沉默免疫負(fù)調(diào)控基因技術(shù)修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞治療原發(fā)性肝癌后T淋巴亞群分析

徐獻(xiàn)毅，任 鋒， 陳德喜，李 寧，謝棒祥，樸正福

1.南京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，江蘇 南京 211166； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 北京市肝病研究所

論著·肝癌、肝硬化

沉默免疫負(fù)調(diào)控基因技術(shù)修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞治療原發(fā)性肝癌后T淋巴亞群分析

徐獻(xiàn)毅1，任 鋒2， 陳德喜2，李 寧2，謝棒祥2，樸正福2

1.南京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，江蘇 南京 211166； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 北京市肝病研究所

目的探究使用沉默免疫負(fù)調(diào)控基因(iAPA)細(xì)胞療法對(duì)原發(fā)性肝癌術(shù)后患者T淋巴細(xì)胞亞群的變化。方法選取南京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院12例原發(fā)性肝癌手術(shù)切除后患者，男7例，女5例，年齡37～73歲。術(shù)前用血細(xì)胞分離機(jī)采集外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液60 ml，貼壁分離培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)，iAPA因子(含抑制SOCS1的siRNA等)轉(zhuǎn)染DC。第7天將成熟的DC回輸至患者體內(nèi)。患者治療兩個(gè)療程后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群。結(jié)果患者一般情況普遍得到明顯改善。外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果表明：CD3+T淋巴細(xì)胞高于治療前，CD3+CD4+T+CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例之和高于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論iAPA-DC療法可以改善原發(fā)性肝癌免疫抑制狀態(tài)，提高T淋巴細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)，是有效的生物細(xì)胞技術(shù)之一。

