烏藥不同提取物對酒精性肝損傷大鼠肝臟及小腸組織形態(tài)學(xué)的干預(yù)研究

陳 潮 湯小剛 王軍偉 譚明明 樓招歡

·實驗研究·

烏藥不同提取物對酒精性肝損傷大鼠肝臟及小腸組織形態(tài)學(xué)的干預(yù)研究

陳 潮1湯小剛1王軍偉1譚明明1樓招歡2

目的 觀察烏藥不同提取物對酒精性肝損傷模型大鼠肝臟及小腸組織形態(tài)學(xué)的影響。方法 實驗1：SD大鼠80只，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組、STW組、CTW組、CTC1組、CTC2組、CTC3組，每組10只；除正常對照組（以等體積的蒸餾水灌胃）外，其余各組灌胃法給予1mL/100g白酒，每日2次，連續(xù)10天；第l天起，正常組及模型組予相同體積的蒸餾水，其余各組灌胃給予1mL/100g體積的相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)10天。末次給藥后處死大鼠并取下肝組織，固定、石蠟包埋、HE染色后觀察病理改變。實驗2：SD大鼠88只隨機(jī)分組，組別同實驗1，每組11只；除正常對照組（以等體積的蒸餾水灌胃）外，其余各組大鼠均給予酒精體積濃度50%的白酒灌胃造模，每日1次，灌胃容積1.2mL/100g，連續(xù)33天；第1天起，正常組及模型組予相同體積的蒸餾水，其余各組灌胃給予1mL/100g體積的相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)33天。末次給藥后處死大鼠并取下小腸組織，固定、石蠟包埋、HE染色后觀察病理改變。結(jié)果 （1）與正常對照組相比，模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)受到損傷，其界限較模糊，肝細(xì)胞索排列紊亂，散見肝細(xì)胞呈點灶狀壞死，匯管區(qū)可見炎細(xì)胞浸潤；小腸粘膜呈部分腸上皮細(xì)胞變性、壞死，間質(zhì)輕度水腫，絨毛橫徑增寬。與模型組相比，烏藥各提取部位組大鼠肝臟、小腸組織炎癥細(xì)胞浸潤及壞死程度均降低，病理變化程度明顯減輕。（2）烏藥不同提取物組對比，烏藥醇提取物抗肝及腸道損害優(yōu)于水提取物；醇提取物中，烏藥醇提石油醚萃取物和醇提正丁醇萃取物效果較優(yōu)。結(jié)論 烏藥各提取物能明顯改善酒精損傷大鼠肝和小腸組織損傷。

大鼠；酒精性肝損傷；烏藥提取物；肝臟；小腸；組織學(xué)

酒精性肝損傷是常見的致肝硬化原因，目前，我國由于酒精性肝損傷引起的酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，而臨床上對酒精性肝損傷的治療效果較差。烏藥是傳統(tǒng)常用中藥，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)痛消炎等作用，臨床應(yīng)用較廣。研究[1]表明，烏藥有較好保護(hù)肝損傷作用和抗氧化作用。本文進(jìn)一步從組織病理角度探索烏藥不同提取物對酒精性肝損傷大鼠肝臟、小腸的保護(hù)作用，并對不同提取物的療效進(jìn)行比較，以了解烏藥保護(hù)酒精性肝損傷大鼠肝臟、小腸組織損傷的可能有效成份，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 藥物與試劑 烏藥由浙江省天臺山烏藥生物工程有限公司提供，經(jīng)該公司陳方標(biāo)藥師鑒定為樟科（Lauraceae）山胡椒屬（Lindera）植物烏藥Lindera aggregata（Sims）Kosterm 的干燥塊根。聯(lián)苯雙酯（浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司），用蒸餾水進(jìn)行溶解并稀釋成0.225mg/mL濃度備用；思密達(dá)（博福-益普生（天津）制藥有限公司，批號K030407），規(guī)格3g×10袋，用蒸餾水配制成濃度為0.09g/mL的混懸液備用。紅星二鍋頭（北京紅星股份有限公司生產(chǎn)，酒精度為52%），按一定比例稀釋。

