大黃素對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎模型小鼠T細(xì)胞亞群和 IFN-γ、IL-4的影響

吳可人 葉志鵬 黃 捷 金 法 方 蓉 徐 濤 李 寧

大黃素對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎模型小鼠T細(xì)胞亞群和 IFN-γ、IL-4的影響

吳可人 葉志鵬 黃 捷 金 法 方 蓉 徐 濤 李 寧

目的 大黃素對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎模型小鼠T細(xì)胞亞群和IFN-γ、IL-4的影響。方法 通過過量碘劑誘導(dǎo)NOD小鼠建立EAT動(dòng)物模型，造模4周后各實(shí)驗(yàn)組攝入不同劑量的大黃素。造模8周后檢測(cè)小鼠血漿TgAb水平及甲狀腺炎癥程度。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血、脾臟T細(xì)胞亞群，分析大黃素對(duì)EAT小鼠外周血、脾臟淋巴細(xì)胞IFN-γ和IL-4分泌能力的影響。結(jié)果 （1）甲狀腺病理學(xué)觀察，大黃素實(shí)驗(yàn)組較模型組甲狀腺淋巴細(xì)胞浸潤程度減輕；分級(jí)比較有顯著性差異（P＜0.01）；（2）造模后模型組小鼠血漿TgAb水平較對(duì)照組明顯升高[（44.16±3.59）ng/mL比（11.24±1.52）ng/mL]，大黃素實(shí)驗(yàn)組升高幅度低于模型組[（26.58±5.24）ng/mL、（19.18±5.73）ng/mL、（23.24±5.47）ng/mL 比（44.16±3.59）ng/mL]，各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；（3）大黃素實(shí)驗(yàn)組外周血單核細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的頻率較對(duì)照組明顯升高，外周血單核細(xì)胞[（7.72±2.92）%比（4.13±1.45）%，（4.23±1.58）%比（2.76±1.69）%]；脾臟淋巴細(xì)胞[（7.51±1.31）%比（1.82±1.35）%，（5.59±1.98）%比（0.033±0.034）%]，但低于模型組外周血單核細(xì)胞[（7.72±2.92）比（17.46±3.71）%，（4.23±1.58）%比（8.92±2.62）%；脾臟淋巴細(xì)胞[（7.51±1.31）%比（16.74±4.79）%，（5.59±1.98）%比（11.97±2.21）%]（P＜0.01）；而CD3+CD4+FIN-γ+、CD3+CD4+IL-4+T細(xì)胞頻率高于對(duì)照組但明顯低于模型組（P＜0.01）。結(jié)論 過量碘劑誘導(dǎo)NOD小鼠自身免疫性甲狀腺炎造模是可行的；大黃素對(duì)造模小鼠甲狀腺炎有一定保護(hù)作用。大黃素通過抑制CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞分化并且抑制IFN-γ和IL-4的分泌，從而抑制造模小鼠的自身免疫反應(yīng)。

NOD小鼠；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎；大黃素；T細(xì)胞亞群

自身免疫性甲狀腺?。╝utoimmune thyroid diseases，AITD）是最常見的自身免疫性疾病之一，也是獲得性甲狀腺功能減退的最常見病因[1]。在人群中AITD的發(fā)病率約為1.5%，并多見于女性[2]。目前臨床上缺乏有效的治療藥物，迄今為止僅發(fā)現(xiàn)極少數(shù)物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎（experimental autoimmune thyroiditis，EAT）動(dòng)物模型有保護(hù)作用[3]，新的治療方案和有潛力的藥物有待開發(fā)。大黃素屬蒽醌類衍生物，是中藥大黃的重要單體，有一定的免疫抑制作用。本研究探討大黃素對(duì)過量碘劑誘導(dǎo)的EAT動(dòng)物模型保護(hù)作用的機(jī)制，為慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎治療提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡NOD小鼠50只，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2014-0004，購于北京康生物有限公司，體質(zhì)量18～22g，雌性。動(dòng)物室保持空氣新鮮，相對(duì)濕度60%，溫度20～24℃，每日光照12h，自由飲食，飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行。