免疫負(fù)調(diào)控基因；樹(shù)突狀細(xì)胞；原發(fā)性肝癌；T淋巴細(xì)胞亞群

沉默免疫負(fù)調(diào)控基因技術(shù)(inhibition of antigen-presentation attenuators, iAPA)是一種新型的腫瘤免疫細(xì)胞療法，其核心是采用小干擾核糖核酸(siRNA)特異性阻斷抗原遞呈細(xì)胞(如DC)中關(guān)鍵的免疫負(fù)調(diào)控基因(如SOCS1基因)，使其基因表達(dá)沉默，誘導(dǎo)機(jī)體突破自身對(duì)腫瘤的免疫耐受，增強(qiáng)抗原特異性免疫反應(yīng)[1-2]。siRNA抑制免疫負(fù)調(diào)控DC技術(shù)的基礎(chǔ)研究中第一次提出了抑制免疫負(fù)調(diào)控因子來(lái)增強(qiáng)DC疫苗的概念。在小鼠體內(nèi)證實(shí)了SOCS1的沉默可以增強(qiáng)DC誘導(dǎo)免疫的免疫強(qiáng)度和時(shí)間，同時(shí)增強(qiáng)免疫記憶功能，從而打破宿主水平的自身耐受性。iAPA除了解除DC中的免疫負(fù)調(diào)節(jié)因子，同時(shí)結(jié)合腫瘤特異性相關(guān)抗原——存活素(Survivin)和黏蛋白1(MUC1)免疫DC，并以細(xì)菌鞭毛蛋白Flagellin作為刺激因子，然后將修飾后的DC回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，活化并增殖特異性T細(xì)胞[3]?？捎行Ъせ顧C(jī)體自身免疫系統(tǒng)，打破機(jī)體對(duì)自身腫瘤的免疫耐受，對(duì)控制腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的長(zhǎng)期療效起到至關(guān)重要的作用。近年來(lái)逐漸開(kāi)展的一些新的非手術(shù)治療方法為肝癌患者的治療帶來(lái)了更多的選擇，并大大改善了患者的預(yù)后[4]。本研究旨在探究使用iAPA治療原發(fā)性肝癌前后T細(xì)胞淋巴亞群的變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選取南京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院確診為原發(fā)性肝癌患者12例，男7例，女5例，年齡37～73歲，中位年齡60歲。臨床分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期4例，Ⅲ期5例，Ⅳ期1例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床確診為肝癌，血象正?；蜈呌谡?WBC≥4×109L-1)；(2)重要生命器官功能正常；(3)預(yù)期生存期>3個(gè)月，KPS評(píng)分>50分；(4)無(wú)嚴(yán)重病毒、細(xì)菌感染；(5)非妊娠、哺乳期患者；(6)無(wú)生物制品過(guò)敏史；(7)患者本人或其家屬、委托人自愿接受免疫細(xì)胞治療，并已簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重自身免疫性疾病患者；(2)心、肺、肝、脾等主要器官功能明顯低下者；(3)IL-2等細(xì)胞因子過(guò)敏患者；(4)HIV陽(yáng)性患者；(5)4周內(nèi)進(jìn)行過(guò)其他免疫治療的患者；(6)妊娠或哺乳期婦女；(7)明確感染或發(fā)熱患者。所有患者均經(jīng)血清甲胎蛋白檢查及肝臟影像學(xué)檢查臨床確診為原發(fā)性肝癌，患者性別、年齡、病程等一般資料相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2iAPA-DC細(xì)胞制備(1)以血細(xì)胞分離機(jī)采集患者周圍血單個(gè)核細(xì)胞60 ml，單個(gè)核細(xì)胞的數(shù)目為(1～2)×109個(gè)，送實(shí)驗(yàn)室操作。(2)采用密度梯度離心法，分離出單個(gè)核細(xì)胞。進(jìn)而采用貼壁培養(yǎng)法，去除懸浮的T淋巴細(xì)胞，獲得含DC前體細(xì)胞成分的貼壁細(xì)胞。在無(wú)血清培養(yǎng)基中加入人重組IL-4和GM-CSF等因子培養(yǎng)6 d，用iAPA因子(Ad5型腺病毒：含抑制SOCS-1的siRNA、腫瘤抗原Survivin及MUC-1和鞭毛蛋白Flagellin基因)加入正在培養(yǎng)的DC細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，感染復(fù)數(shù)為10 000∶1，繼續(xù)培養(yǎng)至第7天。細(xì)胞在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。(3)第7天收獲促成熟的DC,并進(jìn)行質(zhì)量控制。包括檢測(cè)細(xì)胞外觀是否為樹(shù)突狀懸液、細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞存活率、細(xì)胞表型鑒定、細(xì)菌、真菌、霉菌、內(nèi)毒素檢測(cè)等，質(zhì)量合格則收集細(xì)胞并計(jì)算收獲的細(xì)胞數(shù)量。

1.3方法對(duì)入選患者行血尿便常規(guī)及生化、凝血四項(xiàng)等實(shí)驗(yàn)室檢查，腹部CT、MRI、PET-CT、甲胎蛋白的測(cè)定及生活質(zhì)量評(píng)分等免疫細(xì)胞治療前檢查。(1)抽血當(dāng)天進(jìn)行流式檢測(cè)，作為治療前數(shù)據(jù)。(2)將制備的iAPA-DC細(xì)胞于培養(yǎng)第7天收獲，重懸于含質(zhì)量濃度為50 g/L的人血白蛋白的100 ml生理鹽水中。靜脈滴注回輸至患者體內(nèi)，iAPA-DC樣細(xì)胞數(shù)量≥1×108個(gè)/100 ml。1個(gè)月后，進(jìn)行第2個(gè)療程治療。第2次治療結(jié)束后，第14天，對(duì)入選患者抽取血樣，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)行T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定并記錄，作為治療后數(shù)據(jù)。同時(shí)行血尿便常規(guī)及生化檢查、心電圖、特異性檢查指標(biāo)及KPS評(píng)分等免疫細(xì)胞治療后檢查。

1.4主要觀察指標(biāo)(1)常規(guī)檢查指標(biāo)：血尿便常規(guī)及生化檢查、心電圖及生活質(zhì)量評(píng)分等治療前后指標(biāo)。(2)免疫檢查指標(biāo)：入選患者在應(yīng)用iAPA治療前后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CD3+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中計(jì)量資料采用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1治療前后常規(guī)檢查結(jié)果比較患者治療前后血尿便常規(guī)無(wú)明顯變化，肝腎功能無(wú)明顯降低，心電圖無(wú)明顯變化，KPS評(píng)分較前略有好轉(zhuǎn)。

