弓形蟲泛素特異性蛋白酶TgUSP10的定位及其功能

陳璐璐,孫洪超，陽毅敏*，盛楷茵，姚晨倩，陳學秋，楊 怡，杜愛芳*

(1.浙江大學 動物科學學院 浙江省動物預防醫(yī)學重點實驗室/浙江大學動物預防醫(yī)學研究所，浙江 杭州 310012；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)簡稱弓形蟲，隸屬于頂復門，可感染幾乎所有的溫血動物，貓科動物為其終末宿主[1]。弓形蟲病是由弓形蟲感染引起的全球性人畜共患病，在免疫功能正常的機體中，弓形蟲病多不表現(xiàn)臨床癥狀，但對于免疫力低下者和孕婦、孕畜而言，弓形蟲感染能夠引起嚴重疾病甚至死亡，威脅人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展[1-2]?；前粪奏ず鸵野粪奏さ穆?lián)合用藥是目前臨床上應用最為廣泛的弓形蟲病治療方法，但其毒副作用明顯，因此，研發(fā)更為安全有效的弓形蟲藥物是當前研究的重點[3]。

泛素化修飾在弓形蟲中大量、廣泛存在，泛素相關(guān)信號通路中的關(guān)鍵因子有望成為弓形蟲病防控的潛在藥物靶標[4]。去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)通過移除底物蛋白上的單泛素分子或多聚泛素鏈，逆轉(zhuǎn)泛素化過程，進而調(diào)控蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、DNA損傷修復、細胞周期、線粒體自噬以及免疫應答等多個進程[5]。弓形蟲基因組編碼約40種DUBs，根據(jù)人類DUBs的分類[6]，可以分為泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific proteases，USPs)、泛素羧基末端水解酶(ubiquitin C-terminal hydrolases，UCHs)、卵巢腫瘤相關(guān)蛋白酶(ovarian tumour proteases，OTUs)、Machado-Joseph結(jié)構(gòu)域蛋白酶(machado-Joseph domain-containing proteases，MJDs)、JAMM/MPN域相關(guān)金屬肽酶(JAMM/MPN domain-associated metallopeptidases，JAM-Ms)和MINDY蛋白酶(motif interacting with ubiquitin-containing novel DUB family proteases，MINDYs)6大類[4]。目前僅有關(guān)于TgUCHL3和TgOTUD3A的報道[7-9]，其余的DUBs在弓形蟲中的定位和功能仍有待研究。USPs是已知數(shù)量最多且結(jié)構(gòu)最為多樣的一類DUBs亞家族，其中，人USP10在DNA損傷修復[10]、自噬調(diào)節(jié)[11-12]和核糖體循環(huán)[13]等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本試驗利用BLASTp檢索鑒定出弓形蟲中人USP10的同源基因TgUSP10，并通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建TgUSP10的內(nèi)源性標記蟲株，以檢測其在弓形蟲中的定位，同時對TgUSP10進行敲除，從而探究其在弓形蟲體外增殖過程中的作用，為今后評價去泛素化酶作為潛在藥物靶標的可能性提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲株與細胞弓形蟲RH△ku80△hxgprt蟲株(以下簡稱RH△ku80)和人包皮成纖維細胞(human foreskin fibroblasts，HFF-1)由本實驗室保存。

1.2 質(zhì)粒與菌株pSAG1::CAS9-U6::sgBbsⅠ由本實驗室在華中農(nóng)業(yè)大學申邦教授惠贈的pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT的基礎(chǔ)上改造后保存；pSL10-6×HA-LoxP-HX-LoxP-T7質(zhì)粒為中國農(nóng)業(yè)大學龍少軍教授惠贈；pBlue-DHFR質(zhì)粒和E.coliTOP10感受態(tài)細胞由本實驗室保存。

1.3 工具酶、抗體及藥物T4多聚核苷酸激酶(BioLabs)；BbsⅠ(Thermo)；KOD ONE(Toyobo)；鼠源TgIMC1多克隆抗體、鼠源弓形蟲全蟲蛋白多克隆抗體、兔源TgGAP45多克隆抗體為本實驗室制備并保存；兔源HA-Tag單克隆抗體(CST)；Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 594標記的山羊抗鼠IgG(Invitrogen)；DAPI(碧云天)；黃嘌呤、霉酚酸、乙胺嘧啶(Sigma)。

