前體細(xì)胞去分化再生出肌纖維,而同是兩棲類的爪蟾再生尾并沒有轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象(楊荔等,2015)。本文雖然通過切片初步研究發(fā)現(xiàn)表皮細(xì)胞進(jìn)行遷移形成芽基空心結(jié)構(gòu),并且有未分化的結(jié)締組織進(jìn)而填充肢芽,但是具體如何形成再生肌纖維的,還需要進(jìn)一步的通過遺傳學(xué)與分子手段進(jìn)行研究。

本研究中,不同生長期幼蟹附肢再生肢芽比呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,并且達(dá)到一定的數(shù)值就會蛻殼伸展出附肢,可能與能量與物質(zhì)積累有關(guān)。已有研究表明,甲殼類動物蛻殼前需積累一定的營養(yǎng)物質(zhì)(Angeret al,1981),如幼蟹需積累足夠的能量與營養(yǎng),才能達(dá)到蛻殼周期的某一點(diǎn)(潘魯青等,1997),幼體攝取能量后,首先滿足蛻殼要求,剩余的食物能量攝取才用于生長(黃國強(qiáng)等,2004)。Ⅰ、Ⅱ期幼蟹獲取較少的能量就可以滿足斷肢發(fā)育的需要,因此48h內(nèi)就會促使體內(nèi)的物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化,加速肢芽發(fā)育;此外,耗氧量也隨生物個(gè)體的增大而增加,且骨骼和肌肉比腦及各內(nèi)臟器官的耗氧低(Mio,1962),這樣也會降低了肢芽的形成速度。除了外部環(huán)境因素外,也可能與某些基因在發(fā)育階段中表達(dá)有關(guān),斷肢發(fā)育需要啟動再生信號通路,目前在斑馬魚、兩棲動物中與再生相關(guān)的信號通路中有BMP、Notch、Wnt以及FGF,這些都對動物器官再生起了重要的調(diào)控作用,其中Wnt及其下游的RA和Fgf信號通路對尾鰭再生發(fā)揮著重要作用,這就使促使基因的表達(dá)模式呈現(xiàn)出高度的發(fā)育階段特異性,而對于三疣梭子蟹再生信號通路的研究目前還沒有相關(guān)報(bào)道,這需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

(1)本文以第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期幼蟹為材料研究幼蟹大螯斷肢再生的能力,幼蟹斷肢后均能在1個(gè)蛻殼周期內(nèi)完成大螯再生,且相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示第V期幼蟹的再生率和存活率均最高。

(2)以Ⅳ期幼蟹為研究對象,發(fā)現(xiàn)斷肢再生附肢需經(jīng)過6個(gè)具有標(biāo)志性事件的發(fā)育階段,通過外部肢芽形態(tài)及其對應(yīng)組織切片的變化,可以分為再生芽基、肢芽趾縫期、肢芽分化期、肢芽斑點(diǎn)期、肢芽成熟期、肢體出膜期。

(3)各期再生肢芽橫縱比值具有一定臨界值,越接近臨界值離肢體出膜期越近。

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ON LIMB REGENERATION IN EARLY STAGE OFPORTUNUS TRITUBERCULATUSIN HISTOMORPHOLOGY

FU Yuan-Yuan, LIU Lei, MU Chang-Kao, ZHU Fang, REN Zhi-Ming, LI Rong-Hua,SONG Wei-Wei, WANG Chun-Lin
(School of Marine Science,Ningbo University,Ningbo315211,China;Collaborative Innovation Center for Zhejiang Marine High-efficiency and Healthy Aquaculture,Ningbo315211,China)

Limb regeneration mechanism ofPortunus trituberculatusin different growth stages (Ⅰ to Ⅴ)was studied with histological sections.The results indicate that the limb regeneration rate after the first molt for stages Ⅰ to Ⅴ was 59.9%,75.3%,74.2%,80.4%,69.5%,respectively.The survival rate of limb (89.4%,84.9%,85.2%,89.4%,and 74.2%,respectively)was lower than that of the control group (98.2%,90.3%,95.1%,90.2%,and 80.3%,respectively),insignificantly.The average molting days of limb regeneration group for stages Ⅰ,to Ⅲ was 3.33,4.47,and 6.27d,respectively,which is significantly longer than the control group’s (P＜0.05).However,the average molting days of stagesⅣ and Ⅴ was 7.12 and 10.86d,which is significantly longer than the control group’s (P＜0.01).For crabs in stage Ⅳ,six landmark developmental stages can be divided,i.e.,regeneration of bud base,limb bud toe seam,limb bud differentiation stage,limb bud spots,limb bud maturity,and molt regeneration.The regeneration could succeed when average ratio of spine buds for these five stages reached 0.32,0.38,0.39,0.518,and 0.538.Totally,large chelating regeneration could be completed in a molting cycle.The molting cycle of the larvae in stages Ⅰ to Ⅴ were significantly longer than those of normal crabs.Both the regeneration rate and survival rate of the first-stage crab were the highest.The regeneration could be completed after all the six landmark developmental stages and the average ratio of spine buds must reach a certain critical value.Therefore,the limb regeneration mechanism ofP.trituberculatusmay enrich our knowledge for crustacean aquaculture industries.

Portunus trituberculatus;limb regeneration;molting cycle;development;ratio of regenerated limb buds

S917;Q344

10.11693/hyhz20170500123

* 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目,41476124號,31602152號;寧波市農(nóng)業(yè)重大項(xiàng)目,2017C110007號。付媛媛,E-mail:283452425@qq.com

① 通訊作者:王春琳,教授,博士生導(dǎo)師,E-mail:wangchunlin@nbu.edu.cn

2017-05-13,收修改稿日期:2017-06-10