超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速測定白酒中5種天然甜味物質(zhì)

趙振宇,劉 松,江 鋒,汪地強*

(貴州茅臺酒股份有限公司,貴州 仁懷 564501)

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速測定白酒中5種天然甜味物質(zhì)

趙振宇,劉 松,江 鋒,汪地強*

(貴州茅臺酒股份有限公司,貴州 仁懷 564501)

建立利用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q/Orbitrap MS)快速測定白酒中葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖等5種天然甜味物質(zhì)的分析方法。樣品經(jīng)蒸餾水稀釋一定倍數(shù)后,過0.22 μm微孔濾膜,直接進樣分析檢測。以Polaris NH2色譜柱為分析柱,乙腈-5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液為流動相進行梯度洗脫分離,在電噴霧電離源負離子模式下進行檢測。結(jié)果表明,5種天然甜味物質(zhì)在0.2～100.0 mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)R＞0.996),基質(zhì)加標(biāo)回收率范圍為86.9%～105.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.5%～10.8%,檢出限為0.05～0.12 mg/L。該方法前處理簡單,測定快速、準(zhǔn)確、靈敏度高,非常適合白酒中這5種天然甜味物質(zhì)的快速篩查和定量分析。

白酒;超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜;天然甜味物質(zhì);快速測定

白酒大曲、酒醅在發(fā)酵過程中,原料淀粉被微生物分解為葡萄糖等糖類[1-2],在蒸餾過程中,部分糖類可能因共沸等原因帶入白酒中成為重要的風(fēng)味物質(zhì),周雅璇等[3-4]發(fā)現(xiàn)白酒中有微量的葡萄糖,但未見有關(guān)其他糖類的研究報道。白酒中糖類物質(zhì)能夠增強白酒的柔和度、掩蓋白酒中的不愉悅味道,但部分不良白酒生產(chǎn)企業(yè)利用糖類物質(zhì)在白酒中的作用,達到以次充好的目的,在白酒中違規(guī)添加甜味物質(zhì)[5]。

白酒中甜味物質(zhì)的研究主要集中在人工合成甜味劑上[6-8],近些年國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的酒類監(jiān)督抽檢不合格產(chǎn)品信息中,違規(guī)使用人工甜味劑是最常見不合格項之一,但是對甜度較低的糖類物質(zhì)的監(jiān)管處于空白,且目前白酒中有關(guān)單、雙糖的研究在國內(nèi)未見報道。本研究在高效液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用法測定單、雙糖的基礎(chǔ)上[9-14],采用高分辨質(zhì)譜,以期建立一種能同時、快速、準(zhǔn)確測定白酒中痕量葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

白酒:市售;乙腈(色譜級):美國化學(xué)學(xué)會;乙酸銨(色譜級)、葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖(標(biāo)準(zhǔn)品):美國Sigma公司;所有實驗用水都為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-quadrupole/elec-trostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry,UPLC-Q/OrbitrapMS)聯(lián)用儀:美國ThermoFisherScientific公司;默克Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng):美國MilliporeMilli-Q公司;N-EVAP-24氮吹儀:美國OA-SYS公司;AllegraX-22系列多功能臺式高速離心機:美國貝克曼公司;ME104E分析天平:梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

移取0.1mL酒樣至5.0mL離心管中,加水定容至2.0mL,漩渦振蕩5 min后,在4℃、10 000 r/min條件下離心5 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜后進樣分析。

1.3.2 色譜條件

進樣體積5.0μL;色譜柱:PolarisNH2(2.1mm×150mm,3.5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:乙腈-5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液;流速0.3 mL/min;線性梯度洗脫,洗脫程序見表1,整個分析流程17 min。

表1 線性洗脫程序Table 1 Linear elution program

1.3.3 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件:離子源采用加熱電噴霧電離源(electrospray ionization,ESI);吹掃氣:45 arb;鞘氣:15 arb;反吹氣:0 arb;電離電壓:-3.0 kV;離子傳輸管溫度:350℃;離子源溫度:240℃;負離子模式監(jiān)測,采用full MS-TargetMS2掃描方式測定,掃描范圍50～370m/z,fullMS掃描的分辨率為70000,Target MS2掃描模式分辨率為17 500。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖分別準(zhǔn)確稱取0.1000g至100.0 mL容量瓶中,用超純水定容至100.0 mL,得到質(zhì)量濃度為1.0g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,分別精密量取上述5種標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量,置10.0 mL容量瓶中,加水定容,配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

5種天然甜味物質(zhì)中,葡萄糖與果糖,蔗糖、麥芽糖與乳糖分別是同分異構(gòu)的單糖和雙糖,分子質(zhì)量完全一樣,結(jié)構(gòu)相似,它們的二級特征碎片也有極高的相似度,因此用質(zhì)譜分別檢測5種天然甜味物質(zhì)含量的前提是實現(xiàn)其在液相部分的完全分離[15]。實驗中考察了乙腈-乙酸銨溶液體系和甲醇-乙酸銨溶液體系的流動相,發(fā)現(xiàn)在甲醇-乙酸銨溶液體系中,5種化合物不能完全分離,而乙腈-乙酸銨溶液體系能較好的將5種化合物洗脫分離。同時發(fā)現(xiàn)為乙腈起始濃度低于75%時,果糖與葡萄糖無法分離,當(dāng)乙腈起始濃度高于85%時,5種化合物的分離時間延長,且蔗糖、麥芽糖、乳糖的響應(yīng)較差。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

