酰胺酶催化合成手性氨基酸的研究進展

顧誠偉，曹成浩，金利群，薛亞平

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

酰胺酶催化合成手性氨基酸的研究進展

顧誠偉，曹成浩，金利群，薛亞平

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

手性氨基酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品、化妝品等行業(yè)，開發(fā)高效、原子經(jīng)濟性高、環(huán)境友好的手性氨基酸合成方法具有重要的意義.酰胺酶由于其底物范圍廣、立體選擇性專一、反應(yīng)條件溫和，在制備光學(xué)純氨基酸方面具有巨大潛力.對酰胺酶的來源、分類、作用機理及在制備手性氨基酸中的應(yīng)用等方面進行了綜述，重點介紹了酰胺酶在制備D-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-苯甘氨酸、O-甲基-D-絲氨酸和L-2-羧酸-哌嗪中的應(yīng)用.探討了酰胺酶存在的問題與未來的發(fā)展趨勢，隨著基因工程技術(shù)研究的不斷深入，將會有更多的酰胺酶被開發(fā)出來并用于手性氨基酸的生產(chǎn).

酰胺酶；手性氨基酸；酶法拆分；生物催化

手性氨基酸由于存在不同的生理作用而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品和化妝品中.在醫(yī)藥行業(yè)中，L-高苯丙氨酸是制備依那普利、賴諾普利、喹那普利、雷米普利、苯那普利和群多普利等藥物的關(guān)鍵中間體[1]；L-高丙氨酸是制備左乙拉西坦或布瓦西坦(抗癲癇藥)和乙胺丁醇(抗結(jié)核藥)等藥物的關(guān)鍵中間體[2]；D-氨基酸常用于半合成抗生素的合成，包括青霉素頭孢類抗生素的母核，例如使用D-天冬氨酸和阿莫西林為原料化學(xué)合成阿撲西林[3]；含有D-氨基酸的整合蛋白可以抑制一些疾病的侵襲，如包含D-氨基酸的整合蛋白可以抑制前列腺癌和肺部定植[4]；含D-氨基酸的多肽抑制劑可以預(yù)防或早期治療阿爾茨海默病[5].在農(nóng)藥行業(yè)中，L-草銨膦是一種廣譜、觸殺型、滅生型、非殘留除草劑，前景非常廣闊.在食品行業(yè)中，L-谷氨酸鈉為調(diào)味劑，L-賴氨酸、L-半胱氨酸為食品添加劑，D構(gòu)型的丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸，亮氨酸和纈氨酸，味道比L-異構(gòu)體更甜美[6].含有D-氨基酸的甜味劑甜度比只含有L-氨基酸的甜味劑甜度高很多[7].D-苯甘氨酸是人造甜味劑阿巴斯甜的重要原料[8]，不但高效而且熱量低，減肥人士或糖尿病患者以此作為糖的替代品.在化妝品行業(yè)中，D-天冬氨酸具有抗氧化和促進膠原蛋白合成的作用，D-谷氨酸可以促進皮膚恢復(fù)并減少皺紋的形成，D-色氨酸具有減少紫外線損傷的能力，以上氨基酸均可用于水油型乳液護膚化妝品中[9].

手性氨基酸的合成方法包括化學(xué)法、發(fā)酵法和生物酶法.傳統(tǒng)化學(xué)法制備手性氨基酸需要開發(fā)手性催化劑，存在催化劑價格較貴等缺點，不利于手性氨基酸的大規(guī)模生產(chǎn)；發(fā)酵法是生產(chǎn)手性氨基酸最主要的方法，但是能夠生產(chǎn)的手性氨基酸種類有限，特別是很難生產(chǎn)D-氨基酸；相比之下，利用外消旋混合物酶法生產(chǎn)光學(xué)純異構(gòu)型氨基酸，產(chǎn)生副產(chǎn)物少、反應(yīng)條件溫和，具有潛在的優(yōu)勢.可以用來制備氨基酸的生物酶包括水解酶、氧化還原酶和轉(zhuǎn)氨酶等.水解酶又包括海因酶偶聯(lián)N-氨甲酰水解酶、N-酰基水解酶、氨基酸酰胺酶和氨肽酶等；氧化還原酶最常見的為氨基酸氧化酶和氨基酸脫氫酶.酰胺酶(EC 3.5.1.4)能夠水解氨基酸酰胺的酰胺鍵生成手性氨基酸和氨氣，可將外消旋氨基酸酰胺拆分成純對映異構(gòu)體的氨基酸，若和氨基酸酰胺消旋酶協(xié)同催化，外消旋氨基酸可完全轉(zhuǎn)化為手性氨基酸.來自各種不同微生物的立體選擇性酰胺酶在工業(yè)生產(chǎn)純光學(xué)活性化合物中具有潛在用途，引起人們廣泛的關(guān)注，筆者綜述了利用酰胺酶生產(chǎn)手性氨基酸的方法.