1.2 試劑與儀器 CD3（批號(hào)B103323）、CD4（批號(hào)B103824）、CD8（批 號(hào) B103828）、IFN-γ（批 號(hào)B585729）、IL-4抗體（批號(hào) B502934）購于 Biolegend公司；小鼠抗甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（批號(hào)B20150522）購于喬羽生物有限公司；低速離心機(jī)購于Beckman公司；ELISA檢測(cè)儀購于RAYTO公司；流式細(xì)胞儀購于BD公司；顯微鏡BX51+FL購于OLYMPUS公司。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立 小鼠稱重，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、大黃素低、中、高劑量組，每組10只。對(duì)照組小鼠飲用去離子水，其他各組小鼠均飲用0.05%碘水（0.64g/L NaI）持續(xù)8周[4]。第5周起對(duì)低、中、高劑量大黃素組小鼠分別以每日大黃素15mg/kg、75mg/kg、150mg/kg灌胃，對(duì)照組和模型組小鼠分別以等量生理鹽水灌胃，共處理4周后處死小鼠，取外周血、甲狀腺、脾臟。

1.4 標(biāo)本采集 乙醚麻醉，小鼠麻醉后，眶靜脈取血，室溫靜置6h，3000R/min離心20min，分離血清。頸部正中切口，分離皮膚及肌肉層，暴露器官，顯露出甲狀腺軟骨側(cè)后方的兩葉甲狀腺。將氣管和甲狀腺一并取下，迅速剝離甲狀腺，冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干。

1.5 甲狀腺病理學(xué)檢查 小鼠甲狀腺組織4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切成4μm切片，蘇木素-伊紅（HE）染色。采用圖像分析計(jì)算炎癥細(xì)胞（子目標(biāo)面積）與甲狀腺組織（目標(biāo)面積）的比值，參考Tang N[5]的炎癥分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，0級(jí)：正常甲狀腺組織；1級(jí)：1%以下的甲狀腺有淋巴細(xì)胞浸潤；2級(jí)：1～10%淋巴細(xì)胞浸潤；3級(jí)：10～40%淋巴細(xì)胞浸潤；4級(jí)：超過40%淋巴細(xì)胞浸潤。

1.6 血漿抗小鼠甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）水平測(cè)定 采用ELISA試劑盒雙抗體夾心法測(cè)定：在各孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各100μL，37℃孵育90mim；加入100μL生物化抗體工作液，37℃孵育60min；洗滌3次；加入100μL酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30min；洗滌5次；加入90μL底物溶液，37℃孵育15min左右；加入50μL終止液，立即在450nm波長測(cè)量OD值并計(jì)算結(jié)果。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）測(cè)定外周血單核細(xì)胞（PBMC）及脾淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞亞群頻率 取模型組、對(duì)照組和中劑量大黃素組小鼠外周血及脾臟，分離PBMC及脾淋巴細(xì)胞懸液。采用、FCM檢測(cè)分析三組小鼠外周血單核細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的頻率差異。使用50ng/mL佛波酯和1μg/mL離子霉素刺激兩種細(xì)胞6h后，再利用FCM測(cè)試分析各組小鼠外周血單核細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)胞中 CD3+CD4+IFN-γ+、CD3+CD4+IL-4+T 細(xì)胞頻率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）形式表示，不同組間兩兩比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）中的最小顯著性法（LSD）法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺病理學(xué)檢測(cè) 模型組小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中死亡1只，其余各組小鼠均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。顯微鏡下可見對(duì)照組甲狀腺濾泡大小較為均勻一致，濾泡上皮細(xì)胞為單層立方形或高柱形。模型組濾泡結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞擠壓變扁，間質(zhì)減少，淋巴細(xì)胞浸潤明顯（見封二圖1）。根據(jù)炎癥分級(jí)，模型組、大黃素實(shí)驗(yàn)組小鼠高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；大黃素各實(shí)驗(yàn)組與模型組比較炎癥有所抑制（P＜0.01）。大黃素中劑量組炎癥抑制最明顯，但與其他實(shí)驗(yàn)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 各組小鼠甲狀腺組織炎癥細(xì)胞浸潤情況（HE染色 10×10；1.模型組2.對(duì)照組3.低劑量組4.中劑量組5.高劑量組）

