磷脂酶D1在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及雷公藤甲素的干預(yù)作用

顧取良，鄶一賀，陳佳園，李江超，王麗京 （廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣東廣州510006）

磷脂酶D1在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及雷公藤甲素的干預(yù)作用

顧取良，鄶一賀，陳佳園，李江超，王麗京 （廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣東廣州510006）

目的：探討磷脂酶D1（PLD1）在不同乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況以及雷公藤甲素（TP）對(duì)人乳腺癌細(xì)胞PLD1表達(dá)的影響．方法：體外培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MCF7、MDA-MB-231和小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1，以人乳腺上皮細(xì)胞MCF10A為對(duì)照，采用半定量RT-PCR測(cè)定PLD1 mRNA表達(dá)水平，Western blot法測(cè)定PLD1蛋白表達(dá)水平，并分別測(cè)定不同濃度 TP對(duì)PLD1及細(xì)胞周期素D1（cyclin D1）mRNA和蛋白的表達(dá)水平的影響．結(jié)果：半定量RT-PCR和Western blot分析均顯示，PLD1 mRNA和蛋白在乳腺癌細(xì)胞MCF7、MDA-MB-231和4T1中的表達(dá)顯著高于乳腺上皮細(xì)胞MCF10A，其中MDA-MB-231細(xì)胞PLD1蛋白表達(dá)水平約為MCF10A細(xì)胞的20倍．TP抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖的同時(shí)下調(diào)PLD1和cyclin D1表達(dá)水平，并且呈一定濃度依賴(lài)性．結(jié)論：相比乳腺正常上皮細(xì)胞，PLD1 mRNA和蛋白在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)增高，TP抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制與其抑制PLD1的表達(dá)有關(guān)．

磷脂酶D1；乳腺癌細(xì)胞；乳腺上皮細(xì)胞；雷公藤甲素

0 引言

磷脂酶D（phospholipase，PLD）是一類(lèi)能夠催化磷脂酰膽堿水解的酶，哺乳類(lèi)動(dòng)物常見(jiàn) PLD1和PLD2兩種亞型．PLD水解作用產(chǎn)物磷脂酸、二脂酰甘油及溶血磷脂酸等均可作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與調(diào)控許多生理和生化過(guò)程信號(hào)通路如調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活、遷移等［1］．PLD在腫瘤的發(fā)生、分化、凋亡及轉(zhuǎn)移等過(guò)程中扮演重要的角色［2-3］，已有文獻(xiàn)［4-6］表明，在多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)PLD1活性異常升高，如子宮內(nèi)膜癌、胃癌、肝細(xì)胞癌等．乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升且年輕化趨勢(shì)，對(duì)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及其治療的研究是目前的熱點(diǎn)［7］．有關(guān)PLD1與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及其表達(dá)水平是否與預(yù)后等相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道尚不多見(jiàn)［8］．Oncomine癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)不同來(lái)源的數(shù)據(jù)集關(guān)于PLD1 mRNA水平的變化與乳腺癌的關(guān)系結(jié)論并不一致，如TCGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示浸潤(rùn)性乳腺小葉癌和乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中PLD1 mRNA表達(dá)下降，而另一來(lái)源的數(shù)據(jù)分析則顯示浸潤(rùn)性乳腺癌PLD1 mRNA表達(dá)相比正常組織顯著增高，提示PLD1表達(dá)變化在乳腺癌發(fā)生發(fā)展方面的具體作用仍未明確．

雷公藤甲素（triptolide，TP）是從雷公藤屬植物中分離純化而得到的環(huán)氧二萜內(nèi)酯類(lèi)化合物，具有免疫抑制、抗炎、抗生育和抗腫瘤等多種生物活性，與傳統(tǒng)化療藥物相比，其抗腫瘤作用具有高效、廣譜的特點(diǎn)．TP抗腫瘤機(jī)制主要與誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)［9］，其具體分子機(jī)制尚未完全闡明．Kang等［10］報(bào)道，TP可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性抑制乳腺癌細(xì)胞PLD1表達(dá)及活性．Li等［11］報(bào)道，TP抗乳腺癌細(xì)胞 MCF-7增殖作用與下調(diào)雌激素受體、下游MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)及其磷酸化有關(guān)．