1 酰胺酶的來源及分類

酰胺酶來源十分廣泛，存在于動物的腎臟和胰腺、植物和微生物中，如老鼠的肝臟提取物[10]、豬的大腦[11]、橙皮[12]等.目前所報道的用來制備手性氨基酸的酰胺酶主要來源于微生物，如可用于制備L-構(gòu)型氨基酸的產(chǎn)L-酰胺酶菌株主要有假單孢菌屬PseudomonasazotoformansIAM 1603[13-14]、蒼白桿菌屬OchrobactrumanthropiNCIMB 40321[15]、紅球菌屬Rhodococcussp.[16]和RhodococcusrhodochrousPA-34[17]、假諾卡氏菌屬Pseudonocardiathermophile[18]、黃桿菌屬FlavobacteriumaquatileZJB-09211[19-20]、短桿菌屬BrevibacteriumR312[21]、曲霉屬Aspergillusfurmigatus[22]、單胞菌屬BrevundimonasdiminutaTPU 5720[23]、黃色桿菌屬XanthobacterflavusNR303[24]、代爾夫特菌屬DelftiatsuruhatensisZJB-05174[25]和食清潔劑細(xì)小棒菌ParvibaculumlavamentivoransZJB14001[26]等.可用于制備D-構(gòu)型氨基酸的產(chǎn)D-型酰胺酶菌株主要有短桿菌屬BrevibacteriumiodinumTPU 5850[27]、蒼白桿菌屬OchrobactrumanthropiC1-38[28-29]和OchrobactrumanthropiSV3[30-34]、短芽孢桿菌屬BrevibacillusborstelensisBCS-1[35]、β-變形桿菌Variovoraxparadoxus19-3[36]、代爾夫特菌屬Delftiaacidovorans[37]和短桿菌屬BrevibacteriumepidermidisZJB-07021[38]等.

許多學(xué)者嘗試對酰胺酶進行分類，但這些酶的分類并沒有被廣泛認(rèn)同.根據(jù)立體選擇可將酰胺酶分為L-構(gòu)型酰胺酶(LaaA)和D-構(gòu)型酰胺酶(DaaA)，但酰胺酶的立體選擇性受底物、溫度和pH等因素的影響[39]，根據(jù)酰胺酶對不同底物的催化活性可將酰胺酶分為對映選擇性酰胺酶、脂肪酸酰胺酶、芳香族酰胺酶、D-氨肽酶、芳基?；０访浮ⅵ?氨基酰胺酶及廣譜氨基酸酰胺酶[40].Chebrou等[41]對酰胺酶進行了分子生物學(xué)研究，通過酰胺酶氨基酸序列在數(shù)據(jù)庫的多重比對將酰胺酶分為腈水解酶家族和AS(Amidase signature)家族兩大類.腈水解酶家族酰胺酶以同源四聚體或六聚體的形式存在，催化中心為Glu，Cys和Lys組成的三聯(lián)體[42]，該類酶只對脂肪族酰胺具有較高的活性.AS家族酰胺酶則以同源二聚體或八聚體形式存在，顯示出一個高度保守的GGSS區(qū)域，催化中心為Ser，Ser和Lys組成的三聯(lián)體[43]，該類酰胺酶對芳香族、脂肪族和雜環(huán)酰胺具有較高的活性.

2 酰胺酶的催化機理

盡管人們研究酰胺酶已經(jīng)很多年，但是關(guān)于酰胺酶的催化機理并不完全確定，Mileni等[44]闡述了脂肪酸酰胺酶FAAH的反應(yīng)機理，F(xiàn)AAH屬于AS酰胺酶家族的一員，來源于細(xì)菌、古細(xì)菌和真核生物.FAAH的催化機理可概括為以下4個步驟：1) 通過激活的絲氨酸親核進攻底物的酰胺羰基，生成一個酶聯(lián)四面體結(jié)構(gòu)的中間體；2) 隨后一部分底物離去(氨基)形成?；?酶中間體；3) 被一個活化水分子攻擊，生成第二個酶聯(lián)四面體結(jié)構(gòu)的中間體；4) 分解成羧酸化合物，酶得到再生.FAAH酰胺酶的催化機理為