表1 各組甲狀腺病理分級(jí)比較（只，±s）

表1 各組甲狀腺病理分級(jí)比較（只，±s）

注：五組間比較，H=38.347，P＜0.01

組別模型組低劑量組中劑量組高劑量組對(duì)照組P值鼠數(shù)9 1 0 1 0 1 0 1 0甲狀腺病理分級(jí)4.0 0（3.0 0，4.0 0）3.0 0（2.7 5，3.0 0）2.0 0（2.0 0，3.0 0）3.0 0（2.0 0，3.0 0）0（0，0）＜0.0 1

2.2 血漿抗小鼠甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）水平檢測(cè) 8周后，小鼠血漿中TgAb濃度，模型組較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01）。大黃素各實(shí)驗(yàn)組TgAb濃度低于模型組而高于對(duì)照組（P＜0.01），大黃素中劑量組血漿中TgAb濃度最低，但與其他實(shí)驗(yàn)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 2。

表2 各組血漿抗小鼠甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）比較（ng/L，±s）

表2 各組血漿抗小鼠甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）比較（ng/L，±s）

注：與模型組比較，△P＜0.01；與對(duì)照組比較，**P＜0.01

組別模型組低劑量組中劑量組高劑量組對(duì)照組統(tǒng)計(jì)量（H）P值鼠數(shù)9 10 10 10 10 TgAb 44.16±3.59 26.58±5.24△**19.18±5.73△**23.24±5.47△**11.24±1.52 19.254＜0.01

2.3 外周血單核細(xì)胞及外周血、脾臟淋巴細(xì)胞CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞頻率差異 造模后小鼠PBMC與脾淋巴細(xì)胞中CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞相對(duì)頻率均較對(duì)照組明顯增加，大黃素實(shí)驗(yàn)組增加幅度低于模型組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表3～4）。相比對(duì)照組，在PBMC細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞中，造模后CD3+CD4+INF-γ+T細(xì)胞、CD3+CD4+IL-4+T細(xì)胞相對(duì)頻率均增加，大黃素實(shí)驗(yàn)組增加幅度低于模型組（見封二～封三圖2～3）。

圖2 各組PBMC中CD3+CD4+INF-γ+T細(xì)胞和CD3+CD4+IL-4+T細(xì)胞頻率比較

圖3 各組脾淋巴細(xì)胞中CD3+CD4+INF-γ+T細(xì)胞和CD3+CD4+IL-4+T細(xì)胞頻率比較

表3 各組PBMC CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞比較（%，±s）

表3 各組PBMC CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞比較（%，±s）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.001；與模型組比較，△P＜0.01

組別模型組中劑量大黃素組對(duì)照組次數(shù)9 10 10 CD3+CD4+T 17.46±3.71**7.72±2.92△4.13±1.45 CD3+CD8+T 8.92±2.62**4.23±1.58△2.76±1.69

表4 各組脾細(xì)胞CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞比較（%，±s）

表4 各組脾細(xì)胞CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞比較（%，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.001；與模型組比較，△P＜0.001

組別模型組中劑量大黃素組對(duì)照組次數(shù)9 10 10 CD3+CD4+T 16.74±4.79**7.51±1.31*△1.82±1.35 CD3+CD8+T 11.97±2.21**5.59±1.98**△0.033±0.034

