紅陽獼猴桃與杭州地區(qū)部分野生獼猴桃種質的SSR分析

沈國正，劉 輝*，李白沙，張 琛，黃康康，郗篤雋，裴嘉博，張 青，裘劼人

(1.杭州市農業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310024； 2.杭州市臨安區(qū)林業(yè)技術推廣中心，浙江 杭州 311300)

紅陽獼猴桃與杭州地區(qū)部分野生獼猴桃種質的SSR分析

沈國正1，劉 輝1*，李白沙1，張 琛1，黃康康1，郗篤雋1，裴嘉博1，張 青2，裘劼人1

(1.杭州市農業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310024； 2.杭州市臨安區(qū)林業(yè)技術推廣中心，浙江 杭州 311300)

以杭州地區(qū)種植的中華獼猴桃紅陽、美味獼猴桃海沃德、徐香、金魁及11份本地野生獼猴桃為試材，對其SSR遺傳多樣性及其親緣關系進行分析和評價。結果表明，利用16對引物15份材料上均擴增出多態(tài)性片段，共計得到88條多態(tài)性條帶，檢出81個等位變異點，遺傳相似系數(GS)變異范圍為0.58～0.91。GS值在0.60水平上UPGMA聚類分析可將供試的獼猴桃種質資源劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ共4個組。這些遺傳變異豐富的種質資源可為今后利用本地獼猴桃資源開展育種研究提供理論依據。

紅陽獼猴桃； 野生獼猴桃； SSR標記； 遺傳多樣性； 杭州

獼猴桃為多年生雌雄異株落葉藤本植物，我國是獼猴桃的原產地，目前全世界66種獼猴桃屬植物中，有62種均產于我國，且絕大部分為我國特有，種質資源十分豐富。目前國內外獼猴桃品種選育主要從野生種質資源中選擇或雜交育種[1]，豐富的野生獼猴桃種質資源是獼猴桃品種選育和產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎[2-3]。20世紀70年代以來，我國已從野生獼猴桃資源中選育出55個品種和200多個優(yōu)良株系，獼猴桃產業(yè)迅速發(fā)展[4]。但異地間品種交換頻繁，且獼猴桃屬中普遍存在自發(fā)的種間雜交和種內多倍化現象，使得品種資源的混雜現象比較突出，也不利于新品種的選育。

微衛(wèi)星DNA，即簡單重復序列(SSR，simple sequence repeats)標記以其共顯性、重現性良好和多態(tài)性豐富等優(yōu)點，成為構建品種指紋的重要標記，廣泛應用于農作物和果樹的品種鑒定和種質資源分析。宋曉燕等[5]用12對SSR引物評價192份二倍體馬鈴薯栽培品種的遺傳多樣性，檢測到98個等位位點并劃分為11個組群。高源等[6]利用TP-M13-SSR標記，基于TP-M13-SSR指紋圖譜構建蘋果種質分子身份證。高天翔等[7]用11對SSR引物對中國櫻桃14個自然居群280個個體分析評價遺傳多樣性和遺傳結構。這些研究結果都證實了SSR標記分析遺傳關系的有效性。本研究利用SSR標記對杭州地區(qū)發(fā)展較快的紅心獼猴桃品種紅陽與杭州建德篩選到的優(yōu)質野生獼猴桃材料及其他主栽品種進行初步研究，擬分析它們之間親緣關系的遠近，為新品種的選育提供遺傳學基礎數據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2015年5—8月對杭州地區(qū)主要栽培品種和野生獼猴桃(主要在杭州建德)進行了普查，選取近年來栽培較多的品種中華獼猴桃栽培種紅陽，美味獼猴桃栽培種海沃德、徐香、金魁以及收集到的建德野生獼猴桃11份，共15份材料。采集供試材料的葉片(野生獼猴桃為幼嫩葉片，其余品種為成熟葉片)用冰盒保存并運回實驗室，置于-20 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

采用改良CTAB法[8]從100 mg供試材料葉片中提取基因組DNA，用微量核酸濃度儀(BioSpec-nano)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和質量，并將模板濃度調至200 ng·μL-1。DNA母液于-20 ℃冰箱保存。對Huang等[9]報道的應用于獼猴桃的微衛(wèi)星位點進行篩選，篩選出適用于供試材料的多態(tài)性好的引物16對(表1)。引物由上海生工合成。

表1 獼猴桃SSR分析的16對引物及退火溫度

PCR反應體系及條件(PCR所用試劑購自博大泰克)。反應程序如下：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性20 s，55～57 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，35個循環(huán)；72 ℃后延伸2 min。反應結束控制在4 ℃。PCR產物使用微芯片毛細管電泳儀(MCE-202 MultiNA，島津)進行片段分析。電泳試劑使用DL-500試劑盒(島津)，25 bp DNA ladder(Invitrogen，1×TE稀釋50倍)，SYBR? GOLD熒光染料(1×TE稀釋100倍)。

1.3 數據分析

根據SSR分析的結果，將每條SSR引物擴增出的每條帶視為1個位點，相同遷移率的記為1，無條帶的記為0，在Excel 2007中將片段大小統計轉化為0/1矩陣。使用NTSYS-pc 2.1軟件，通過similarity→clustering→SHAN→Graphics→tree plot，程序得到15份材料的親緣關系聚類圖。