2.2iAPA治療后患者的不良反應(yīng)在接受iAPA治療的12例患者中，7例出現(xiàn)發(fā)熱反應(yīng)，在24 h內(nèi)自行好轉(zhuǎn)，治療過(guò)程中，無(wú)腹瀉、嘔吐等不良事件發(fā)生。

2.3細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 DC流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果：第7天收獲貼壁細(xì)胞，用DC成熟標(biāo)記HLA-DR、CD83和CD86抗體進(jìn)行流式檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示：流式檢測(cè)CD83+、CD86+、HLA-DR+各指標(biāo)皆高表達(dá)，DC細(xì)胞已經(jīng)促成熟。

2.3.2 治療前后CD3+T淋巴細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果：輸入DC后，流式檢測(cè)此患者治療前全血CD3+T淋巴細(xì)胞比例為66.19%，治療后為77.43%；根據(jù)結(jié)果顯示，治療后CD3+T淋巴細(xì)胞所占比例升高(見(jiàn)圖2)。

注：A為FSC和SSC的散點(diǎn)圖，R1代表DC；B、C、D分別為HLA-DR+抗體、CD83抗體、CD86抗體標(biāo)記DC細(xì)胞直方圖。

圖2 治療前后血液CD3抗體流式檢測(cè)結(jié)果圖 A：治療前；B：治療后Fig 2 Flow chart of blood CD3 antibodies before and after the treatment A: before the treatment； B: after the treatment

2.4治療前后免疫指標(biāo)表達(dá)情況比較經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)，所有的患者治療后的CD3+T淋巴細(xì)胞所占比例均高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后有4例患者CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞所占比例高于治療前，有9例患者CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞所占比例高于治療前。但所有患者治療后CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例之和高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

表1 肝癌iAPA-DC治療前后外周血T細(xì)胞亞群測(cè)定Tab 1 T cell subsets in peripheral blood of patients before and after iAPA-DC infusion

3 討論

原發(fā)性肝癌是我國(guó)的高發(fā)腫瘤，目前對(duì)于早期肝癌，手術(shù)治療仍是首選手段。但是術(shù)后易復(fù)發(fā)、術(shù)后死亡率仍偏高是臨床需要攻克的主要難題。生物免疫細(xì)胞療法為解決上述難題提供了新的治療思路。本研究中的iAPA能抑制SOCS1表達(dá)，解除機(jī)體針對(duì)自體腫瘤存在免疫耐受。其中SOCS1是JAK/STAT信號(hào)通路的反饋抑制劑，通過(guò)影響DC調(diào)節(jié)抗原呈遞反應(yīng)。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，SOCS1沉默的DC(即iAPA細(xì)胞)可刺激自身抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cell, CTL)發(fā)揮作用。SOCS1沉默的DC可激活初始性CTL細(xì)胞，且進(jìn)一步研究[5]發(fā)現(xiàn)，SOCS1通過(guò)限制促炎癥因子如IL-12的產(chǎn)生和信號(hào)傳導(dǎo)而影響人體內(nèi)DC對(duì)CTL細(xì)胞的作用。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)iAPA-DC治療后的患者，CD3+T淋巴細(xì)胞比例及CD3+CD4+T+CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例之和較治療前顯著升高。