1.2 實驗動物 實驗1：健康SD大鼠80只，雌性，體質(zhì)量 170～200g，動物質(zhì)量合格證號：0007718；實驗2：健康SD 大鼠88只，雌性，體質(zhì)量 180～220g，動物質(zhì)量合格證號：0016074；均采購自浙江省實驗動物中心。

2 實驗方法

2.1 烏藥水提取物制備 取烏藥適量，加入12BV水提取1.5h，濾取藥液，藥渣繼用10BV水提取1h，濾取藥液，合并2次藥液，減壓回收并適當(dāng)濃縮，即得烏藥水提取物（STW）。烏藥醇提取物制備：取烏藥適量，加入12BV75%乙醇提取1.5h，濾取藥液，藥渣繼用10BV乙醇提取1h，濾取藥液，合并兩次藥液，減壓回收并適當(dāng)濃縮，即得烏藥醇提取物（CTW）。烏藥醇提取物各萃取物：取烏藥醇提取物適量，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇，分次萃取至色淡，分取并合并各萃取層，減壓回收溶劑，分別得烏藥醇提取物石油醚萃取物（CTC1）、烏藥醇提取物乙酸乙酯萃取物（CTC2）、烏藥醇提取物正丁醇萃取物（CTC3）。取烏藥醇提取物各萃取物，用適量吐溫80研磨后，加水置磁力攪拌器上混勻，加純水稀釋，使每毫升藥液相當(dāng)于1g生藥，即得各萃取物溶液。上述各溶液，臨用前用適量純水稀釋，使每毫升藥液相當(dāng)于0.5g生藥。

2.2 動物處理 所有實驗大鼠均喂基礎(chǔ)飼料，自由飲水和采食。實驗1：SD大鼠80只隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組（聯(lián)苯雙酯2.25mg/mL）、STW 組、CTW 組、CTC1 組、CTC2 組、CTC3 組，每組10只。除正常對照組（以等體積的蒸餾水灌胃）外，其余各組大鼠灌胃法給予1mL/100g不同酒精濃度的白酒（酒精體積濃度逐漸從30%遞增至50%）每日2次，連續(xù)10天[1]，具體為：第1～2天灌胃給予酒精體積濃度為30%的白酒，第3～4天增加至40%，第5～10天增加至50%，持續(xù)灌胃至第10天；灌胃第1天起，灌胃法給予正常組及模型組相同體積的蒸餾水，其余各組灌胃給予1mL/100g體積的相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)10天，末次給藥后處死大鼠并取下肝臟，稱取新鮮肝臟0.5g制取10%的肝勻漿。實驗2：SD大鼠88只隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組（思密達(dá)0.09g/mL）、STW組、CTW組、CTC1組、CTC2組、CTC3組，每組11只。除正常對照組（以等體積的蒸餾水灌胃）外，其余各組大鼠均給予酒精體積濃度50%的白酒灌胃造模，每日1次，灌胃容積1.2mL/100g，連續(xù)33天造模結(jié)束[2]；灌胃第1天起，灌胃法給予正常組及模型組相同體積的蒸餾水，其余各組灌胃給予1mL/100g體積的相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)33天，末次給藥后處死大鼠并摘取小腸。

2.3 組織處理 實驗1大鼠取肝臟左葉，實驗2大鼠取回盲部上方15cm處小腸，用10%中性甲醛對組織進(jìn)行固定及石蠟包埋，HE染色后于顯微鏡下觀察各組織的病理改變。

3 結(jié) 果

3.1 對酒精性肝損傷模型大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響 肉眼觀察，正常組大鼠肝臟組織色澤正常，腹腔腸管間無粘連；模型組大鼠肝臟顏色稍微變黃，腹腔內(nèi)腸管之間出現(xiàn)粘連。光鏡下觀察可見正常組肝臟的肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞呈放射狀排列，肝細(xì)胞輪廓清晰，無壞死；模型組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)受到損傷，其界限較模糊，肝細(xì)胞索排列紊亂，散見肝細(xì)胞呈點灶狀壞死，匯管區(qū)可見炎細(xì)胞浸潤；與模型組相比，陽性對照組及烏藥各提取部位組大鼠肝臟炎癥細(xì)胞浸潤及壞死程度均降低，其肝組織病理變化程度明顯減輕。其中，烏藥醇提取物組優(yōu)于水提取物組；而在醇提取物中，烏藥醇提石油醚萃取物和醇提正丁醇萃取物效果較優(yōu)，見圖1（封底）。

