響應(yīng)面法優(yōu)化薏米中β-谷甾醇的提取工藝

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(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001)

響應(yīng)面法優(yōu)化薏米中β-谷甾醇的提取工藝

張冬陽,郭雪松*

(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001)

目的:采用超聲波輔助提取薏米中的β-谷甾醇,為其在功能性食品等加工利用方面提供參考。方法:以薏米為原料,磨碎成粉,以乙醇為提取溶劑,以液料比、超聲溫度、超聲時間、乙醇濃度為單因素,以β-谷甾醇提取得率為指標(biāo),運用響應(yīng)面法研究各因素及其交互作用對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響。結(jié)果:超聲輔助法提取薏米中的β-谷甾醇最佳提取條件:液料比17.5∶1 mL/g、超聲溫度52 ℃、超聲時間38 min。在此條件下,以95%乙醇為提取溶劑,β-谷甾醇平均提取得率為8.93 mg/g,接近模型中的預(yù)測值8.97 mg/g。結(jié)論:該方法操作簡便,得率較高,具有實際意義。

薏米,β-谷甾醇,超聲輔助提取,響應(yīng)面法

薏米(CoixchinensisTod)又稱薏苡仁、薏仁米、藥玉米等,是常見的一種谷物[1]。其營養(yǎng)價值和藥用價值很高,不僅含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物以及各種微量元素,還含有β、γ型兩種谷甾醇。β-谷甾醇(β-sitosterol)是植物甾醇類成分之一,屬于四環(huán)三帖類化合物,具有很好的生理活性和安全性,不僅可以降低飲食中膽固醇的吸收,而且還可以降低人體血漿中總膽固醇和低密度脂蛋白(LDL)的含量[2]。谷甾醇以結(jié)晶醇狀態(tài)存在于植物的不皂化物質(zhì)中,也是植物油脂中的一種主要不皂化物。最常見的植物甾醇包括谷甾醇、谷甾烷醇、菜油甾醇和豆甾醇等[3]。β-谷甾醇對人體具有較強的抗炎作用,能夠抑制人體對膽固醇的吸收、合成等;用于預(yù)防治療冠狀動脈粥樣硬化類的心臟病;是重要的甾體藥物和維生素D3的生產(chǎn)原料[3]。

烏汗其木格[4]以裸燕麥麩皮為原料,采用溶劑結(jié)晶法從其非皂化物中提取β-谷甾醇,測得粗提物中β-谷甾醇含量為2.02%。陳如壽[5]運用超聲波法提取毛竹筍頭中的β-谷甾醇,此方法提取率高于溶劑法以及超臨界流體萃取法,并且耗費低,測得β-谷甾醇提取含量為0.249%。目前對薏米的研究報道多集中于對薏米的蛋白質(zhì)、淀粉、多糖等的提取[6-7],有關(guān)薏米中谷甾醇提取及含量的測定,尚未見相關(guān)報道。對于β-谷甾醇的提取,大多是從燕麥、蕎麥、竹筍、油脂等原料中提取[8-11],但是提取率相對較低。據(jù)文獻(xiàn)[6]得知,薏米中每100 g總甾醇含有38.42 mgβ-谷甾醇,其含量位于前列,僅次于蕎麥、燕麥中谷甾醇的含量。所以本實驗通過響應(yīng)面法優(yōu)化薏米中β-谷甾醇的超聲提取條件,并通過高效液相色譜法測定其含量,為其在食品、飼料等研究領(lǐng)域提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

薏米 自錦州市新瑪特超市,粉碎過60目篩;β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司;甲醇、乙腈 色譜純,鄭州鑫瑞化驗設(shè)備科技銷售公司;水 超純水;乙醇等其他試劑 均為分析純,天津貝斯醫(yī)藥科技有限公司。

高速萬能粉碎機(jī) 津市泰斯特儀器有限公司;LC-15C型高效液相色譜儀 島津企業(yè)管理(中國)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;電熱恒溫水浴鍋 天津市秦斯特儀器有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;KQ3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1β-谷甾醇提取工藝流程 薏米粉碎→70 ℃烘干→稱取2 g粉末→加40 mL 95%乙醇→超聲提取2 h→過濾提取液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑→粗提物[12-14]。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 液料比對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 稱取5份薏米粉末各2 g,在超聲時間為30 min,超聲溫度為45 ℃,乙醇濃度為95%的條件下,設(shè)定液料比分別為10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1、20∶1 mL/g,研究液料比對β-谷甾醇提取得率的影響。

1.2.2.2 超聲時間對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 稱取5份薏米粉末各2 g,在液料比為15∶1 mL/g,超聲溫度為45 ℃,乙醇濃度為95%的條件下,設(shè)定超聲時間分別為20、30、40、50、60 min,研究超聲時間對β-谷甾醇提取得率的影響。