1.4TgUSP10同源蛋白的鑒定根據(jù)人USP10的氨基酸序列(NP_005144.2)，利用NCBI的BLASTp檢索功能，確定弓形蟲中的同源蛋白TgUSP10(TGGT1_221610)。

1.5TgUSP10內(nèi)源性標記蟲株(TgUSP10-6HA)的構(gòu)建

1.5.1內(nèi)源性標記質(zhì)粒的構(gòu)建 利用EuPaGDT網(wǎng)站(http://grna.ctegd.uga.edu/)設(shè)計靶向TgUSP10基因3′UTR序列的sgRNA，合成帶BbsⅠ酶切位點的引物sgUSP10-6HA-F和sgUSP10-6HA-R(表1)。將引物與T4多聚核苷酸激酶預混，經(jīng)梯度降溫合成雙鏈，產(chǎn)物與酶切后的pSAG1::CAS9-U6::sgBbsⅠ質(zhì)粒相連，構(gòu)建內(nèi)源性標記質(zhì)粒。

1.5.2供體片段的擴增 以pSL10-6×HA-LoxP-HX-LoxP-T7質(zhì)粒為模板，以6HA-HXGPRT-F和6HA-HXGPRT-R(表1)為引物，利用KOD ONE酶擴增供體片段。

1.5.3電轉(zhuǎn) 收集1×107個新鮮逸出的RH△ku80速殖子，與7.5 μg內(nèi)源性標記質(zhì)粒、10 μg供體片段、50 μg谷胱甘肽和300 μg ATP預混，在1 600 V、25 μF、200 Ω條件下完成電擊。

1.5.4藥物篩選與鑒定 利用質(zhì)量濃度均為25 mg/L 的霉酚酸和黃嘌呤藥物篩選單克隆，以RH△ku80為對照，用引物PCR-F和PCR-R(表1)進行PCR鑒定，同時利用Western blot驗證重組蛋白的表達。

表1 構(gòu)建TgUSP10-6HA蟲株的引物

1.6TgUSP10亞細胞定位與表達水平分析在24孔培養(yǎng)板中放入細胞爬片，待HFF-1細胞長至單層后，接入TgUSP10-6HA蟲株，培養(yǎng)24 h。經(jīng)4%多聚甲醛固定、0.25%Triton-100透化及1%BSA封閉后，以兔源HA-Tag單克隆抗體(1∶500)和鼠源TgIMC1多克隆抗體(1∶500)為一抗，Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)和Alexa Fluor 594標記的山羊抗鼠IgG(1∶1 000)為二抗，進行IFA試驗，激光共聚焦顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。

1.7TgUSP10基因缺失株(△TgUSP10)的構(gòu)建利用EuPaGDT網(wǎng)站(http://grna.ctegd.uga.edu/)設(shè)計靶向TgUSP10基因的sgRNA，合成sgUSP10-KO-F和sgUSP10-KO-R(表2)，構(gòu)建CRISPR/Cas9敲除質(zhì)粒。以pBlue-DHFR質(zhì)粒為模板，DHFR-F和DHFR-R(表2)為引物，擴增供體片段。將敲除質(zhì)粒和供體片段電轉(zhuǎn)至RH△ku80蟲株，利用濃度為3 μmol/L的乙胺嘧啶藥物篩選單克隆，并提取基因組進行PCR鑒定。具體步驟參照1.5。

表2 構(gòu)建△TgUSP10蟲株的引物

1.8 △TgUSP10蟲株的表型分析

1.8.1噬斑試驗 在長滿HFF-1細胞的6孔板中每孔接入200個△TgUSP10或RH△ku80蟲株，培養(yǎng)7 d。經(jīng)PBS洗滌、甲醇固定及0.1%結(jié)晶紫染色后，利用掃描儀記錄噬斑結(jié)果，并對不同蟲株形成噬斑的數(shù)量和相對面積進行統(tǒng)計。

