通脈方中異黃酮類成分清除DPPH自由基的活性研究△

王付榮，楊雁芳，楊秀偉

(北京大學 天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，藥學院 天然藥物學系，北京 100191)

通脈方中異黃酮類成分清除DPPH自由基的活性研究△

王付榮，楊雁芳，楊秀偉*

(北京大學 天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，藥學院 天然藥物學系，北京 100191)

目的通脈方是由葛根、丹參和川芎3味藥按質(zhì)量1∶1∶1組成的復方。本文研究通脈方中3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、3′-甲氧基大豆苷、3′-羥基泰國野葛根素等25種異黃酮類化合物清除DPPH(2，2′-diphenyl-1-picrylhydrazyl)自由基的活性。方法通過DPPH自由基清除實驗，對25個異黃酮類化合物的體外抗氧化活性進行測定。結(jié)果體外抗氧化研究表明，通脈方中的3′-羥基葛根素、3′-羥基泰國野葛根素、3′-甲氧基葛根素和3′-甲氧基大豆苷具有清除DPPH自由基的活性，呈濃度依賴性，它們的IC50值分別為(9.9±0.6)、(13.7±1.4)、(57.3±1.2)和(66.4±2.3) μmol·L-1。在同樣條件下，陽性對照藥丁羥甲苯和抗壞血酸的IC50值分別為(75.4±6.9)和(16.5±1.6) μmol·L-1。結(jié)論本研究結(jié)果能夠預測3′-羥基葛根素、3′-羥基泰國野葛根素、3′-甲氧基葛根素和3′-甲氧基大豆苷可能是通脈方生物活性物質(zhì)基礎的重要組成部分。

通脈方；異黃酮；3′-羥基葛根素；3′-羥基泰國野葛根素；3′-甲氧基葛根素；3′-甲氧基大豆苷；DPPH自由基

由傳統(tǒng)中藥葛根[Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根，Puerariae Lobatae Radix，PLR]、丹參(SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根，Salviae Miltiorrhizae Radix，SMR)、川芎(LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，Chuanxiong Rhizoma，CXR)3 味中藥按質(zhì)量1∶1∶1組成的“通脈方”，其制劑有《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》第4冊收載的“通脈沖劑”[1]和第20冊收載的“通脈口服液”[2]等。“通脈方”3味藥配伍能活血、行氣、升陽，協(xié)同作用相得益彰，共奏活血通脈之功效；而且組方藥味精當，易于研制為現(xiàn)代中藥。前報報道了其水提取物的化學成分[3-4]和人腸內(nèi)菌生物轉(zhuǎn)化[5]研究，定量分析結(jié)果表明“通脈方”中的主要化學成分為異黃酮類化合物[6]。臨床上“通脈方”用于缺血性心腦血管疾病的治療，對動脈硬化、腦血栓、腦缺血、冠心病、心絞痛等有較好的療效。這些疾病的發(fā)生均與體內(nèi)自由基過量產(chǎn)生有密切關系。以葛根素為代表的異黃酮類化合物是葛根中的主要成分，具有多種心血管藥理活性[7-9]。通脈顆粒在急性心肌缺血模型比格犬體內(nèi)藥動學研究結(jié)果表明，3′-甲氧基葛根素和3′-羥基葛根素有較高的血藥濃度[10]。3′-羥基葛根素、3′-羥基泰國野葛根素、3′-甲氧基葛根素和3′-甲氧基大豆苷均來自“通脈方”組方藥味的葛根[4，6]。本文報道這些異黃酮類化合物對DPPH自由基的清除活性。