為了進(jìn)一步研究PLD1與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本研究首先以正常人乳腺上皮細(xì)胞MCF10A為對(duì)照，檢測(cè)比較人乳腺癌細(xì)胞MCF7、MDA-MB-231和小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1中PLD1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，并以MDA-MB-231細(xì)胞為作用對(duì)象研究TP對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其對(duì)PLD1及其相關(guān)通路下游基因表達(dá)水平的影響，為闡明TP抗乳腺癌作用機(jī)制及其應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

1 材料和方法

1．1 主要試劑 Dulbecco's modified eagle's medium（DMEM）培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素混合液、胰蛋白酶為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品，RNA提取試劑Trizol Reagent為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；RT-PCR試劑盒（RR014A）購(gòu)自Takara公司；蛋白濃度測(cè)定試劑盒Pierce BCA Protein Assay Kit購(gòu)自 Thermo Fisher公司；PLD1抗體（#3832）購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，cyclin D1抗體、β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemi-luminescence，ECL）試劑購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司．TP購(gòu)于北京金寶科技有限公司（純度≥98%），四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）購(gòu)自Sigma公司．

1．2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞 MCF7、MDA-MB-231、小鼠乳腺癌細(xì)胞 4T1及人乳腺上皮細(xì)胞MCF10A為廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院血管生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室保存．MCF10A細(xì)胞及其專(zhuān)用培養(yǎng)基購(gòu)自廣州賽哲生物科技有限公司，其余細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），添加100 U／mL青霉素和鏈霉素混合液，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

1．3 半定量RT-PCR檢測(cè) 采用Trizol試劑分別提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞 MCF7、MDA-MB-231、4T1和乳腺上皮細(xì)胞MCF10A的總RNA，經(jīng)紫外分光光度法檢測(cè)純度并定量后，按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄得cDNA后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參．引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1．

表1 PCR引物序列

擴(kuò)增條件：預(yù)變性 94℃ 4 min；94℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；延伸 72℃ 8 min；4℃保存．?dāng)U增產(chǎn)物在含有溴化乙錠的1．5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后，Syngene凝膠成像系統(tǒng)拍攝并采用Image J軟件分析條帶亮度以計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平．

1．4 Western blot檢測(cè) 按常規(guī)方法分別提取各組細(xì)胞的總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度．各取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜．室溫封閉 1 h后，與 PLD1、cyclin D1多克隆抗體或β-actin單克隆抗體分別孵育，4℃過(guò)夜；經(jīng)TBST漂洗后再分別加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h．然后用ECL試劑顯影，ImageQuant LAS4000成像系統(tǒng)拍攝并采用Image J軟件進(jìn)行主帶灰度分析以計(jì)算相對(duì)蛋白表達(dá)水平．

1．5 TP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖活力和PLD1及cyclin D1 表達(dá)的影響 不同濃度 TP（0、10、25、50、100、250、500 nM）作用于 MDA-MB-231 細(xì)胞 24 h、48 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力．不同濃度TP（0、20、100 nM）作用于MDA-MB-231 細(xì)胞24 h 后，按前述方法分別檢測(cè)不同作用濃度下細(xì)胞內(nèi)PLD1和cyclin D1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平．

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SEM）表示，采用單因素方差分析，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果

2．1 PLD1 mRNA在乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá) 半定量RT-PCR擴(kuò)增條帶電泳相對(duì)亮度定量分析顯示，與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A細(xì)胞相比，PLD1 mRNA在乳腺癌細(xì)胞系MCF7細(xì)胞中的表達(dá)約為其2倍，在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和4T1細(xì)胞中的表達(dá)分別約為其8倍、7倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（??P＜0．01，圖 1）．

圖1 半定量RT-PCR檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中PLD1 mRNA的表達(dá)

2．2 PLD1蛋白在乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá) Western blot檢測(cè)顯影條帶灰度值分析結(jié)果顯示，與乳腺上皮細(xì)胞MCF10A細(xì)胞相比，PLD1蛋白在乳腺癌細(xì)胞系MCF7細(xì)胞中的表達(dá)約為其2倍，在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和4T1細(xì)胞中的表達(dá)則高達(dá)20 倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（?P＜0．05，??P＜0．01，圖 2）．

圖2 Western blot法檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中PLD1蛋白的表達(dá)