1.8.2黏附/入侵試驗 在24孔培養(yǎng)板中放入細胞爬片，待HFF-1細胞長至單層后，每孔接入5×106個△TgUSP10或RH△ku80蟲株。30 min后，4%多聚甲醛固定，1%BSA 封閉，以鼠源弓形蟲全蟲蛋白多克隆抗體(1∶2 000)為一抗，Alexa Fluor 594標記的山羊抗鼠IgG(1∶1 000)為二抗，標記細胞外的速殖子。經(jīng)0.25%Triton-100透化及1% BSA封閉后，用兔源TgGAP45多克隆抗體(1∶500)和Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)標記全部速殖子，最后加入DAPI對細胞核進行染色。每個樣品利用激光共聚焦顯微鏡隨機拍攝10個視野，計算平均每個細胞黏附/入侵的速殖子數(shù)量以及入侵率。

1.8.3復制試驗 在24孔培養(yǎng)板中放入細胞爬片，待HFF-1細胞長至單層后，每孔接入1×105個△TgUSP10或RH△ku80蟲株，3 h后移除未入侵的速殖子。培養(yǎng)24 h后，經(jīng)甲醇固定和1%BSA封閉后，以兔源TgGAP45多克隆抗體(1∶500)為一抗，Alexa Fluor 594標記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)為二抗，進行IFA試驗。每個樣品利用激光共聚焦顯微鏡隨機拍攝10個視野，計算速殖子數(shù)量為2，4，8，16個的納蟲泡數(shù)量占總數(shù)量的比例。

1.8.4逸出試驗 如1.8.3操作向HFF-1細胞內(nèi)接入△TgUSP10或RH△ku80蟲株，培養(yǎng)36 h后，加入濃度為3 μmol/L的鈣離子載體，作用3 min，后續(xù)染色同1.8.2。每個樣品利用激光共聚焦顯微鏡隨機拍攝10個視野，計算速殖子逸出的納蟲泡數(shù)量占總數(shù)量的比例。

1.9 統(tǒng)計學分析利用GraphPad Prism 7.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，使用t檢驗或Two-way ANOVA進行差異分析。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建TgUSP10-6HA蟲株將內(nèi)源性標記質(zhì)粒與供體片段共轉(zhuǎn)至RH△ku80構(gòu)建TgUSP10-6HA蟲株(圖1A)。提取單克隆蟲株基因組進行PCR擴增，條帶大小為727 bp，符合預期(圖1B)；提取蟲株總蛋白進行Western blot檢測，反應條帶位于96 kDa處，證實TgUSP10-6HA融合蛋白成功表達(圖1C)。結(jié)果表明，TgUSP10-6HA蟲株構(gòu)建成功。

A.TgUSP10-6HA蟲株構(gòu)建及PCR鑒定引物設(shè)計示意圖；B.TgUSP10-6HA蟲株的PCR鑒定；C.TgUSP10-6HA重組蛋白的Western blot驗證

2.2TgUSP10定位于蟲體細胞質(zhì)以兔源HA-tag單克隆抗體為一抗對TgUSP10-6HA蟲株進行IFA試驗，可見TgUSP10定位于速殖子的細胞質(zhì)(圖2)。在同一拍攝條件下，記錄了TgUSP10在細胞周期不同階段的表達水平變化，結(jié)果顯示，與已知的TgUSP10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平[14](圖3)變化一致，TgUSP10在G1期、S期和分裂后期表達量較高，分裂前期和分裂中期表達量較低，呈現(xiàn)細胞周期性表達(圖4)。

圖2 TgUSP10在胞內(nèi)蟲體的定位分析

圖3 TgUSP10在細胞周期不同階段的mRNA轉(zhuǎn)錄水平

圖4 TgUSP10在細胞周期不同階段的表達水平

2.3 成功構(gòu)建△TgUSP10蟲株將敲除質(zhì)粒與供體片段共轉(zhuǎn)至RH△ku80構(gòu)建△TgUSP10蟲株(圖5A)。對經(jīng)藥物篩選后的單克隆蟲株進行PCR鑒定，PCR1、PCR2和PCR3的結(jié)果共同說明TgUSP10的全長CDS被DHFR藥篩標記替代(圖5B)，△TgUSP10蟲株構(gòu)建成功。