1 材料

1.1 藥品和試劑

受試異黃酮類化合物從通脈方中分離純化得到，分別為大豆苷元(daidzein，1)、芒柄花素(formononetin，2)、5-羥基芒柄花苷(5-hydroxylononin，3)、芒柄花苷(ononin，4)、大豆苷(daidzin，5)、3′-甲氧基葛根素(3′-methoxypuerarin，6)、染料木苷(genistin，7)、葛根素(puerarin，8)、芒柄花素-8-C-β-D-呋喃芹糖基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[formononetin-8-C-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside，9]、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[formononetin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside，10]、澳白檀苷(lanceolarin，11)、葛花寧(kakkanin，12)、大豆苷元-7，4′-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(daidzein-7，4′-di-O-β-D-glucopyranoside，13)、泰國野葛根素(mirificin，14)、3′-羥基葛根素(3′-hydroxypuerarin，15)、3′-甲氧基大豆苷(3′-methoxydaidzin，16)、芒柄花素-8-C-β-D-吡喃木糖基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[formononetin-8-C-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside，17]、染料木素-8-C-β-D-呋喃芹糖基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[genistein-8-C-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside，18]、染料木素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[genistein-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside；ambocin，19]、3′-羥基泰國野葛根素(3′-hydroxymirificin，20)、6″-O-β-D-木糖基葛根素(6″-O-β-D-xylosylpuerarin，21)[4]、鷹嘴豆芽素A-8-C-β-D-呋喃芹糖基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[biochanin A-8-C-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside，22]、3′-甲氧基大豆苷元-7，4′-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3′-methoxydaidzein-7，4′-di-O-β-D-glucopyranoside，23)、大豆苷元-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[daidzein-7-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranoside，24]、大豆苷元-7-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[daidzein-7-O-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranoside，25][3]，高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)面積歸一化法測定純度在98%以上，化學結(jié)構見圖1。

DPPH(2，2′-diphenyl-1-picrylhydrazyl)和抗壞血酸(ascorbic acid，Vc)均購自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，MO，USA)；丁羥甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)購自DIMA Technology Inc.(California，USA)；96孔板購自Corning Costar公司(Cambridge，MA，USA)。

1.2 儀器

AR4120型萬分之一電子天平[奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司]；UVmaxKinetic Microplate Reader(Molecular Dynamics，Inc.，Sunnyvale，California，CA，USA)。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 DPPH自由基甲醇溶液 200 μmol·L-1甲醇溶液，備用。

2.1.2 樣品溶液 分別精密稱取1.1項下的受試異黃酮或陽性對照藥BHT、Vc，用甲醇溶解并稀釋配制成不同濃度的供試品溶液，備用。

2.1.3 空白對照溶液 不加樣品，按樣品溶液制備方法進行配制，備用。

2.2 清除DPPH自由基活性測定

按文獻報道方法[11-12]，測定陽性對照藥和25個異黃酮清除DPPH自由基的活性。具體操作方法主要為：分別精密吸取各供試品溶液150 μL置于96孔板上，再精密吸取50 μL濃度為200 μmol·L-1的DPPH自由基甲醇溶液置于96孔板與各樣品溶液混合均勻，立即室溫下避光30 min，用酶標儀測定490 nm下的吸光度值，按公式(1)計算各樣品對DPPH自由基的清除率(I，%)。

I(%)=[(A0-A1)/A0]×100

(1)

式中：A0—空白對照的吸光度值；A1—樣品的吸光度值。

3 結(jié)果

3.1 陽性對照藥BHT和VC對DPPH自由基清除的IC50值

精密稱取陽性對照藥BHT用甲醇溶解并稀釋配制成濃度為2.5、10、25、50、100、200、500、1000 μmol·L-1的甲醇溶液。

精密稱取陽性對照藥VC用甲醇溶解并稀釋配制成濃度為2.5、10、20、30、50、80、100、1000 μmol·L-1的甲醇溶液。

按實驗方法進行操作，測定吸光度值，按公式(1)計算清除率。

將陽性對照藥濃度分別取對數(shù)值，以所得對數(shù)值lg C為橫坐標，以清除率為縱坐標，用OringinPro 7.5 SR1軟件做S型曲線，得出清除率為50%時陽性對照藥的濃度，即為IC50值。兩個陽性藥BHT和VC的S型曲線圖見圖2，它們的IC50值分別為(75.4±6.9)、(16.5±1.6)μmol·L-1。

3.2 受試化合物對DPPH自由基的清除活性

分別精密稱取各受試化合物，用甲醇溶解并稀釋配制成濃度為0.01、0.1、1、10、100、1000 μmol·L-1的甲醇溶液。

圖2 陽性對照藥BHT和VC的曲線圖

按實驗方法進行操作，測定吸光度值，按公式(1)計算清除率I(%)，結(jié)果見表1。

表1 通脈方中25個異黃酮類化合物不同濃度下清除DPPH自由基的結(jié)果

由表1結(jié)果可知，受試化合物6(3′-甲氧基葛根素)、15(3′-羥基葛根素)、16(3′-甲氧基大豆苷)、20(3′-羥基泰國野葛根素)清除DPPH自由基活性呈濃度相關性。