1.2.2.3 超聲溫度對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 稱取5份薏米粉末各2 g,在液料比為15∶1 mL/g,超聲時間為30 min,乙醇濃度為95%的條件下,設(shè)定超聲溫度分別為15、30、45、60、75 ℃,研究超聲溫度對β-谷甾醇提取得率的影響。

1.2.2.4 乙醇濃度對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 稱取5份薏米粉末各2 g,在液料比為15∶1 mL/g,超聲時間為30 min,超聲溫度為45 ℃的條件下,設(shè)定乙醇濃度分別為75%、80%、85%、90%、95%,研究乙醇濃度對β-谷甾醇提取得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面實驗 結(jié)合單因素實驗結(jié)果,影響薏米中β-谷甾醇提取的顯著因素為液料比、超聲時間、超聲溫度,根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理,采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法,得出薏米中β-谷甾醇的最佳提取工藝條件,實驗因素水平見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計實驗因素與水平

1.2.4β-谷甾醇含量的測定

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱:C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-乙腈(35∶65)；波長:246 nm；柱溫:30 ℃；進(jìn)樣量:10 μL；流速:0.8 mL/min。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取20 mgβ-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品,用色譜甲醇定容至10 mL容量瓶中,配成濃度為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,超聲溶解后備用。取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液,制成濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL的溶液,依次進(jìn)入高效液相色譜儀,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y：=9097.9x+381.54,線性系數(shù)為0.9992,線性關(guān)系良好。

1.2.4.3 樣品中β-谷甾醇含量的測定 粗提物用色譜甲醇溶解,定容至10 mL容量瓶,0.45 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。

β-谷甾醇提取得率(mg/g)=[β-谷甾醇濃度(mg/mL)×體積(mL)]/原料質(zhì)量(g)

式(1)

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 實驗平行數(shù)3次,結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示,單因素實驗采用SPSS 13.0軟件和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。響應(yīng)面實驗采用Design Expert 8.0.6進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1 液料比對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 圖1表明,隨著液料比逐漸增大,β-谷甾醇提取得率呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢。在液料比為15∶1 mL/g時,β-谷甾醇提取得率最大。由于溶劑達(dá)到一定量時,即使增大溶劑量對提取得率影響也不大[15-16],因此為了節(jié)約溶劑,本實驗選擇液料比為15∶1 mL/g。

圖1 液料比對薏米中β-谷甾醇提取率的影響

2.1.2 超聲時間對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 圖2表明,隨著超聲時間的增加,β-谷甾醇提取得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,超聲時間為30 min時,提取得率最高。當(dāng)時間超過30 min時,提取得率逐漸下降,可能是由于時間過長,樣品中β-谷甾醇部分被氧化分解,從而導(dǎo)致β-谷甾醇的提取得率呈現(xiàn)下降趨勢,不利于植物甾醇的提取[17-19],因此選擇超聲時間為30 min。

圖2 超聲時間對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響

2.1.3 超聲溫度對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 圖3表明,隨著超聲溫度的升高,β-谷甾醇提取得率先增大后減小,在15～45 ℃時β-谷甾醇提取得率逐漸升高,這是因為隨著溫度的升高,β-谷甾醇溶解度增大[19-21]。在45～75 ℃,由于溫度升高,分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞,β-谷甾醇的性質(zhì)會有一些變化,發(fā)生氧化,導(dǎo)致提取得率下降[19]。因此,最適溫度為45 ℃。

圖3 超聲溫度對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響

2.1.4 乙醇濃度對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響 圖4表明,隨著乙醇濃度的增大,β-谷甾醇提取得率也隨之增大。當(dāng)乙醇濃度為95%時,β-谷甾醇提取得率有最大值。這是因為少量水的存在有助于提高植物甾醇的提取得率[22],因此選擇最佳的乙醇濃度為95%。

圖4 乙醇濃度對薏米中β-谷甾醇提取得率的影響

2.2響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.2.1 實驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選擇液料比、超聲時間、超聲溫度為考察因素,以β-谷甾醇提取得率為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化,得到的響應(yīng)面實驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 利用Design Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到β-谷甾醇提取得率分別與三因素之間二次多項回歸模型的方程為Y=7.30+1.63A+1.33B+1.44C+0.19AB+0.45AC-0.34BC-0.89A2-0.81B2-1.27C2

對模型進(jìn)行方差分析(見表3),方程中各項系數(shù)絕對值的大小直接反映各因素對響應(yīng)值的影響程度[22-23]。由表3可知,模型的p<0.0001,說明回歸方程極顯著,失擬項p=0.2119>0.05(不顯著),說明回歸方程與實際情況有較好的吻合,實驗誤差小。該回歸方程的擬合度是99.18%(R2=0.9918),說明實際值與預(yù)測值擬合較好,實驗方法可行。一次項A、B、C對y值的影響極顯著(p<0.0001),交互項AC、BC對y值影響顯著(p<0.05),二次項A2、B2、C2對y值影響極顯著(p<0.01)。根據(jù)F值的大小,得出這三個因素對β-谷甾醇提取得率的影響為:A>C>B。