3 討論

慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎是臨床最常見的自身免疫性甲狀腺病，以甲狀腺內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤、TgAb和甲狀腺多氧化物酶抗體（TPO）的生成為主要特征，受遺傳和環(huán)境等多種因素影響[6]，其確切發(fā)病機(jī)制尚不明確。本研究通過碘劑誘導(dǎo)NOD小鼠建立EAT動(dòng)物模型，造模后小鼠甲狀腺病理切片光鏡下顯示濾泡結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞擠壓變扁，間質(zhì)減少，炎性細(xì)胞浸潤明顯；同時(shí)血漿自身抗體水平明顯升高，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)論一致[7]，表明過量碘劑誘導(dǎo)造模是成功的。

目前多項(xiàng)體外研究[8-10]表明，大黃素能通過抑制DC成熟、淋巴細(xì)胞活化、調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡等途徑起到的免疫抑制作用。在本研究中，不同劑量大黃素的攝入減輕了模型動(dòng)物甲狀腺組織炎性細(xì)胞浸潤程度，血漿TgAb升高幅度下降，證實(shí)大黃素對(duì)EAT模型動(dòng)物有一定的保護(hù)作用。

CD4+和CD8+T細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)中的兩種重要免疫細(xì)胞，CD4主要表達(dá)于輔助T（Th）細(xì)胞，是Th細(xì)胞TCR識(shí)別抗原的共受體，與MHCⅡ類分子的非多肽區(qū)結(jié)合，參與Th細(xì)胞TCR識(shí)別抗原的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；而CD8主要表達(dá)于細(xì)胞毒性T細(xì)胞上，通過表面的MHCⅠ分子與CD4等其他免疫細(xì)胞的MHCⅡ分子結(jié)合，從而識(shí)別其他免疫細(xì)胞表面結(jié)合的抗原物質(zhì)。在本研究中，造模后各組小鼠PBMC和脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8+T細(xì)胞相對(duì)頻率均較對(duì)照組明顯增加，表明兩者都參與了造模小鼠的疾病維持過程，而大黃素通過降低CD4+和CD8+T細(xì)胞相對(duì)頻率的增幅緩解了炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞因子的種類和細(xì)胞因子之間的平衡對(duì)Th細(xì)胞的分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。初始CD4+T細(xì)胞在IFN-γ等的誘導(dǎo)下分化為Th1細(xì)胞，分泌IFN-γ。一般認(rèn)為，IFN-γ可以增強(qiáng)甲狀腺上皮細(xì)胞HLA-Ⅱ類抗原的表達(dá)，觸發(fā)自身免疫的發(fā)生，激活并趨化大量的單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞進(jìn)入甲狀腺內(nèi)，增強(qiáng)細(xì)胞毒性作用，促進(jìn)自身抗體的產(chǎn)生。一些學(xué)者認(rèn)為，IFN-γ表達(dá)上調(diào)促使CLT患者Th1/Th2細(xì)胞平衡向Th1方向偏離，故而CLT患者出現(xiàn)以細(xì)胞免疫為主的自身免疫紊亂[11-13]。同樣有學(xué)者持對(duì)立觀點(diǎn)，或認(rèn)為二者作用均衡[14]。本研究中，造模小鼠外周血和脾臟淋巴細(xì)胞IFN-γ陽性T細(xì)胞頻率明顯增高，表明造模后T細(xì)胞分泌IFN-γ增加，提示Th1細(xì)胞分化上調(diào)。而PBMC和脾臟淋巴細(xì)胞IL-4陽性T細(xì)胞頻率也有所增高，表明Th2因子也有一定程度的表達(dá)上調(diào)。YU[15]認(rèn)為Th1因子在炎癥的始發(fā)和維持階段均起到重要作用，而Th2因子可能僅在炎癥的維持階段起作用；也就是說，在甲狀腺炎癥的維持階段細(xì)胞免疫和體液免疫均參與其中。大黃素干預(yù)的造模小鼠，Th1和Th2因子陽性的T細(xì)胞頻率均低于模型組，表明大黃素對(duì)炎癥維持階段的細(xì)胞免疫和體液免疫都有一定的抑制作用。

