植物乳桿菌L-YL發(fā)酵藏紅花蘆筍復(fù)合飲品的研制

劉 義,姚 朗,胡錦蓉,李平蘭*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,教育部-北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

植物乳桿菌L-YL發(fā)酵藏紅花蘆筍復(fù)合飲品的研制

劉 義,姚 朗,胡錦蓉,李平蘭*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,教育部-北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

以含多種活性成分的藏紅花、蘆筍為主要原料,采用植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)L-YL進(jìn)行發(fā)酵,研制了一款益生乳酸菌發(fā)酵的藏紅花、蘆筍活菌型復(fù)合飲品。通過(guò)單因素試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵復(fù)合飲品配方進(jìn)行優(yōu)化并驗(yàn)證,得出最佳配方為:藏紅花、蘆筍粉含量2.50%,酵母粉20.8 g/L,葡萄糖10.0 g/L,乙酸鈉1.5 g/L;同時(shí)測(cè)得復(fù)合飲品中植物乳桿菌L-YL活菌數(shù)可達(dá)7.50×108CFU/mL,多糖含量23.36 mg/mL,總黃酮含量為0.24 mg/mL,研制出了一款具有開(kāi)發(fā)潛力的益生菌發(fā)酵復(fù)合飲品。

植物乳桿菌;蘆筍;藏紅花;復(fù)合飲品

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)屬于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,多數(shù)從植物中分離得到,故命名為植物乳桿菌[1]。該菌是人體胃腸道中常見(jiàn)的益生菌之一,代謝可產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素、過(guò)氧化氫等多種活性物質(zhì),可維持腸道穩(wěn)態(tài),促進(jìn)腸道蠕動(dòng),降低膽固醇,減少心血管疾病,緩解乳糖不耐癥并抑制腫瘤細(xì)胞的形成[2-3]。植物乳桿菌是適應(yīng)力極強(qiáng)的微生物,常存在于發(fā)酵的水果和果汁中,并可應(yīng)用于包括乳、肉、及植物在內(nèi)的發(fā)酵制品中[4]。目前,植物乳桿菌還多用于飲料、益生活菌制劑、膠囊等生產(chǎn),大量臨床試驗(yàn)證明其安全性,同時(shí)因其可存活定植于人體胃腸道,從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、拮抗致病菌、增強(qiáng)機(jī)體健康等優(yōu)勢(shì),受到越來(lái)越多的關(guān)注[5-6]。在食品發(fā)酵過(guò)程中,植物乳桿菌可利用食品原料中的糖類(lèi),代謝產(chǎn)生乳酸,同時(shí)產(chǎn)生胞外多糖、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、抗菌肽等代謝產(chǎn)物[7]。GABA作為一種天然存在的活性物質(zhì),有調(diào)節(jié)血壓、抑制動(dòng)脈硬化、改善肝臟和腎臟功能等作用[8-9]。植物乳桿菌的乳酸發(fā)酵在改善食品風(fēng)味的同時(shí),也改善了產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,同時(shí),由于其代謝產(chǎn)生的抗菌物質(zhì),可抑制雜菌從而延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期[10]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),藏紅花具有治療心血管疾病及預(yù)防動(dòng)脈粥樣化、治療慢性病毒性肝炎及肝硬化的作用,并具抗癌活性、抗氧化能力,可改善乙醇誘發(fā)的學(xué)習(xí)及記憶障礙和提高機(jī)體免疫功能等[11-13]。藏紅花中藏紅花多糖及西紅花苷類(lèi)物質(zhì)是主要的活性成分。蘆筍營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高,被譽(yù)為“蔬菜中的人參”,其富含蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì),以及各種生物活性物質(zhì),包括黃酮類(lèi)化合物、蘆筍多糖、甾體皂甙等,具有降血脂、抗腫瘤的作用[14-15]。

本研究以課題組分離并保存的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)L-YL為發(fā)酵劑制備發(fā)酵藏紅花蘆筍復(fù)合飲品,通過(guò)單因素、最陡爬坡及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)復(fù)合飲品進(jìn)行優(yōu)化,測(cè)定總黃酮、多糖含量并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。本研究采用益生菌發(fā)酵藏紅花蘆筍復(fù)合飲品,飲品能夠包括藏紅花、蘆筍及植物乳桿菌三者的營(yíng)養(yǎng)及保健功能,豐富益生菌飲品的種類(lèi),對(duì)益生乳酸菌活菌產(chǎn)品的研制與開(kāi)發(fā)有著一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)L-YL:由本課題組分離保存。

藏紅花粉、蘆筍粉:由山西雙錦生物科技有限公司提供。葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉:西隴化工股份有限公司。