3 酰胺酶在制備手性氨基酸中的應(yīng)用

酰胺酶在工業(yè)制備光學(xué)純氨基酸方面具有巨大的潛力，隨著對氨基酸酰胺酶研究的深入，越來越多的氨基酸酰胺可以被酰胺酶特異性水解(表1).其中PseudomonasazotoformansIAM 1603[14]和BrevundimonasdiminutaTPU 5720[23]產(chǎn)L-特異性酰胺酶，分別以對脯氨酸酰胺(192.0 U/mg)和苯丙氨酸酰胺(29.6 U/mg)的酶活為相對酶活100%，其余菌產(chǎn)D-特異性酰胺酶，分別以對苯丙氨酸酰胺(7.9 U/mg)、蛋氨酸酰胺(131.4 U/mg)、丙氨酸酰胺(596.0 U/mg)和苯丙氨酸酰胺(367.0 U/mg)為相對酶活100%.這些酰胺酶均具有廣泛的底物特異性，為了進一步提高氨基酸酰胺酶催化制備手性氨基酸的效率，研究者嘗試從嗜熱微生物中篩選耐熱氨基酸酰胺酶[18,35]，提高酰胺酶的穩(wěn)定性；利用定向進化技術(shù)提高酶的穩(wěn)定性和活性[32]；使用添加劑提升酶的反應(yīng)速率[19,35]；開發(fā)氨基酸酰胺消旋酶，實現(xiàn)酰胺酶的動態(tài)動力學(xué)拆分，使手性氨基酸理論收率達(dá)100%[45].這些研究為酰胺酶制備手性氨基酸的工業(yè)化提供了重要的理論依據(jù).

表1 來源于不同微生物的酰胺酶對氨基酸酰胺的底物特異性1)

注：1) 酶活定義均為每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol底物生成產(chǎn)物所需要的酶量，所有數(shù)值均為相對酶活.

3.1 酰胺酶制備D-苯丙氨酸

D-苯丙氨酸在醫(yī)藥、農(nóng)藥和食品領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用，是用于治療糖尿病、高血壓和抑郁癥等疾病的原料藥，屬于非天然氨基酸，無法用發(fā)酵法生產(chǎn).Komeda等[31]利用來自O(shè)chrobactrumanthropiSV3的D-特異性氨基酰胺酶催化D-苯丙氨酸酰胺制備D-苯丙氨酸，溫度為45 ℃時達(dá)到最高酶活，對L-苯丙氨酸酰胺或其他L構(gòu)型氨基酸酰胺無活性.隨后，作者為了提高該酶的熱穩(wěn)定性，通過定向進化理論篩選得到熱突變酶，與野生型相比，熱突變酶最適溫度提高5 ℃，表觀Km值相同，Vmax提升約3倍，2 h可將1 mol/L的外消旋苯丙氨酸酰胺完全拆分，相同時間轉(zhuǎn)化率是原野生型酶的1.7倍[32].生物催化劑的穩(wěn)定性是酶法生產(chǎn)最重要的因素之一.一般來說，嗜熱菌產(chǎn)生的耐熱酶具有高的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和有機溶劑穩(wěn)定性.Baek等[35]首次報道從嗜熱菌中獲得D-氨基酸酰胺酶，將從嗜熱菌BrevibacillusborstelensisBCS-1中獲得的D-蛋氨酸酰胺酶用于制備D-苯丙氨酸，酶的最適pH和溫度分別為9.5和70 ℃，產(chǎn)物D-苯丙氨酸的e.e.和E值分別為97.1和196%.