綜上所述，在過量碘誘導(dǎo)NOD小鼠EAT模型中，小鼠PBMC和脾淋巴細(xì)胞Th1、Th2細(xì)胞頻率均增加，表明兩者可能都參與了炎癥維持階段的疾病發(fā)展過程。大黃素能減輕造模后小鼠甲狀腺的炎癥。大黃素通過抑制CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞分化，抑制Th1細(xì)胞因子IFN-γ和Th2細(xì)胞因子IL-4的分泌，從而在炎癥的維持階段分別抑制造模小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。

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Effects of Emodin on T Cell Subsets and IFN-γ,IL-4 in Autoimmune Thyroiditis Mice

WU Keren,YE Zhipeng,HUANG Jie,JIN Fa,FANG Rong,XU Tao and LI Ning.
Department of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University.Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the protective effect of emodin on T cell subsets and the secretion of IFN-γ and IL-4 in autoimmune thyroiditis（EAT）mice.Methods Four weeks after modeling,experimental groups were treated with emodin with different doses.The TgAb level in plasma and thyroid inflammation were detected 8 weeks after modeling to evaluate the protective effect of emodin on EAT mice.T cell subset and the levels of IFN-γ and IL-4 in peripheral blood and spleen were detected by flow cytometry.Results The histopathological study revealed that inflammatory infiltration in thyroid was significant reduced after emodin treatment compared with control group（P＜0.01）.Levels of serum TgAb were significant increased in each group after modeling[（44.16±3.59）ng/mL vs（11.24±1.52）ng/mL],and the increasing amplitudes in emodin treated groups were significantly less than that in model group[（26.58±5.24）ng/mL，（19.18±5.73）ng/mL，（23.24±5.47）ng/mL vs（44.16±3.59）ng/mL,P＜0.01].After modeling,the cell frequencies of CD3+CD4+,CD3+CD8+T cells,CD3+CD4+IL-4+and CD3+CD4+IFN-γ+T cells in peripheral blood monocyte and splenic lymphocyte were significant increased in each group compared with control group peripheral blood monocyte:[（7.72%±2.92）%vs（4.13%±1.45）%，（4.23%±1.58）%vs（2.76%±1.69）%];splenic lymphocyte:[（7.51%±1.31）%vs（1.82%±1.35）%,（5.59%±1.98）%vs（0.033±0.034）%，P＜0.01],while the in－creasing amplitudes in emodin treated groups were less than that in model group peripheral blood monocyte:[（7.72±2.92）%vs（17.46±3.71）%，（4.23±1.58）%vs（8.92%±2.62）%];splenic lymphocyte:[（7.51±1.31）%vs（16.74±4.79）%，（5.59±1.98）%vs （11.97±2.21）%,P＜0.01].The difference in cell frequencies of CD3+CD4+IFN-γ+and CD3+CD4+IL-4+T cells in emodin treated groups were significant higher than that of control group and lower than that of model group（P＜0.01）.Conclusion The EAT model is visible through an excessive iodine-induced method in NOD mice,and emodin shows a certain inhibitory effect on autoimmune response in EAT mice.This effect could be performed by inhibiting the differentiation of lymphocyte into CD3+CD4+,CD3+CD8+T cells and by inhibiting the secretion of IFN-γ and IL-4 in CD3+CD4+T cells.

NOD mice;experimental autoimmune thyroiditis;emodin;T cell subsets

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014ZA037）

浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科（杭州 310006）

吳可人，Tel：057186008521；E-mail：wkr3000@sina.com

（收稿：2017-04-24 修回：2017-05-24）