MRS培養(yǎng)基:北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海美譜達(dá)儀器有限公司;YXQ-LS-SⅡ全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;DNP-9102恒溫培養(yǎng)箱:上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司;3K15臺(tái)式高速離心機(jī):五洲東方科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

在無(wú)菌條件下將備用的植物乳桿菌L-YL接種到MRS培養(yǎng)基中,放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在37℃條件下培養(yǎng)12～15 h,活化2～3代后使用。

1.3.2 發(fā)酵液的配置及接種流程

配制待發(fā)酵溶液→調(diào)節(jié)pH至6.9～7.1→離心(常溫、8 000 r/min、10 min)→滅菌(115℃、15 min)→無(wú)菌條件測(cè)pH并調(diào)節(jié)至6.3～6.5→接種植物乳桿菌L-YL(接種量1%)→置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37℃、24 h)→測(cè)發(fā)酵液的OD600nm或活菌數(shù)(CFU/mL)。

1.3.3 藏紅花蘆筍復(fù)合飲品種子培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將活化三代以上的植物乳桿菌L-YL接種于藏紅花、蘆筍復(fù)合液中,37℃發(fā)酵24 h,測(cè)定菌株L-YL的活菌數(shù),并以活菌數(shù)為響應(yīng)值,首先進(jìn)行藏紅花、蘆筍粉原料適應(yīng)性評(píng)價(jià),進(jìn)一步采用單因素及最陡爬坡試驗(yàn)確定關(guān)鍵因素的水平范圍,以復(fù)合飲品OD600nm值(Y)為響應(yīng)值,用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì),并進(jìn)行結(jié)果分析,得到二次線性回歸方程,預(yù)測(cè)最優(yōu)配方并驗(yàn)證。

1.3.4 復(fù)合飲品的指標(biāo)檢測(cè)

植物乳桿菌L-YL活菌數(shù)量檢測(cè)采用傾注法平板計(jì)數(shù);pH值:用pH計(jì)直接測(cè)量;多糖含量:采用苯酚-濃硫酸法[16];總黃酮含量:采用分光光度法[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏紅花粉、蘆筍粉原料適應(yīng)性評(píng)價(jià)

將植物乳桿菌L-YL以1%的接種量,分別接種于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%、1.00%、2.50%、5.00%的蘆筍粉、藏紅花粉溶液中,37℃發(fā)酵24 h后分別測(cè)得的發(fā)酵液活菌數(shù)如表1。

表1 接種植物乳桿菌對(duì)不同質(zhì)量濃度藏紅花、蘆筍粉劑溶液活菌數(shù)的影響Table 1 Effects ofLactobacillus plantarumL-YL on viable count of saffron,asparagus solution with different concentration

蘆筍粉劑含量達(dá)5.00%時(shí),發(fā)酵液活菌數(shù)為0.86×108CFU/mL。藏紅花粉劑含量達(dá)5.00%及以上時(shí),發(fā)酵液活菌數(shù)可達(dá)2.55×108CFU/mL。由表1可知,雖然隨著藏紅花、蘆筍粉劑含量增加,植物乳桿菌活菌數(shù)增加;但含量在2.5%時(shí)兩者的活菌數(shù)均可接近或大于0.50×108CFU/mL,以滿足繼續(xù)優(yōu)化的基本要求,同時(shí)考慮到藏紅花及蘆筍粉劑的價(jià)格,得到活菌數(shù)較高、價(jià)格適宜的發(fā)酵飲品,因此后期進(jìn)行發(fā)酵時(shí)藏紅花、蘆筍粉劑的含量皆為2.50%。

2.2 單因素試驗(yàn)

采用控制變量法找出每個(gè)影響因素對(duì)發(fā)酵有最大影響的最佳質(zhì)量濃度,為接下來(lái)最陡爬坡試驗(yàn)的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。各選取一項(xiàng)對(duì)發(fā)酵液OD600nm值影響顯著(P＜0.05)且貢獻(xiàn)值最高的因素,即:酵母粉、葡萄糖和乙酸鈉,并選取這3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

圖1 酵母粉(a)、葡萄糖(b)及乙酸鈉(c)對(duì)發(fā)酵液OD600nm值影響的試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Effects of yeast powder(a),glucose(b)and sodium acetate(c)on OD600nmvalue of the fermentation liquid

