鈷-銀納米微粒的制備及抑菌活性的初步探索

張國(guó)超，高 琪，魏小樂(lè)，何 琦，姜 宇，馬興銘，袁苗苗

（1蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000；2南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510000）

鈷-銀納米微粒的制備及抑菌活性的初步探索

張國(guó)超1，高 琪1，魏小樂(lè)1，何 琦1，姜 宇1，馬興銘1，袁苗苗2

（1蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000；2南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510000）

目的：制備鈷-銀納米微粒，并初步探討鈷-銀納米微粒對(duì)細(xì)菌的抑制效果．方法：利用水熱合成法制備出不同銀含量的鈷-銀納米微粒．運(yùn)用掃描電子顯微鏡表征鈷-銀復(fù)合納米材料，并評(píng)價(jià)其對(duì)常見(jiàn)細(xì)菌的殺滅效果．結(jié)果：鈷-銀復(fù)合微粒粒徑約為10 μm，銀含量不同的鈷-銀復(fù)合納米材料均顯示出抑菌作用，尤其銀含量高的鈷-銀復(fù)合納米材料抗菌效果較好．鈷-銀復(fù)合納米材料可以通過(guò)磁場(chǎng)力將其回收，鈷-銀納米復(fù)合材料回收率為98%，回收的鈷-銀納米復(fù)合材料仍有抑菌作用，并可以重復(fù)使用又可以減少對(duì)環(huán)境的污染．結(jié)論：制備的鈷-銀納米微粒具有較好的抑菌活性和較高的回收率，回收得到的材料依舊有很好的抗菌效果．

納米材料；抗菌作用；可回收材料

0 背景

致病菌的傳播和蔓延嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生存和健康［1］．抗菌素的過(guò)度使用又給我們帶來(lái)了耐藥菌、超級(jí)細(xì)菌．近年來(lái)，納米殺菌材料以自身理化性質(zhì)對(duì)細(xì)菌的殺滅作用使其有望成為新型抗菌物質(zhì)．目前所報(bào)道的納米殺菌材料包括 TiO2、ZnO、CuO、Ca（HO）2、MgO、殼聚糖、銀等［2-8］．在這些殺菌材料中，銀及其復(fù)合物能夠廣泛地殺死細(xì)菌、病毒等微生物，是較為有效的抗菌劑．臨床上使用載銀醫(yī)用敷料可以殺滅傷口上的細(xì)菌，避免傷口的感染，且可以促進(jìn)慢性傷口的愈合［9］．與無(wú)涂層的外科縫線相比，涂有載銀生物活性的外科縫線抑制細(xì)菌粘附能力更強(qiáng)［8］．此外，載銀系抗菌材料還用于導(dǎo)尿管、纖維織物、抗菌塑料等［10-12］．在水處理方面，TiO2很早被用于廢水處理系統(tǒng)［13］，然而銀及其含銀復(fù)合物在機(jī)體中累積過(guò)多會(huì)引起嚴(yán)重的銀中毒，處理后這些化學(xué)材料的移除會(huì)增加額外的時(shí)間和成本，因此，含銀復(fù)合物在水處理方面的應(yīng)用研究較少．將銀包覆在磁性粒子表面，通過(guò)外加磁場(chǎng)回收將是一種成本低、效率高的移除方法．本研究利用水熱合成法制備了鈷納米微粒，以鈷納米微粒為載體，在水溶液中制備了表面載銀的鈷-銀復(fù)合納米材料，以水中細(xì)菌為檢測(cè)對(duì)象，并初步評(píng)價(jià)了其抑菌效果，結(jié)果表明磁性鈷-銀復(fù)合納米材料具有良好的抑菌效果，具有回收方便、重復(fù)利用的特點(diǎn)，可以作為一種新型的殺菌材料．

1 材料和方法

1．1 主要試劑 分析純六水合氯化鈷（CoCl2·6H2O）購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司，分析純水合肼（N2H4·H2O）、乙二胺四乙酸（EDTA）購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠，硝酸銀（AgNO3）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)試劑公司．胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自英國(guó)OXOID公司．

1．2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌菌A209由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所保存．