體外實(shí)驗(yàn)[6]表明，在肝炎患者中，CD3+T細(xì)胞在其肝單個(gè)核細(xì)胞中大量增加；CD3+T細(xì)胞在癌癥患者的肝單個(gè)核細(xì)胞中所占比例顯著高于無(wú)癌患者；另外，癌癥患者外周血中CD3+T細(xì)胞也顯著升高。這些證據(jù)充分顯示，CD3+T淋巴細(xì)胞對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞及異常的自身細(xì)胞起一定的作用。本組資料顯示，治療后的CD3+T淋巴細(xì)胞顯著高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明肝癌患者經(jīng)過(guò)iAPA-DC治療后， CD3+T淋巴細(xì)胞表現(xiàn)為高表達(dá)，對(duì)腫瘤的殺傷作用進(jìn)一步增強(qiáng)，其作用機(jī)制可能為經(jīng)iAPA因子(含抑制SOCS1的siRNA、腫瘤抗原Survivin及MUC1和鞭毛蛋白基因)轉(zhuǎn)染DC后，阻斷DC的免疫負(fù)調(diào)控通路，激活并促進(jìn)DC成熟，增強(qiáng)腫瘤特異性抗原(如Survivin)呈遞能力并致敏抗原特異性T淋巴細(xì)胞，使其T淋巴細(xì)胞高表達(dá)，引導(dǎo)其向瘤組織遷移，從而有效發(fā)揮抗腫瘤免疫治療的效果。

DC最重要的功能就是攝取、處理和提呈抗原，主要有MHCⅡ和MHCⅠ兩種途徑。一定條件下，分別提呈給CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞起到免疫應(yīng)答或細(xì)胞毒效應(yīng)?？乖碳こ跏糃D4+T淋巴細(xì)胞活化、分化成T輔助(Th)細(xì)胞，其在腫瘤免疫中對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞起重要作用，并且能夠分泌IFN-γ因子，提高細(xì)胞毒反應(yīng)。部分CD4+T淋巴細(xì)胞具有CTL細(xì)胞毒作用。CD8+T淋巴細(xì)胞是抗腫瘤免疫反應(yīng)過(guò)程中最主要的效應(yīng)細(xì)胞，發(fā)揮著核心作用，可釋放穿孔素和顆粒酶，直接殺死腫瘤靶細(xì)胞，導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡[7-8]。

CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫中起到重要作用[9-10]。本研究中所有患者治療后CD4+CD8+T淋巴比例之和明顯高于治療前，未出現(xiàn)CD4+CD8+T淋巴比例之和降低的現(xiàn)象，說(shuō)明iAPA-DC輸入患者后，可有效刺激抗原特異性CD4+T或CD8+T等效應(yīng)淋巴細(xì)胞增殖，提高效應(yīng)細(xì)胞比例，有利于刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。本結(jié)果說(shuō)明，iAPA-DC細(xì)胞治療肝癌后,提升了抗腫瘤免疫水平，對(duì)治療效果有正向作用。

綜上，iAPA-DC細(xì)胞免疫療法對(duì)肝癌的治病機(jī)制需要很多環(huán)節(jié)的詳細(xì)探討。本臨床試驗(yàn)研究中的病例數(shù)有限，尚需要進(jìn)行大規(guī)模的臨床試驗(yàn)性研究探討其具體作用機(jī)制。還有iAPA-DC免疫療法對(duì)肝癌患者的遠(yuǎn)期療效需要繼續(xù)隨訪觀察。僅從本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)來(lái)看，iAPA-DC免疫療法有望成為肝癌患者生物治療的首選方案之一。下一步，將繼續(xù)開(kāi)展臨床數(shù)據(jù)研究，如患者治療前后Treg細(xì)胞的流式檢測(cè)，血清中IL-2、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá)水平等，進(jìn)一步分析負(fù)調(diào)控基因技術(shù)iAPA-DC的治療作用。

[1] Shen L, Evel-Kabler K, Strube R, et al. Silencing of SOCS1 enhances antigen presentation by dendritic cells and antigen specific anti-tumor immunity [J]. Nat Biotechnol, 2004, 22(12): 1546-1553.

[2] Tobelaim WS, Beaurivage C, Champagne A, et al. Tumour-promoting role of SOCS1 in colorectal cancer cells [J]. Sci Rep, 2015, 5: 14301.