圖1 肝組織病理學(xué)（HE染色，×400）

3.2 對酒精性肝損傷模型大鼠小腸組織形態(tài)學(xué)的影響 光鏡下可見正常對照組大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)正常，微絨毛整齊、密集，無缺損；模型對照組大鼠小腸黏膜呈部分腸上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，間質(zhì)輕度水腫，少量炎細(xì)胞浸潤，絨毛橫徑增寬。與模型對照組相比，陽性對照組及烏藥各給藥組大鼠小腸組織病理變化程度明顯減輕。其中，烏藥醇提取物組優(yōu)于水提取物組；而在醇提取物中，烏藥醇提石油醚萃取物和醇提正丁醇萃取物效果亦較優(yōu)，見圖 2（封底）。

圖2 小腸組織病理學(xué)（HE染色，×100）

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，長期的酒精攝入可導(dǎo)致腸黏膜通透性增高，使過多內(nèi)毒素通過血液循環(huán)損傷肝臟[3]，這是酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制之一。Tamai等[4]用20%酒精胃內(nèi)灌注大鼠，4h后觀察到近端小腸糜爛出血和上皮細(xì)胞缺失，證明了酒精可導(dǎo)致腸黏膜損傷。聶嬌等[5]通過酒精攝入誘導(dǎo)酒精性肝損傷動物模型也發(fā)現(xiàn)酒精組血清內(nèi)毒素水平明顯高于對照組，對腸形態(tài)學(xué)的觀察可發(fā)現(xiàn)腸黏膜有明顯損傷。酒精作為肝臟毒劑，可削弱正常肝細(xì)胞的代謝及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，損傷線粒體功能，同時又可致小腸黏膜通透性增加，屏障功能減弱，腸道細(xì)菌過度生長，產(chǎn)生大量內(nèi)毒素[6-7]，導(dǎo)致腸源性內(nèi)毒素滲漏形成二次攻擊加重肝損傷。

藥理研究表明，烏藥對消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及抗病毒等方面具有廣泛的藥理活性[8-9]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型對照組大鼠光鏡下肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)受到損傷，其界限較模糊，肝細(xì)胞索排列紊亂，散見肝細(xì)胞呈點灶狀壞死，匯管區(qū)可見炎細(xì)胞浸潤,小腸黏膜呈部分腸上皮細(xì)胞變性、壞死，間質(zhì)輕度水腫，絨毛橫徑增寬，均提示造模成功。與模型組相比，陽性對照組及烏藥各提取部位組大鼠光鏡下肝臟及小腸炎癥細(xì)胞浸潤及壞死程度均降低，組織病理變化程度明顯減輕,實驗表明烏藥有明顯的減輕酒精對肝臟及小腸的損害作用，結(jié)合文獻(xiàn)[10]復(fù)習(xí)，考慮烏藥通過保護(hù)小腸組織，減輕腸源性內(nèi)毒素血癥，從而起到保肝組織作用；同時醇提取物抗損傷作用優(yōu)于水提取物，且在醇提取物三個萃取部位中，烏藥醇提石油醚萃取物和醇提正丁醇萃取物效果較優(yōu)。雖然目前無法得知烏藥作用的具體有效成分及藥效部位，但可推知烏藥保肝、小腸成分主要存在于烏藥醇提取物及其石油醚萃取物和正丁醇萃取物中。

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ACC向國際媒體宣布：中醫(yī)藥可有效治療心血管疾病

6月20日，《美國心臟病學(xué)會雜志》刊發(fā)山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院張運院士和趙玉霞教授團(tuán)隊?wèi)?yīng)邀撰寫的綜述文章。文章評價了中醫(yī)藥治療心血管疾病的安全性和有效性，提出對于心血管疾病一級和二級預(yù)防某些中醫(yī)藥可作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的替代和補充治療，但尚需要更嚴(yán)格的隨機(jī)臨床試驗以驗證中醫(yī)藥對心血管疾病患者總死亡率和主要心血管事件的長期影響。