1．3 鈷-銀納米微粒的制備 稱6 gNaOH溶于10 mL蒸餾水中，配成15 mol／L的溶液，冷卻至室溫；稱1．442 g CoCl2·6H2O溶解到48 mL蒸餾水中配成6 mmol／L的溶液；將配好的CoCl2·6H2O溶液逐滴滴入NaOH溶液中，攪拌至分散均勻；依次加入3．5245 g EDTA、16 mL水合肼、75 mL乙醇，得到混合溶液；將混合溶液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯容器中，放入高壓反應(yīng)釜中，震蕩搖均，160℃反應(yīng)20 h得到鈷納米粉末；分別用無(wú)水乙醇和去離子水反復(fù)洗滌多次，放置于60℃烘箱中干燥．在燒杯中，依次加入去離子水90 mL，鈷納米粉末 100 mg，64．1 mg AgNO3，攪拌 1 h，5000 rmp離心得到鈷-銀納米沉淀；依次用去離子水和無(wú)水乙醇超聲、離心洗滌數(shù)次，冷凍干燥備用．以相同的方法制備銀含量不同的鈷-銀納米微粒，AgNO3的投入量分別為 128．1 mg、192．2 mg．獲得低、中、高銀含量不同的三種鈷-銀納米微粒．

1．4 鈷-銀納米微粒的表征 采用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（Kevex JSM-6701F，Japan）對(duì)合成的鈷-銀納米微粒樣品的表觀形貌進(jìn)行觀察．

1．5 鈷-銀納米微粒的體外最小抑菌濃度的測(cè)定（minimum inhibitory concentration， MIC） 取高壓滅菌的三種鈷-銀納米微粒各0．04 g，溶于無(wú)菌PBS液（pH＝7．4） 4 mL，配成10 μg／μL 溶液．取24 孔板，每孔中加入2 mL菌液（大腸桿菌／金黃色葡萄球菌1．0×105CFU／mL），加入鈷-銀納米微粒溶液并稀釋為20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280 μg／μL 的不同濃度，37℃、180 rmp 培養(yǎng) 24 h，肉眼觀察以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為鈷-銀納米微粒的MIC，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次．

1．6 鈷-銀納米微粒的二次抑菌作用測(cè)定 確定不同銀含量的鈷-銀納米微粒對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的首次抑菌濃度后，將磁鐵放到24孔板下40 min后，緩慢棄掉孔中的菌液，用生理鹽水洗滌三次，重新加入 2 mL 菌液（1．0×105CFU／mL）37℃、180 rmp培養(yǎng)24 h，肉眼觀察以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為鈷-銀納米微粒的MIC，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次．

1．7 鈷-銀納米微粒回收率測(cè)定 取12 mL的培養(yǎng)管，將不同銀含量的鈷-銀納米微粒與水（方法同1．6）按比例混合，并37℃、180 rmp作用24 h．將磁鐵放到培養(yǎng)管下方40 min左右，待鈷-銀納米微粒被磁鐵吸引到培養(yǎng)管底部，緩慢棄掉培養(yǎng)管中的細(xì)菌菌液，60℃干燥至離心管恒重．根據(jù)下面公式計(jì)算回收率：回收率＝回收量／投入量×100%．

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，配對(duì)樣本t檢驗(yàn)對(duì)首次和二次回收的鈷-銀納米微粒作用不同菌種最小抑菌濃度進(jìn)行配對(duì)分析．

2 結(jié)果

2．1 鈷-銀納米微粒的表征 鈷-銀納米微粒的掃描電子顯微鏡形貌如圖1所示，制備出單分散和花形的鈷-銀納米微粒．鈷-銀納米微粒粒徑較均勻，且在水中分散較好，平均粒徑約為10 μm．

圖1 鈷-銀納米微粒的掃描電子顯微鏡結(jié)果

2．2 鈷-銀納米微粒對(duì)細(xì)菌的抑制作用 鈷-銀納米微粒對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC見(jiàn)表1．鈷-銀納米微粒和二次回收的鈷-銀納米微粒對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均能夠顯示出抑菌作用．隨著鈷-銀納米微粒中銀含量的升高，抑菌效果越明顯．與首次鈷-銀納米微粒作用于不同菌種的最小抑菌濃度相比，二次回收的最小抑菌濃度增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，表 2）．