[3] 付海峰, 周文波, 丁佑銘, 等. 經(jīng)沉默免疫負(fù)調(diào)控基因技術(shù)處理的樹(shù)突狀細(xì)胞聯(lián)同細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)HepG2細(xì)胞移植瘤的抑制作用[J]. 臨床肝膽病雜志, 2014, 30(9): 891-894．

Fu HF, Zhou WB, Ding YM, et al. Inhibitory effect of iAPA-DC/CTL on HepG2 xenograft in nude mice [J]. J Clin Hepatol, 2014, 30(9): 891-894.

[4] 李焱, 程朋. 中晚期肝癌臨床治療進(jìn)展[J]. 臨床肝膽病雜志, 2014, 30(3): 233-236．

Li Y, Cheng P. Advances in treatment of advanced hepatocellular cancer [J]. J Clin Hepatol, 2014, 30(3): 233-236．

[5] Shi D, Li D, Yin Q, et al. Silenced suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1) enhances the maturation and antifungal immunity of dendritic cells in response to Candida albicans in vitro [J]. Immunol Res, 2015, 61(3): 206-218.

[6] Gabrielson A, Wu Y, Wang H, et al. Intratumoral CD3 and CD8 T-cell densities associated with relapse-free survival in HCC [J]. Cancer Immunol Res, 2016, 4(5): 419-430.

[7] Verma V, Kim Y, Lee MC, et al. Activated dendritic cells delivered in tissue compatible biomatrices induce in-situ anti-tumor CTL responses leading to tumor regression [J]. Oncotarget, 2016, 7(26): 39894-39906.

[8] Villalobos-Hernandez A, Bobbala D, Kandhi R, et al. SOCS1 inhibits migration and invasion of prostate cancer cells, attenuates tumor growth and modulates the tumor stroma [J]. Prostate Cancer Prostatic Dis, 2017, 20(1): 36-47.

[9] Hiroishi K, Eguchi J, Baba T, et al. Strong CD8(+) T-cell responses against tumor-associated antigens prolong the recurrence-free interval after tumor treatment in patients with hepatocellular carcinoma [J]. J Gastroenterol, 2010, 45(4): 451-458.

[10] Zhang HH, Mei MH, Fei R, et al. Regulatory T cell depletion enhances tumor specific CD8 T-cell responses, elicited by tumor antigen NY-ESO-1b in hepatocellular carcinoma patients, in vitro [J]. Int J Oncol, 2010, 36(4): 841-848.

(責(zé)任編輯：王全楚)

Studyonthecelltherapyofinhibitionofantigen-presentationattenuatorstoT-lymphocytesubsetsofhepatocellularcarcinomapatients

XU Xianyi1, REN Feng2, CHEN Dexi2, LI Ning2, XIE Bangxiang2, PIAO Zhengfu2

1.Department of Immunology, Nanjing Medical University, Nanjing 211166; 2.Beijing Institute of Liver Disease, Beijing YouAn Hospital， Capital Medical University, China

ObjectiveTo investigate the cell therapy of inhibition of antigen-presentation attenuators (iAPA) to T-lymphocyte subsets of hepatocellular carcinoma patients.MethodsIn this study, 12 patients with hepatocellular carcinoma were selected in the Nanjing Medical University Affiliated Hospital. The patients were treated with iAPA cell therapy twice. The lymphocyte subsets in peripheral blood of patients were examined by flow cytometry.ResultsThe general condition of patients were improved obsiously. The results showed that after iAPA cell therapy, the percentages of CD3+T, and the sum of CD3+CD4+T and CD3+CD8+T were increased significantly than before the treatment, respectively (P<0.05).ConclusioniAPA cell therapy improve can immunosuppressive status and T-lymphocytes response in liver cancer patients. iAPA cell therapy is one of the effective biological technology.

Antigen-presentation attenuators; Dentridic cells; Hepatocellular carcinoma; T-lymphocyte subsets

北京市科委肝病研究基金(BJIH-01509 )

徐獻(xiàn)毅，碩士，E-mail：xianyixu@163.com

樸正福，研究員，E-mail：zfpiao88@126.com；謝棒祥，副研究員，E-mail：yhx7201@126.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.11.005

R735.7

A

1006-5709(2017)11-1218-04

2017-03-03