表3 方差分析結(jié)果

注:**為極顯著,p≤0.01;*為顯著,p≤0.05;不標(biāo)記為不顯著,p>0.05。

2.2.3 交互作用 圖5表示液料比和提取時間交互作用對β-谷甾醇提取得率的影響,響應(yīng)曲面坡度比較平滑,說明其交互作用較小[23-24]。隨著兩因素的變化,提取率平緩上升,交互作用較弱,這與方差分析結(jié)果一致。從響應(yīng)曲面圖中可以看出液料比在15.5∶1～17.5∶1 mL/g之間,提取時間在30～40 min之間,β-谷甾醇提取得率存在最高值。

圖5 提取時間與料液比交互作用圖

圖6表示提取溫度和液料比交互作用對β-谷甾醇提取得率的影響,由響應(yīng)面曲線圖可知,曲面較為陡峭,說明兩因素交互作用較顯著[25-26]。隨著提取溫度及液料比的增大,提取率先增大后趨于穩(wěn)定,上升的幅度較小。當(dāng)超聲溫度在48～54 ℃,液料比在16.5∶1～17.5∶1 mL/g時,β-谷甾醇提取得率存在最高值。

圖6 提取溫度與液料比交互作用圖

圖7表示提取溫度和提取時間交互作用對β-谷甾醇提取得率的影響,根據(jù)響應(yīng)面圖彎曲程度可知,曲面較為陡峭,說明兩因素交互作用顯著。隨著兩因素的增加,提取得率先增大后下降。當(dāng)提取溫度在48～54 ℃,提取時間在30～40 min之間,β-谷甾醇提取得率達(dá)到最大值。

圖7 提取溫度與提取時間交互作用圖

2.2.4 驗證實驗 應(yīng)用Box-Behnken軟件得到的最佳工藝:即液料比17.52∶1 mL/g,超聲溫度51.63 ℃,超聲時間38.24 min,由于工藝的需要，將液料比的結(jié)果保留一位小數(shù)，其他條件取整，修正為：液料比17.5∶1 mL/g,超聲溫度52 ℃,超聲時間38 min,此條件下得到β-谷甾醇提取得率的模型預(yù)測值為8.97 mg/g。為驗證模型預(yù)測值的可靠性,在此條件下進(jìn)行3次平行實驗,得到β-谷甾醇提取得率平均值為(8.93±0.03) mg/g,與預(yù)測值8.97 mg/g比較接近,說明該模型回歸方程具有可靠性,可以應(yīng)用于β-谷甾醇提取得率的工藝研究。

3 結(jié)論

通過單因素實驗分析,選擇對薏米中β-谷甾醇提取得率影響較大的三個因素,并應(yīng)用Design-Expert.V 8.0.6軟件中的Box-Behnken設(shè)計方法,得出β-谷甾醇提取的最佳工藝條件:液料比17.5∶1 mL/g,超聲溫度52 ℃,超聲時間38 min,此條件下,以95%乙醇為提取溶劑,得到β-谷甾醇的提取得率為8.93 mg/g,與預(yù)測值8.97 mg/g基本吻合,說明該方法得到的薏米中β-谷甾醇的提取條件真實可靠,并且提取得率較高。因此本條件可以成為β-谷甾醇提取的可靠的方法。

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Optimizationofextractiontechnologyofβ-sitosterolfromcoixseedbyresponsesurfacemethodology

ZHANGDong-yang,GUOXue-song*

(School of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China)

Objective:Extraction ofβ-sitosterol from coix seed by ultrasound,and use to provide a reference for processing and utilization of functional food. Methods:In this experiment,coix seed was used as raw material and ground into powder,and the ratio of material to liquid,ultrasonic temperature,ultrasonic time and ethanol concentration were taken as single factor. The response surface method was used to study on the effects of different factors and their interactions onβ-sitosterol extraction rate in coix seed. Results:The optimal extraction conditions ofβ-sitosterol in coix seed were as follows:liquid ratio(methanol:coix seed)was 17.5∶1 mL/g,ultrasonic temperature was 52 ℃,ultrasonic time was 38 min. Under these conditions,theβ-sitosterol average extraction rate was 8.93 mg/g close to the predicted value 8.97 mg/g in the model. Conclusion:The method had the advantages of simple operation,high yield and practical significance.

coix seed;β-sitosterol;ultrasonic assisted extraction;response surface method

2017-04-25

張冬陽(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程，E-mail：zdy201520027@163.com。

*

郭雪松(1970-)，男，碩士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品精深加工及綜合利用，E-mail：356365279@qq.com。

TS201.2

B

1002-0306(2017)22-0206-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.040