A.△TgUSP10蟲株構(gòu)建及PCR鑒定引物設(shè)計示意圖；B.△TgUSP10蟲株的PCR鑒定

2.4 △TgUSP10蟲株體外生長變慢利用噬斑試驗評估△TgUSP10蟲株在細胞內(nèi)的生長情況，結(jié)果顯示△TgUSP10與RH△ku80蟲株均能形成噬斑，兩者在數(shù)量上無明顯差異，但△TgUSP10的噬斑面積顯著減小，表明弓形蟲缺失TgUSP10后生長受到抑制(圖6)。進一步對△TgUSP10進行黏附/入侵、復制和逸出試驗，與對照蟲株相比，△TgUSP10的復制能力減弱，而黏附/入侵和逸出宿主細胞的能力則無明顯變化(圖7)。

A.噬斑試驗掃描結(jié)果；B.噬斑數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果(采用t檢驗)；C.噬斑相對面積統(tǒng)計結(jié)果(采用t檢驗)，其中****表示P<0.000 1

A.黏附/入侵試驗統(tǒng)計結(jié)果(采用t檢驗)；B.復制試驗統(tǒng)計結(jié)果(采用Two-way ANOVA)，其中*表示P<0.05，****表示P<0.000 1；C.逸出試驗統(tǒng)計結(jié)果(采用t檢驗)

3 討論

USP10是一種重要的USP家族去泛素化酶，已知人USP10參與p53[10]、CFTR[15]、AMPKα[12]、SIRT6[16]和NEMO[17]等蛋白的去泛素化，在細胞代謝和人類疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。本研究確定了弓形蟲中與人USP10同源的蛋白TgUSP10，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的同源重組技術(shù)，將TgUSP10與6HA標簽融合表達，確定TgUSP10主要定位于細胞質(zhì)。進一步構(gòu)建TgUSP10的基因缺失株，表型試驗結(jié)果表明TgUSP10缺失后，弓形蟲內(nèi)二分裂過程減慢，生長受阻。

鑒定DUBs的亞細胞定位可以為探究其底物和功能提供線索和依據(jù)[19]。在正常條件下，人USP10定位于細胞質(zhì)，參與細胞質(zhì)中抑癌蛋白p53的去泛素化過程，調(diào)節(jié)p53穩(wěn)態(tài)；然而在DNA損傷后，部分USP10在細胞核中積累，參與細胞核中p53蛋白的去泛素化[10]。本試驗結(jié)果表明，TgUSP10主要定位于細胞質(zhì)，可能參與弓形蟲胞質(zhì)蛋白的去泛素化過程，具體的靶標蛋白以及其是否存在與人USP10類似的易位現(xiàn)象仍有待研究。SILMON等[4]在胞內(nèi)速殖子中鑒定出454個發(fā)生泛素化修飾的蛋白質(zhì)，它們在蟲體中廣泛分布，其中，細胞質(zhì)定位最為豐富，占32%，細胞骨架和內(nèi)膜復合體蛋白占18%，胞質(zhì)胞核分布的蛋白占8%，另有13種定位于頂質(zhì)體或線粒體，這提示了DUBs在弓形蟲中定位的多樣性。

作為一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲，弓形蟲在細胞內(nèi)進行復制的能力與其致病力密切相關(guān)[20]。研究表明，DUBs在弓形蟲復制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，蟲體缺失TgOTUD3A后，其復制會偏離正常的內(nèi)二分裂過程，而在母體內(nèi)產(chǎn)生多個子代[9]。本試驗結(jié)果表明，TgUSP10在弓形蟲復制過程中發(fā)揮重要作用，缺失TgUSP10后，蟲株的復制能力降低。在其他物種中，USP10的缺失也檢測到了類似的表型：在人胚腎293細胞中敲除USP10基因后，細胞的復制速率降低[13]；酵母缺失Ubp3(人USP10在酵母中的同源基因)后，復制壽命縮短，約為野生型的70%[21]。已知人USP10參與核糖體的回收，其與G3BP1形成的復合物可作用于單泛素化的核糖體蛋白RPS2、RPS3和RPS10，防止核糖體40S亞基的降解[13]。弓形蟲中有33種核糖體蛋白質(zhì)可發(fā)生泛素化，其中包括TgRPS2和TgRPS3[4]，推測TgUSP10可能參與這些核糖體蛋白的去泛素化從而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其缺失促進了核糖體蛋白的降解，進而限制了弓形蟲的生長速度。

綜上，本試驗明確了TgUSP10的亞細胞定位及其在弓形蟲體外增殖中發(fā)揮的重要作用，為后續(xù)進一步闡明其功能和作用機制奠定了基礎(chǔ)。