利用流動注射的方式對5種化合物進樣分析,優(yōu)化離子源電壓、溫度、鞘氣、輔助氣、吹掃氣、脫溶劑溫度等參數(shù),得到5種化合物的母離子均為分子離子峰[M-H]-,5種化合物的總離子流色譜圖見圖1,各物質(zhì)的特征離子、碰撞能量見表2。

圖1 5種天然甜味物質(zhì)質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of 5 natural sweeteners

表2 5種天然甜味物質(zhì)離子對及碰撞能量Table 2 Ion pairs and collision energy of 5 natural sweeteners

2.3 樣品前處理

考慮到乙醇對5種化合物檢測結(jié)果的影響,采取3種樣品前處理方式進行比較。用水將樣品稀釋到酒精度10%vol后過0.22μm濾膜后進樣分析;酒樣加熱氮吹除醇后0.22μm濾膜后進樣分析;酒樣稀釋至酒精度＜5%vol后過0.22 μm濾膜后進樣分析。3種方法對比發(fā)現(xiàn),乙醇對5種天然甜味物質(zhì)的回收率及其峰型有嚴重的影響。向仲朝[15]也得出過同樣的結(jié)論,在酒精度10%vol時,樣品的回收率較差,低濃度加標(biāo)樣品回收率＜72.1%,高濃度加標(biāo)樣品回收率＞140.5%,而在酒精度＜5%vol時,檢測結(jié)果較為滿意。采用加熱氮吹除醇處理的方法的穩(wěn)定性較差,在10.0 mg/L加標(biāo)水平上,回收率可以達到184.1%,而在100.0 mg/L加標(biāo)水平上,回收率僅為44.1%。故最終選擇酒樣稀釋至酒精度＜5%vol的方法。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

將濃度范圍為0.2～100.0 mg/L系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,分別在Q-Exactive儀器上進行測定,以峰面積為Y軸,質(zhì)量濃度為X軸,得到線性回歸方程。對空白樣品進行加標(biāo)實驗,根據(jù)檢出限為基線噪音的10倍的方法測定方法檢出限,結(jié)果見表3。

表3 五種天然甜味物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 3 Linear equations,correlation coefficients and detection limit of 5 natural sweeteners

2.5 加標(biāo)回收率試驗

在上述實驗條件下,對樣品進行加標(biāo)回收試驗,加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為10.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L,結(jié)果見表4。

表4 五種化合物的加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 4 Recovery rates tests results of 5 natural sweeteners

由表4可知,果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的平均回收率分別為86.9%～101.2%、87.3%～90.8%、87.2%～105.4%、89.8%～100.0%、89.1%～103.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standarddeviation,RSD)分別為1.3%～10.8%、1.9%～10.3%、2.0%～5.2%、0.5%～5.3%、1.4%～4.0%,表明該方法準(zhǔn)確度較好。

2.6 市售白酒樣品的測定

選擇市售的10款白酒樣品(編號A～J,包含固態(tài)法白酒和液態(tài)法白酒),按照1.3部分的方法制備樣品待測液,在儀器上檢測,每種樣品取2份平行測試,樣品中5種天然甜味物質(zhì)的含量見表5。

表5 市售白酒中五種天然甜味物質(zhì)的含量Table 5 Contents of 5 natural sweeteners in commercialBaijiu

由表5可知,無論是固態(tài)法白酒還是液態(tài)法白酒,均有痕量的天然甜味物質(zhì)檢出,周雅璇等[3-4]同樣發(fā)現(xiàn)白酒中有葡萄糖存在,可能是釀酒原料在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了天然甜味物質(zhì),在白酒蒸餾過程中共沸帶出進入白酒中。但是表5中部分白酒中有大量的天然甜味物質(zhì)檢出,有人為添加的嫌疑,需進一步對同類酒樣進行篩查后確定。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法(UPLC-Q/Orbitrap MS)同時檢測白酒中5種痕量甜味物質(zhì)的方法。樣品經(jīng)過稀釋定容,高速冷凍離心后過濾處理,以乙腈-5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液為流動相梯度洗脫,采用Polaris NH2色譜柱分離,在負離子監(jiān)測模式下進入高分辨質(zhì)譜進行分析。結(jié)果表明,果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖在0.2～100 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,R2＞0.996,平均回收率分別為86.9%～101.2%、87.3%～90.8%、87.2%～105.4%、89.8%～100.0%、89.1%～103.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.3%～10.8%、1.9%～10.3%、2.0%～5.2%、0.5%～5.3%、1.4%～4.0%。本方法系首次運用高分辨質(zhì)譜檢測白酒中的天然甜味物質(zhì),具有專屬性強、前處理簡單、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點。

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ZHAO Zhenyu,LIU Song,JIANG Feng,WANG Diqiang*
(Kweichow Moutai Co.,Ltd.,Renhuai 564501,China)

O657.7

0254-5071(2017)11-0149-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.032

2017-08-21

貴州省重大科技專項合作項目(黔科合重大專項字(2013)6009號)

趙振宇(1984-),男,工程師,本科,主要從事食品安全研究工作。

*通訊作者:汪地強(1976-),男,工程技術(shù)應(yīng)用研究員,博士,主要從事食品安全研究工作。