由圖1數(shù)據(jù)可知,隨著酵母粉、葡萄糖及乙酸鈉添加量的增加,OD600nm值都呈先增加后下降的趨勢(shì),酵母粉添加量為20 g/L時(shí),發(fā)酵液OD600nm值最大為1.064,但當(dāng)發(fā)酵液中酵母粉添加量上升至30 g/L時(shí),OD600nm值下降;在發(fā)酵液中添加不同含量的葡萄糖時(shí),OD600nm值也有一定的變化趨勢(shì),其中葡萄糖含量為8 g/L的添加量下,發(fā)酵液OD600nm值最大為0.585,之后OD600nm值下降;將乙酸鈉單因素試驗(yàn)的含量范圍控制在0～6g/L時(shí),在1.0g/L得到OD600nm值最大為1.410,之后OD600nm值下降。通過(guò)單因素試驗(yàn)得到發(fā)酵液中酵母粉、葡萄糖及乙酸鈉的最適添加量分別為20g/L、10g/L、1.0g/L。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果,將3種影響因素復(fù)合,以水平析因中效應(yīng)值的正負(fù)確定爬坡方向,以各因素的貢獻(xiàn)值大小確定變化步長(zhǎng),設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn),從而逼近響應(yīng)面擬合方程考察緊鄰區(qū)域的最佳值域,建立可靠的響應(yīng)面擬合方程,得到優(yōu)勢(shì)配方。

根據(jù)2水平析因設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果,酵母粉、葡萄糖的對(duì)效應(yīng)值(OD600nm)產(chǎn)生正效應(yīng),因此濃度變化由遞增,乙酸鈉的對(duì)效應(yīng)值(OD600nm)產(chǎn)生負(fù)效應(yīng),因此濃度變化由遞減。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,編號(hào)3的試驗(yàn)組出現(xiàn)的最高點(diǎn),即選擇酵母粉21 g/L、葡萄糖8 g/L、乙酸鈉1.5 g/L作為旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

表2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of the steepest ascent test

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)2水平析因設(shè)計(jì)結(jié)果確定的水平,以及單因素試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)確定的中心點(diǎn)的各因素水平,設(shè)計(jì)旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)復(fù)合飲品配方進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 飲料配方優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 3 Factors and levels of response surface methodology for beverage formula optimization

根據(jù)旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)的原理,進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),共20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),其中中心點(diǎn)重復(fù)5次,結(jié)果如表4所示,方差分析如表5所示。

表4 飲料配方優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of response surface experiments for beverage formula optimization

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model of response surface experiments

以酵母粉質(zhì)量濃度(A)、葡萄糖質(zhì)量濃度(B)、乙酸鈉質(zhì)量濃度(C)為響應(yīng)因素,植物乳桿菌L-YL活菌數(shù)OD600nm值為響應(yīng)值,利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表4結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到二次多項(xiàng)回歸方程:

表5結(jié)果說(shuō)明,所選模型P=0.000 2＜0.01,表明模型回歸極顯著,即模型的不同處理間差異顯著,說(shuō)明用回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí),其應(yīng)變量與全體自變量之間的線性關(guān)系顯著,很好地反映了發(fā)酵液中植物乳桿菌L-YL的菌體密度OD600nm值與酵母粉質(zhì)量濃度、葡萄糖質(zhì)量濃度、乙酸鈉質(zhì)量濃度的關(guān)系,該試驗(yàn)方法可靠。失擬值P=0.167 6＞0.05,即失擬檢驗(yàn)結(jié)果不顯著,未知因素對(duì)試驗(yàn)的干擾小,試驗(yàn)誤差小。R2=0.918 8,方程擬合度較好。同時(shí)方程一次項(xiàng)中B(葡萄糖)對(duì)OD600nm的影響為極顯著(P＜0.01),根據(jù)F值可知,3個(gè)因素對(duì)OD600nm變化影響的大小順序?yàn)锽＞C＞A,即葡萄糖＞乙酸鈉＞酵母粉。

2.5 CCD試驗(yàn)結(jié)果分析及飲品配方優(yōu)化及驗(yàn)證

圖2為兩兩因素交互作用的等高線圖和響應(yīng)曲面圖,結(jié)合兩種圖形與表5方差分析,可判斷出各因素之間的交互作用。由圖2可知,三個(gè)等高線圖的等高線均為橢圓形,且響應(yīng)面圖開(kāi)口向下,說(shuō)明響應(yīng)值(OD600nm)在其范圍內(nèi)存在最大值;但由方差分析中,模型P＜0.01及交互項(xiàng)AB、AC、BC的P＞0.05可知,在模型顯著的情況下,兩兩作用(酵母粉與葡萄糖、乙酸鈉與葡萄糖、乙酸鈉與酵母粉)皆不顯著。根據(jù)回歸模型及藏紅花粉、蘆筍粉原料適應(yīng)性評(píng)價(jià)結(jié)果,預(yù)測(cè)植物乳桿菌L-YL發(fā)酵藏紅花蘆筍復(fù)合飲品的最佳配方為藏紅花、蘆筍粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%、酵母粉20.84 g/L、葡萄糖9.95 g/L、乙酸鈉1.49 g/L,藏紅花蘆筍復(fù)合飲品OD600nm值為1.463?？紤]到實(shí)際情況的可操作性,將復(fù)合飲品的發(fā)酵條件改為藏紅花、蘆筍粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%、酵母粉20.8 g/L、葡萄糖10.0 g/L、乙酸鈉1.5 g/L時(shí)。按照此預(yù)測(cè)配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),得到藏紅花蘆筍復(fù)合飲品OD600nm值達(dá)1.432,活菌值達(dá)7.50×108CFU/mL,所得結(jié)果與預(yù)測(cè)模型值基本符合。