2 結果與分析

2.1 15份獼猴桃材料的遺傳多樣性

通過引物篩選預實驗，選定了16對多態(tài)性好的引物UDK96-1、UDK96-15、UDK96-16、UDK96-20、UDK96-22、UDK96-26、UDK96-34、UDK96-37、UDK96-40、UDK97-401、UDK97-403、UDK97-407、UDK97-409、UDK97-413、UDK97-414、UDK97-415。利用這些引物對4個主栽獼猴桃品種和11份野生獼猴桃材料進行擴增，發(fā)現其在所有供試材料中均可擴增出清晰條帶；共獲得88條多態(tài)性條帶，平均每對引物擴增4.2條帶，每個位點均呈現出一定的多態(tài)性(表2)。其中，利用UDK97-407進行擴增，發(fā)現紅陽沒有條帶，其余14份材料均有條帶(圖1)。結果表明，引物擴增得到的基因片段長度在80～300 bp，PCR擴增總計得到81個等位位點，平均每對SSR引物可以檢測到5.06個等位位點。

表2 15份獼猴桃材料的SSR指紋圖譜

1～11為野生材料；12為紅陽；13為海沃德；14為徐香；15為金魁圖1 UDK97-407在15份獼猴桃樣本上的擴增結果

2.2 聚類分析

通過SSR多態(tài)性標記分析，15份獼猴桃種質資源的遺傳相似系數(GS)變異范圍為0.58～0.91，大部分野生材料與品種間的親緣關系較遠。其中，野生獼猴桃種質材料1和2的GS值最大，表明兩者親緣關系近，與其他樣本間的親緣關系較遠；11和紅陽之間親緣關系較近。

根據材料間的遺傳相似系數，采用UPGMA法對獼猴桃種質資源進行聚類分析(圖2)，利用16對SSR引物能將15份種質資源相互區(qū)分，在GS值0.60的水平上將所有的材料劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4個組。Ⅰ組包括了野生種質資源1和2，Ⅱ組包括了野生種質資源3、5、10和栽培品種海沃德，Ⅲ組包括了野生種質資源11和栽培品種紅陽、徐香和金魁，Ⅳ組包括了野生種質資源4、6、7、8和9。

圖2 15份獼猴桃樣本的聚類分析

3 討論

選擇優(yōu)良性狀的親本材料是進行獼猴桃育種工作的前提和基礎，親本材料遺傳背景狹窄則會導致難以培育出優(yōu)良性狀的品種。因此，通過選擇變異來源廣泛的親本材料，比較材料間親緣關系的遠近，對于獼猴桃新品種的選育和品種改良工作具有重要意義。利用SSR分子標記技術進行獼猴桃遺傳多樣性的研究，國內外已有許多相關報道。鄭軼琦等[10]利用9對SSR引物，對中國栽培的48個獼猴桃品種(品系)進行了遺傳多樣性研究表明，中國獼猴桃栽培品種具有較高的遺傳多樣性，SSR標記在獼猴桃品種中有較高的鑒定效率；易盼盼等[11]通過對51對SSR引物的篩選，獲得了與抗?jié)儾』蜻B鎖的SSR分子標記UDK97-428116，為獼猴桃抗病育種提供早期分子篩選標記；王丹丹等[12]利用21對引物對25份軟棗獼猴桃建立了EST-SSR反應體系，為獼猴桃屬植物的形狀定位、品種鑒定、種質創(chuàng)新、新品種培育及遺傳多樣性分析等工作奠定了基礎。眾多研究結果表明SSR標記是進行獼猴桃品種鑒定的有效工具，與其他標記相比，SSR標記在鑒定獼猴桃品種的研究中顯示更高的效率。

本研究中各獼猴桃種質資源材料之間的遺傳相似系數為0.58～0.91。魏艷霞等[13]利用RAPD標記對野生獼猴桃資源遺傳分析發(fā)現個別材料遺傳相似性系數較高，在0.14～0.85，應該加強野生資源的收集和利用研究。從聚類結果可以發(fā)現，海沃德雖然與徐香、金魁同屬美味獼猴桃，卻與其他2個品種間的親緣關系較遠；紅陽屬中華獼猴桃，與徐香、金魁卻相近，這與前人關于部分中華和美味品種間親緣關系相近的研究相符合，說明美味獼猴桃作為中華獼猴桃的變種，具有很近的親緣關系[14-16]。本研究為利用杭州地區(qū)豐富的野生獼猴桃資源開展新品種選育提供理論基礎。

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(責任編輯：張瑞麟)

2017-06-19

杭州市科技計劃項目(20140932H03)

沈國正(1968—)，男，高級農藝師，從事果樹栽培技術研究及推廣工作，E-mail：sgz@hz.cn。

劉 輝，E-mail：liuhui518lh@163.com。

文獻著錄格式：沈國正，劉 輝，李白沙，等. 紅陽獼猴桃與杭州地區(qū)部分野生獼猴桃種質的SSR分析[J].浙江農業(yè)科學，2017，58(11)：1906-1909.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171114

S663.4

A

0528-9017(2017)11-1906-04