通過外消旋氨基酸酰胺制備手性氨基酸，氨基酸最高收率只有50%，因為特異性氨基酸酰胺酶只催化單一構(gòu)型底物，如果氨基酸酰胺消旋酶可以與特異性酰胺酶協(xié)同催化，可將其余氨基酸酰胺拆分為手性氨基酸，使得光學(xué)純氨基酸的收率達(dá)到100%，因此，實現(xiàn)氨基酸酰胺動態(tài)動力學(xué)拆分的關(guān)鍵是氨基酸酰胺消旋酶.Asano等[45]首次發(fā)現(xiàn)來自菌株Achromobacterobae的α-氨基-ε-己內(nèi)酰胺消旋酶(ACL消旋酶)可以將氨基酸酰胺作為底物，并且對大多數(shù)氨基酸酰胺均有活性，如L-2-氨基丁酸酰胺、L-丙氨酸酰胺、L-蘇氨酸酰胺、L-蛋氨酸酰胺和L-苯丙氨酸酰胺等.隨后利用ACL消旋酶和D-特異性酰胺酶(來自O(shè)chrobactrumanthropiC1-38)協(xié)同催化L-丙氨酸酰胺(45 mmol/L)，7 h后D-丙氨酸收率達(dá)到99.7%.該系統(tǒng)可廣泛應(yīng)用于各種氨基酸酰胺類化合物，但ACL消旋酶對苯丙氨酸酰胺活性不高[28].Yasukawa等[34]又通過定向進化突變ACL消旋酶，得到突變ACL消旋酶(L19V/L78T)，該突變酶提高了對苯丙氨酸和苯丙氨酸衍生物(4-OH, 4-F, 3-F和2-F-Phe)的底物特異性，并且與耐熱突變D-特異性氨基酸酰胺酶(OchrobactrumanthropiSV3)[32]共同表達(dá)，動態(tài)動力學(xué)拆分外消旋苯丙氨酸酰胺，D-苯丙氨酸酰胺首先被D-酰胺酶催化生成D-苯丙氨酸，L-苯丙氨酸酰胺在消旋酶的作用生成外消旋苯丙氨酸酰胺，22 h催化400 mmol/L的底物，收率和e.e.值分別為84%和99%.動態(tài)動力學(xué)拆分外消旋苯丙氨酸酰胺制備D-苯丙氨酸[25]的過程為

3.2 酰胺酶制備L-色氨酸

L-色氨酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品行業(yè)，可作為制備其他手性化合物的前體物質(zhì).發(fā)酵法和化學(xué)法均有很多生產(chǎn)L-色氨酸的方法，但是發(fā)酵法產(chǎn)量偏低，而化學(xué)法通常會產(chǎn)生D-構(gòu)型的色氨酸.很多L-酰胺酶對色氨酸酰胺有活性，如表1中的兩個產(chǎn)L-酰胺酶菌株，其酶活分別為0.38 U/mg[14]和12.14 U/mg[23]，但都沒有得到規(guī)?；膽?yīng)用.本實驗室Xu等[20]利用產(chǎn)L-特異性酰胺酶的靜息細(xì)胞FlavobacteriumaquatileZJB-09211從色氨酸酰胺催化制備L-色氨酸，L-色氨酸的e.e.和E值分別達(dá)到99.9%和200.但是由于色氨酸酰胺在水中的溶解度較差(20 mmol/L)，限制了催化反應(yīng)進程.隨后，Xu等[19]首次報道了添加水不溶性有機溶劑乙酸乙酯來提高酰胺酶的生產(chǎn)能力，結(jié)果顯示當(dāng)添加30%(體積分?jǐn)?shù))乙酸乙酯時，靜息細(xì)胞的酶活達(dá)到最高5 118.62 U/g.成功將色氨酸酰胺的溶解度提高到200 mmol/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.85%，產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸e.e.>99.95%.這種添加有機溶劑提高酰胺酶催化活性的方法，為某些氨基酸酰胺因為其本身在水中的溶解度低而導(dǎo)致催化效率低的情況提供了思路，也有利于將不溶性有機溶劑從酶反應(yīng)體系中分離并且回收利用.

3.3 酰胺酶制備L-苯甘氨酸

L-苯甘氨酸是非天然的芳香族α-氨基酸，L-苯甘氨酸及其衍生物是一類重要的藥物中間體，如L-鄰氯苯甘氨酸是合成血小板抑制劑氯吡格雷的重要中間體.源自O(shè)chrobactrumanthropiNCIMB 40321[15]的L-特異性酰胺酶有廣泛的底物特異性，對L-苯甘氨酸酰胺具有最高的活性，酶活達(dá)到2 000 nmol/(min·mg)，e.e.>99%.腈類化合物在微生物中可經(jīng)兩種方法轉(zhuǎn)化為游離酸：第一種為腈水解酶直接將腈水解為相應(yīng)的游離酸；第二種為腈在腈水合酶的作用下，先生成相應(yīng)的酰胺，再由酰胺酶催化為游離羧酸.故酰胺酶可以和腈水合酶協(xié)同催化腈類化合物生成手性氨基酸，如Hensel等[46]直接利用全細(xì)胞Pantoeaendophytica26.2.2產(chǎn)生L選擇性腈酰胺酶和腈水合酶催化苯甘氨酸腈，可獲得e.e.值99%的L-苯甘氨酸.Wegman等[16]利用非選擇性的腈水合酶和L選擇性的氨基酸酰胺酶催化苯乙腈得到L-苯甘氨酸，產(chǎn)物L(fēng)-苯甘氨酸和D-苯甘酰胺的相對收率分別達(dá)到48%和52%，e.e.值分別達(dá)到97%和99%以上.腈水合酶-酰胺酶催化苯甘氨腈制備L-苯甘氨酸的過程為