表1 鈷-銀納米微粒對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC（μg／mL）

表2 鈷-銀納米微粒首次和二次抑制大腸桿菌、經(jīng)黃色葡萄球菌的MIC差異比較

2．3 鈷-銀納米微粒的回收測(cè)定 將干燥后的高銀含量的鈷-銀納米微粒進(jìn)行稱重，計(jì)算回收率，測(cè)得回收率為98%．

3 討論

金屬類(lèi)納米殺菌劑有 Ag+、Zn2+、Cu2+、 Hg2+等許多重金屬離子，其中殺菌效果好且對(duì)人體毒性最小金屬類(lèi)殺菌劑是Ag+．Ag+也是目前研究最多的離子殺菌劑．銀離子對(duì)12種革蘭氏陰性菌、8種革蘭氏陽(yáng)性菌、6種霉菌均有強(qiáng)烈的殺滅作用，具有成為抗菌材料的潛力［14］．磁性納米粒子以粒徑均一、表面積大、超順磁性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于硬質(zhì)合金、污水處理、電池等行業(yè)和催化劑、磁性材料、吸波材料、陶瓷等領(lǐng)域［15-16］，其中與鐵、鎳納米粒子相比較，鈷納米粒子具有磁性更強(qiáng)、更容易團(tuán)聚的特點(diǎn)．因此，鈷納米載體微粒得到了較為廣泛的應(yīng)用．

本實(shí)驗(yàn)利用水合肼液相還原法制得鈷納米微粒，將AgNO3溶液中的銀離子還原出來(lái)，并覆蓋在鈷納米材料上，制備成鈷-銀納米微粒．這種鈷-銀納米微粒既具有金屬銀的殺菌性又有金屬鈷的強(qiáng)磁性．鈷-銀納米微粒既能夠抑制水中常見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，又通過(guò)磁場(chǎng)力作用可以再次回收利用，降低金屬銀的的污染和毒性，有效地抑制了水中的常見(jiàn)菌群，為污水治理提供了新方法．從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，可回收鈷銀納米材料技術(shù)將會(huì)節(jié)約企業(yè)生產(chǎn)成本，經(jīng)回收后減少對(duì)周邊環(huán)境造成影響，循環(huán)利用，尤其在細(xì)菌滋生的污水處理方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但其制備工藝完善，對(duì)水質(zhì)、細(xì)菌等影響以及抑菌機(jī)制需要進(jìn)一步研究和評(píng)價(jià)．

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Preparation of cobalt-silver nanoparticles and preliminary study on its antibacterial activity

ZHANG Guo-Chao1， GAO Qi1， WEI Xiao-Le1， HE Qi1， JIANG Yu1， MA Xing-Ming1， YUAN Miao-Miao21School of Basic Medical Sciences， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China；2School of Basic Medical Sciences， Southern Medical University， Guangzhou 510000， China

AIM： To study the preparation of cobalt-silver nanoparticles and its antibacterial activity．METHODS： Co-Ag composite nano-materials with different silver contents were prepared by hydrotherma synthesis．The scanning electron microscopy（SEM） was used to characterize these products， whose antibcuterialeffects on common bacteria were evaluated．RESULTS：The size of cobalt-silver nanoparticles is about 10 μm．Co-Ag composite nano-materials with different contents of silver have good antibacterial efficacy．With the content of silver increased， the antibacterial effect becomes better．Co-Ag composite nano-materials can be recycled by the magnetic field，with a higher recovery rate of 98%．CONCLUSION： The recycled product also has the antibacterial effect．Co-Agcomposite nano-materials not only has the higher recovery rate，but also can reduce the pollution to the environment．

nanomaterials； antibacterialeffect； recyclable materials

TB44；TF123

A

2095-6894（2017）11-39-03

2017-06-13；接受日期：2017-06-28

蘭州大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金（lzujbky-2017-117）

張國(guó)超．碩士生．E-mail：18238838551＠ 163．com通訊作者：馬興銘．博導(dǎo)．E-mail：maxm＠ lzu．edu．cn

袁苗苗（共同通訊作者）．博士．E-mail：yuanmm2007＠ 126．com