將受試化合物6、15、16和20的濃度取對數(shù)值，以所得對數(shù)值lgC為橫坐標，以清除率為縱坐標，用OringinPro 7.5 SR1軟件做S型曲線(見圖3)，得出清除率為50%時它們的濃度，即為它們的IC50值，見表2。

圖3 4個異黃酮化合物的DPPH自由基清除率曲線圖

表2 4個異黃酮化合物清除DPPH自由基的IC50值

4 討論

自由基的產(chǎn)生、清除與危害是自由基生物學的主要內(nèi)容，近27年來這門新興學科已滲透或擴展到幾乎全部的生命科學中。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激和抗氧化機制的平衡失調(diào)導致體內(nèi)氧自由基過剩與心腦血管疾病的發(fā)生有密切關系[13-14]，因此，可應用抗氧化劑對心腦血管疾病進行防治。本文對通脈方中25個異黃酮類化合物清除DPPH自由基活性的研究結(jié)果表明，3′-羥基葛根素、3′-羥基泰國野葛根素、3′-甲氧基葛根素、3′-甲氧基大豆苷清除DPPH自由基的活性良好；其中，3′-羥基葛根素和3′-羥基泰國野葛根素的活性甚至優(yōu)于陽性對照藥抗壞血酸(Vc)，這兩個異黃酮類化合物結(jié)構的共同特征是B環(huán)都具有3′-OH和4′-OH；3′-甲氧基葛根素和3′-甲氧基大豆苷的活性雖不及3′-羥基葛根素和3′-羥基泰國野葛根素，但活性均比陽性對照藥丁羥甲苯(BHT)強，它們的共同特征是都具有3′-OCH3和4′-OH。

從異黃酮類化合物的結(jié)構上進行分析，發(fā)現(xiàn)有兩個酚羥基取代在異黃酮類化合物的母核B環(huán)上的C-3′和C-4′位上，可大大增強該化合物清除DPPH自由基的活性。當C-3′位上的羥基醚化為甲氧基而仍具有4′-OH時，化合物的活性有所降低，但活性仍比陽性對照藥丁羥甲苯強。

前文我們報道了通脈方提取物對大鼠具有顯著的保護心肌細胞缺氧復氧損傷的作用[15]，本文結(jié)果提示這些化合物在通脈方對心腦血管疾病治療上可能會產(chǎn)生重要作用，它們可能是通脈方生物活性物質(zhì)基礎的重要組成部分之一[16]，有待于深入研究。

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑：第4冊[S].1991：169.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑：第20冊[S].1991：302.

[3] Wang F R，Yang X W，Zhang Y，et al.Three new isoflavone glycosides from Tongmai granules[J].J Asian Nat Prod Res，2011，13(4)：319-329.

[4] 王付榮，葛喜珍，通脈方化學成分[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17(20)：61-69.

[5] 吳帥，徐嵬，楊秀偉.人源腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化通脈方的化學研究[J].中國中藥雜志，2013，38(20)：3510-3519.

[6] Wang F R，Zhang Y，Yang X B，et al.Rapid determination of 30 polyphenols in Tongmai Formula，a combination of Puerariae Lobatae Radix，Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma，and Chuanxiong Rhizoma，vialiquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Molecules，2017，22(4)：545-554.

[7] Rong H J，Stevens J F，Deinzer M L，et al.Identification of isoflavones in the roots ofPuerarialobata[J].Planta Med，1998，64(7)：620-627.

[8] Sun X H，Ding J P，Li H，et al.Activation of large-conductance calcium-activated potassium channels by puerarin：the underlying mechanism of puerarin-mediated vasodilation[J].J Pharmacol Exp Ther，2007，323(1)：391-397.

[9] Yan L P，Zhuang Y L，Chan S W，et al.Analysis of the mechanisms underlying the endothelium-dependent antivasoconstriction of puerarin in rat aorta[J].Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol，2009，379(6)：587-597.

[10] 張穎，劉春旭，李磊，等.通脈顆粒在急性心肌缺血模型比格犬體內(nèi)藥動學研究[J].中國中藥雜志，2016，41(4)：737-742.