3.4 酰胺酶制備O-甲基-D-絲氨酸

拉科酰胺是重要的第二代藥物之一，是一種輔助性治療糖尿病和神經(jīng)性疼痛的活性物質(zhì)，O-甲基-D-絲氨酸是合成該藥物的中間體，拉科酰胺中唯一的手性碳原子就來自O(shè)-甲基-D-絲氨酸.合成O-甲基-D-絲氨酸的方法不多，主要有兩種：方法一以D-絲氨酸作為初始反應(yīng)物；方法二以O(shè)-甲基-D,L-絲氨酸作為初始反應(yīng)物.但兩種方法均存在缺陷，D-絲氨酸是一種昂貴的手性試劑，若以它為初始反應(yīng)物會造成成本的增加，而O-甲基-D,L-絲氨酸作為起始反應(yīng)物，導(dǎo)致O-甲基-L-絲氨酸原料的浪費，降低了原子利用率.Wang等[30]報道了化學(xué)酶法動態(tài)動力學(xué)拆分O-甲基-D,L-絲氨酸酰胺制備光學(xué)活性O(shè)-甲基-D-絲氨酸的方法.以廉價的化合物丙烯酰胺作為起始物質(zhì)，包括四步反應(yīng)：溴化丙烯酰胺，醚化二溴丙酰胺，氨取代溴，酶動態(tài)動力學(xué)拆分.雙酶系統(tǒng)包括ACL消旋酶(Locus, E01594)和D-特異性氨基酸酰胺酶(Locus, AB026907).10 h可完全催化300 mmol/L的D,L-O-甲基-D,L-絲氨酸酰胺，產(chǎn)物e.e.>99.8%，酶動態(tài)動力學(xué)拆分收率達(dá)到98.5%，總收率達(dá)到81.3 %.化學(xué)酶法合成O-甲基-D-絲氨酸的過稱為

3.5 酰胺酶制備L-2-羧酸-哌嗪

L-2-羧酸-哌嗪屬于非蛋白質(zhì)氨基酸，是一種HIV蛋白酶抑制劑等藥物的中間體，Eichhorn等[47]利用KlebsiellaDSM 9174產(chǎn)L-特異性酰胺酶制備L-2-羧酸-哌嗪，并且已經(jīng)能達(dá)到規(guī)?；霓D(zhuǎn)化，首先在1.5 L含外消旋2-甲酰胺-哌嗪的發(fā)酵罐中(1 L工作體積)培養(yǎng)KlebsiellaDSM 9174，16 h后，直接調(diào)節(jié)pH和溫度等參數(shù)提高酶水解速率，36～72 h可完全水解22 g/L(173 mmol/L)的外消旋底物，反應(yīng)結(jié)束后，離心去除細(xì)胞，通過濃縮酸化沉淀獲得L-2-羧酸-哌嗪，收率達(dá)到41%，e.e.>99.4%.該工藝操作簡便，產(chǎn)物容易分離，并且已被龍沙公司(Lonza AG)應(yīng)用于商業(yè)化.Komeda等[14]利用來自PseudomonasazotoformansIAM1603的酰胺酶制備L-2-羧酸-哌嗪，并首次報道了酰胺酶可水解N端的笨重側(cè)鏈，如含叔丁基側(cè)鏈的酰胺.該酰胺酶可催化200 mmol/L的2-叔丁基酰胺-哌嗪，酶活達(dá)到3.0 U/mg，4 h轉(zhuǎn)化率可達(dá)到25%左右，產(chǎn)物e.e.>95%.Eichhorn和Komeda以酰胺酶制備L-2-羧酸-哌嗪的過程分別為