圖2 酵母粉、葡萄糖、乙酸鈉質(zhì)量濃度交互作用對(duì)OD600nm值影響的響應(yīng)面和等高線Fig.2 Response surfaces plots and contour line of effects of interaction between yeast powder,glucose and sodium acetate concentration on OD600nmvalue

2.6 對(duì)優(yōu)化后的發(fā)酵復(fù)合飲品的評(píng)價(jià)

優(yōu)化后發(fā)酵復(fù)合飲品的各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果如表6所示。

表6 發(fā)酵前后復(fù)合飲品的指標(biāo)Table 6 Indexes of compound beverage before and after fermentation

根據(jù)發(fā)酵前后復(fù)合飲品的各項(xiàng)指標(biāo)變化,可以看出因發(fā)酵過(guò)程中植物乳桿菌產(chǎn)酸,發(fā)酵后酸度增加;發(fā)酵終點(diǎn)活菌數(shù)可達(dá)108CFU/mL以上,符合活菌飲料的活菌數(shù)要求。同時(shí)藏紅花、蘆筍中含有一定的多糖及黃酮,經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后兩者皆有增加,最終含量分別為23.63 mg/mL、0.24 mg/mL。

2.7 討論

含有益生菌乳酸菌的制品中益生菌濃度只有在大于106CFU/mL時(shí)才能發(fā)揮其益生功效[18]。XIAO Y等[19]以植物乳桿菌B1-6發(fā)酵大豆乳清,24 h后活菌數(shù)最高可達(dá)2.5×108CFU/mL;EMAMIFAR A等[20]發(fā)酵橙汁的研究中,植物乳桿菌A7活菌數(shù)為3.16×108CFU/mL;本研究通過(guò)優(yōu)化最終得到的植物乳桿菌L-YL發(fā)酵藏紅花蘆筍復(fù)合飲品活菌數(shù)為7.50×108CFU/mL,相較其他植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)品活菌數(shù)較高,具有開(kāi)發(fā)潛力。

藏紅花蘆筍混合液經(jīng)植物乳桿菌L-YL發(fā)酵后,發(fā)酵液中的活性物質(zhì),如總黃酮和多糖含量都有增加。其中,發(fā)酵前后總黃酮含量由0.16 mg/mL增加至0.24 mg/mL,總黃酮增長(zhǎng)49.6%;KIM D S等[21]對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵葛根的研究中也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后樣品總黃酮含量發(fā)生變化,增長(zhǎng)24.3%。同時(shí)發(fā)酵前后復(fù)合飲品的多糖含量也略有增加,由19.93mg/mL增加至23.63 mg/mL;王路等[22]利用嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌研制玫瑰花發(fā)酵飲品,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的多糖濃度略大于發(fā)酵前,分析可能是隨著乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸使體系酸度增加,而酸度的增加有利于藏紅花及蘆筍多糖的溶出。

3 結(jié)論

本研究主要通過(guò)響應(yīng)面等試驗(yàn)對(duì)植物乳桿菌L-YL發(fā)酵復(fù)合飲品配方進(jìn)行優(yōu)化,得到配方為藏紅花、蘆筍粉含量2.5%,酵母粉20.8 g/L,葡萄糖10.0 g/L,乙酸鈉1.5 g/L,使發(fā)酵藏紅花蘆筍復(fù)合飲品中活菌數(shù)達(dá)7.50×108CFU/mL,并提高多糖、黃酮兩種活性物質(zhì)的含量至23.63 mg/mL、0.24 mg/mL。該復(fù)合飲品以蘆筍、藏紅花粉劑的溶液為載體,不僅充分利用了植物乳桿菌的益生功效,并將其與蘆筍的降血脂、降低腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的作用有機(jī)結(jié)合,利用植物乳桿菌發(fā)酵一定程度上提高了飲品中總黃酮及多糖的含量,對(duì)后期進(jìn)一步開(kāi)發(fā)發(fā)酵藏紅花蘆筍復(fù)合飲品提供一定的參考。

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LIU Yi,YAO Lang,HU Jinrong,LI Pinglan*
(Key Laboratory of Functional Dairy,Co-constructed by Ministry of Education and Beijing City,College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Q939.99

0254-5071(2017)11-0165-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.036

2017-06-29

橫向合作項(xiàng)目(29016652)

劉 義(1993-),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>

*通訊作者:李平蘭(1964-),女,教授,博士,研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>