[11] Sharma O P，Bhat T K.DPPH antioxidant assay revisited[J].Food Chem，2009，113(4)：1202-1205.

[12] Zheng G M，Xu L X，Wu P，et al.Polyphenols from longan seeds and their radical-scavenging activity[J].Food Chem，2009，116(2)：433-436.

[13] 翟艷紅.氧自由基與心血管系統(tǒng)疾病的關系[J].醫(yī)學綜述，2001，7(5)：280-282.

[14] 宋玉菲.阿爾茨海默病與氧化應激[J].國際神經(jīng)病學神經(jīng)外科學雜志，2015，42(3)：290-293.

[15] 張穎，李丹，韓笑，等.通脈顆?；钛}功效的指征藥效成分研究[J].世界科學技術—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015，17(7)：1398-1404.

[16] 楊秀偉.中藥物質(zhì)基礎研究是中藥繼承、發(fā)展、創(chuàng)新的關鍵科學問題[J].中國中藥雜志，2015，40(17)：3429-3434.

StudyonScavengingDPPHFree-radicalActivityofIsoflavonesinTongmaiFormula

WANGFurong，YANGYanfang，YANGXiuwei*

(StateKeyLaboratoryofNaturalandBiomimeticDrugs，DepartmentofNaturalMedicines，SchoolofPharmaceuticalSciences，PekingUniversity，Beijing100191，China)

Objective：Tongmai formula(TMF)is a drug combination of three components including Puerariae Lobatae Radix[roots ofPuerarialobata(Willd.)Ohwi]，Salviae Miltiorrhizae Radix(roots ofSalviamiltiorrhizaBge.)and Chuanxiong Rhizoma(rhizomes ofLigusticumchuanxiongHort.)in a weight ratio of 1∶1∶1.The scavenging activity against DPPH free-radical by isoflavonoid compounds isolated from TMF were studied in this paper.The assayed isoflavonoid compounds include daidzein，formononetin，5-hydroxylononin，ononin，daidzin，3′-methoxypuerarin，genistin，puerarin，formononetin-8-C-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside，formononetin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside，lanceolarin，kakkanin，daidzein-7，4′-di-O-β-D-glucopyranoside，mirificin，3′-hydroxypuerarin，3′-methoxydaidzin，formononetin-8-C-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside，genistein-8-C-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside，genistein-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside(ambocin)，3′-hydroxymirificin，6″-O-β-D-xylosylpuerarin，biochanin-A-8-C-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside，3′-methoxydaidzein-7，4′-di-O-β-D-glucopyranoside，daidzein-7-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranoside，and daidzein-7-O-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranoside.MethodsTheinvitroantioxidant potentials of above-mentioned 25 isoflavonoid compounds were evaluated by DPPH(2，2′-diphenyl-1-picrylhydrazyl)free-radical scavenging test.ResultsInvitroantioxidant studies showed that 3′-hydroxypuerarin，3′-hydroxymirificin，3′-methoxypuerarin，and 3′-methoxydaidzin in TMF possessed notable antioxidant effects on DPPH free-radical scavenging in a concentration-dependent manner and their values of IC50were(9.9±0.6)，(13.7±1.4)，(57.3±1.2)，and(66.4±2.3)μmol·L-1，respectively.While the IC50values of butylated hydroxytoluene and ascorbic acid used as the positive control under the same condition were(75.4±6.9)and(16.5±1.6)μmol·L-1，respectively.ConclusionThe study result could predict that 3′-hydroxypuerarin，3′-hydroxymirificin，3′-methoxypuerarin，and 3′-methoxydaidzin may be an important part of the bioactive material basis of TMF.

Tongmai formula；isoflavonoid；3′-hydroxypuerarin；3′-hydroxymirificin；3′-methoxypuerarin；3′-methoxydaidzin；DPPH free-radical

國家科技重大新藥創(chuàng)制專項(2009ZX09502-006)；“十二五”國家科技支撐計劃(2011BAI07B08)

*

楊秀偉，教授，研究方向：生物活性天然產(chǎn)物和藥物的ADMET/Act.研究；Tel：(010)82801569，E-mail：xwyang@bjmu.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.010

2017-03-23)