3.6 酰胺酶制備其他氨基酸

酰胺酶還可以用于合成其他的氨基酸，如D-苯丙氨酸和D-叔亮氨酸等.Ozaki[48]等利用來自Arthrobactersp. NJ-26的D-特異性酰胺酶催化丙氨酸酰胺制備D-丙氨酸.通過全細(xì)胞反應(yīng)，210 g/L(2.4 mol/L)的底物可產(chǎn)生105 g/L的D-丙氨酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.2%，e.e.>99%.Brand?o等[36]從外消旋叔亮氨酸腈出發(fā)，利用腈水合酶和D-氨基酸酰胺酶一鍋法制備D-叔亮氨酸，由于底物抑制的存在，采取流加方式，D-叔亮氨酸質(zhì)量濃度最高達(dá)到5 mg/mL.Egorova等[18]首次從嗜熱放線菌Pseudonocardiathermophila中篩選到L-特異性酰胺酶，其制備2-苯基-丙氨酸可達(dá)到50%的轉(zhuǎn)化率，e.e.>95%.Yamaguchi等[13]利用ACL消旋酶和L-特異性消旋酶分別制備了D-丙氨酸、D-2-氨基丁酸、D-色氨酸、D-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-色氨酸和L-甲硫氨酸，除D-色氨酸收率為94%外，其余氨基酸的收率均達(dá)到100%，產(chǎn)物e.e.值均大于99%，顯示出良好的工業(yè)化應(yīng)用前景.

4 結(jié) 論

過去幾十年，酰胺酶已成功應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)丙烯酸和異羥肟酸等化合物.隨著眾多酰胺酶的發(fā)現(xiàn)和酶改造技術(shù)的發(fā)展，逐漸克服了酰胺酶的一些缺點，如較低的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，對底物和產(chǎn)物的低耐受性等，酰胺酶顯示出巨大的應(yīng)用潛力.當(dāng)然，酰胺酶目前存在一些問題，如酰胺酶拆分氨基酸最高只能達(dá)到50%的收率，若要應(yīng)用于實際生產(chǎn)，需將另一半未水解的構(gòu)型去消旋化.在沒有氨基酸酰胺消旋酶的情況時，化學(xué)消旋是可行的方法，但是化學(xué)消旋法一般反應(yīng)條件劇烈，在消旋過程中底物易分解[49].在發(fā)現(xiàn)氨基酸酰胺消旋酶后，成功實現(xiàn)了氨基酸酰胺的動態(tài)動力學(xué)拆分，但是由于氨基酸消旋酶和氨基酸酰胺酶有著不同的酶學(xué)性質(zhì)，使得動態(tài)動力學(xué)拆分與動力學(xué)拆分相比，不得不降低反應(yīng)體系的底物濃度.在今后的發(fā)展中，還需篩選高活性的野生型菌株并采用基因工程技術(shù)提升酰胺酶以及酰胺消旋酶的催化效率，本實驗室Zheng[50]等建立了一種新的立體選擇性酰胺的篩選模型，可快速鑒定酰胺酶的選擇性和活力，提高篩選效率.由于某些化合物特別是手性化合物很難通過化學(xué)法進行大規(guī)模生產(chǎn)，而生物酶法又已經(jīng)成功應(yīng)用于這些手性化合物的生產(chǎn)，故酰胺酶法制備手性氨基酸有足夠的發(fā)展空間.

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

Research progress of enzymatic synthesis of chiral amino acids by amidase

GU Chengwei, CAO Chenghao, JIN Liqun, XUE Yaping

(College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Chiral amino acids have been widely used in pharmaceuticals, pesticides, food and cosmetics industry. It is necessary to develop new, efficient and environmental friendly methods for the synthesis of chiral amino acids. Amidase possesses a broad substrate spectrum and high enantioselectivity for the preparation of optically pure amino acids under mild conditions. Here, the origin, classification, mechanism and application of amidase in the preparation of chiral amino acids are reviewed. The synthesis of D-phenylalanine, L-tryptophan, L-phenylglycine,O-methyl-D-serine and L-piperazine-2-carboxylic acid was described. The existing problems and future development of amidase are also discussed. In the near future, an increasing number of novel amidases will be screened and their potential in the production of chiral amino acids will be further exploited.

amidase; chiral amino acids; enzymatic resolution; biocatalysis

2017-04-20

國家自然科學(xué)基金資助項目(21602199)

顧誠偉(1991—)，男，浙江嘉興人，碩士研究生，研究方向為生物轉(zhuǎn)化與生物催化，E-mail:gcw0502@qq.com.通信作者：薛亞平教授，E-mail:xyp@zjut.edu.cn.

Q556+.4

A

1674-2214(2017)03-0162-08