為完成此次約稿，研究團(tuán)隊經(jīng)過1年時間，在2006-2016年的近千篇文獻(xiàn)中，按照國際標(biāo)準(zhǔn)篩選出56篇高質(zhì)量隨機(jī)雙盲臨床研究，根據(jù)證據(jù)強度和研究質(zhì)量將這些研究進(jìn)行分組，系統(tǒng)分析了多種心血管疾病臨床試驗的中醫(yī)藥療法、對比療法、觀察終點、治療前后終點改變。此外，文章系統(tǒng)分析了中藥有效成分多酚、萜類、皂苷類和生物堿治療心血管疾病的藥理學(xué)作用、可能的分子機(jī)制以及基礎(chǔ)研究采用的細(xì)胞和動物模型。

美國心臟病學(xué)會（ACC）在其向國際媒體發(fā)布的官方新聞中指出，文章中收集的研究證明中醫(yī)藥對于一些心血管疾病具有益處，這對于那些不能耐受或經(jīng)濟(jì)上不能負(fù)擔(dān)西藥的患者是一個很好的替代療法。

趙玉霞教授指出，雖然中藥處方大多為復(fù)方，且醫(yī)師常依據(jù)個體化原則自行組方，但傳統(tǒng)中醫(yī)藥某些活性成分的藥理學(xué)作用及分子機(jī)制已被闡明，對于心血管的一級和二級預(yù)防，某些中藥有可能成為補充或替代療法。

（引自中國醫(yī)學(xué)論壇報）

Effect of Extracts from Radix linderae on the Morphology of Liver and Intestinal Tissue in Rats with Al－coholic Liver Disease

CHEN Chao1,TANG Xiaogang1,WANG Junwei1,TAN Mingming1,LOU Zhaohuan2.
1Department of Gastroenterology；2Department of Emergency Medicine,People's Hospital of Tiantai Zhejiang,Tiantai(317200),China;3Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

Objective To investigate the effect of different extracts from Radix linderae on the morphology of liver and intestine of alcoholic liver disease（ALD） rats.Methods The 1st experiment:Eighty SD rats were randomly divided into blank,model,control,STW,CTW,CTC1,CTC2,CTC3 groups,with 10 rats in each group.Except for blank group（equivalent volume of distilled water）,other groups were given wine（1mL/100g）,twice a day,for 10 days.From day 1,except for blank and model groups（equivalent volume of distilled water）,other groups were administered with the corresponding drugs,1mL/100g,once a day,for 10 days.At the end of the treatment all rats were sacrificed to collect the liver tissue for HE staining observation.The 2nd experiment:Eighty eight SD rats were randomly divided into the same groups as in the 1st experiment,with 11 rats in each group.Except for blank group （equivalent volume of distilled water）,other groups were given wine of volume concentration of 50%alcohol by gavage,1.2mL/100g,once a day,for 33 days.At the end of the treatment all rats were sacrificed tocollect the intestinal tissue for HE staining observation.Results The histological observation of the liver in rats with ALD showed damaged hepatic lobules,abnormal hepatic cords,scattered spotted and focal necrosis,and inflammation in portal area;the histology of the intestine of ALD rats showed degeneration and apoptosis of epithelial cells,interstitial edema,and enlarged villi.Compared with model group,the injuries of the liver and intestinal tisues of rats treated with extracts from Radix linderae were significantly attenuated.This effect was more obvious with alcohol extract than with aqueous extract from Radix linderae.The best two alcohol extracts from Radix linderae were mineral ether extract and n-butyl extract.Conclusion Different extracts from Radix linderae can obviously reduce the liver and intestine damage in rats with ALD.

rats;alcoholic liver disease;extracts from Radix linderae;liver;intestine;histology

浙江省科技廳公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃（No.2013C33222）；臺州市科技計劃（No.2014A33339）；國家自然科學(xué)基金青年項目（No.81503328）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺計劃（No.2015DTA021）；浙江省科技廳公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃（No.2016C33184）。

1浙江省天臺縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科（陳潮、湯小剛），急診醫(yī)學(xué)科（王軍偉、譚明明）（天臺 317200）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)（杭州 310053）

王軍偉，E-mail：901086@163.com，Tel：13758605567

（收稿：2017-03-26 修回：2017-07-05）