2．3 MTT法檢測(cè)TP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖活力的影響 10～500 nM濃度范圍TP作用于MDAMB-231細(xì)胞24 h或48 h，MTT法檢測(cè)（圖3）表明，與0 nM TP相比，TP從25 nM濃度開(kāi)始對(duì)細(xì)胞增殖活力的抑制作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（?P＜0．05 或??P＜0．01），并呈一定濃度和時(shí)間依賴(lài)趨勢(shì)；但當(dāng)TP濃度達(dá)到100 nM以上時(shí)，其對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的抑制程度并不隨濃度進(jìn)一步明顯增加，且作用48 h抑制程度與作用24 h抑制程度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

圖3 MTT法檢測(cè)TP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的抑制作用

2．4 TP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中PLD1和cyclin D1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 將不同劑量TP（0、20、100 nM）作用于MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，用半定量RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PLD1和cyclin D1的mRNA表達(dá)均下調(diào)，且隨著TP濃度增加而呈劑量依賴(lài)趨勢(shì)，各濃度組的相應(yīng)擴(kuò)增條帶的電泳相對(duì)亮度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（?P＜0．05，??P＜0．01）；采用 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，同樣發(fā)現(xiàn)PLD1和cyclin D1的蛋白表達(dá)下調(diào)且存在一定的劑量依賴(lài)性，各濃度組的相應(yīng)顯影條帶的相對(duì)灰度值比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（?P＜0．05，??P＜0．01，圖 4）．

圖4 TP抑制MDA-MB-231細(xì)胞PLD1和cyclin D1 mRNA及蛋白表達(dá)

3 討論

哺乳類(lèi)動(dòng)物PLD1和PLD2兩種亞型在不同組織和細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)水平及其在亞細(xì)胞分布和活性調(diào)節(jié)等方面均存在明顯差異．一般認(rèn)為，PLD1在蛋白激酶C和一些小分子GTP酶等有絲分裂原信號(hào)的刺激下可被直接激活，PLD1活化后亦可通過(guò)其水解產(chǎn)物磷脂酸激活 PLD2［1］．根據(jù)目前研究［3，8］報(bào)道，結(jié)合從Oncomine集合數(shù)據(jù)庫(kù)提取的PLD1 mRNA水平的變化與乳腺癌的關(guān)系，PLD1參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，但其在乳腺癌中的研究仍未獲得一致結(jié)論．

通常認(rèn)為，雌激素受體陰性的MDA-MB-231細(xì)胞能在裸鼠中形成低分化癌，而4T1是6-硫鳥(niǎo)嘌呤抗性細(xì)胞株，能在BALB／c小鼠中自發(fā)產(chǎn)生高轉(zhuǎn)移腫瘤，其生長(zhǎng)特性與人體晚期乳腺癌接近．本研究發(fā)現(xiàn)PLD1 mRNA及其蛋白在人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A中幾乎不表達(dá)，在人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中表達(dá)增加，而在人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231以及小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1中PLD1蛋白表達(dá)水平則更是高達(dá)MCF10A的20倍，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，PLD1表達(dá)增加與腫瘤細(xì)胞惡性程度呈正相關(guān)．對(duì)乳腺癌的病理特征研究也發(fā)現(xiàn)，基底樣腫瘤的標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白5／17高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞中，其PLD1呈現(xiàn)出異常高表達(dá)，而且臨床預(yù)后相對(duì)較差［8］．三陰型乳腺癌即雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體2均陰性表達(dá)的乳腺癌，是乳腺癌各亞型中預(yù)后極差的一類(lèi)．本研究中所檢測(cè)的三種乳腺癌細(xì)胞株中，MDA-MB-231屬于三陰型乳腺癌細(xì)胞株，其PLD1 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平亦最高．

研究［1，12］表明，PLD1 表達(dá)和活性增加會(huì)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞耐藥性，而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的一種重要途徑，PLD1提供促生存抗凋亡的機(jī)制之一是活化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白．由此推測(cè)，針對(duì)PLD1的抗腫瘤藥物應(yīng)該能減少耐藥性的形成．另外，MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)WNT7B（Wnt家族7B）癌基因．已知Wnt信號(hào)參與乳腺發(fā)育、與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而PLD1可通過(guò)正反饋調(diào)節(jié)Wnt／βcatenin信號(hào)通路［13-15］．因此，以 PLD為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)抗癌藥物具有廣泛的應(yīng)用前景［16］．本研究表明TP不僅可以從轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞PLD1 mRNA，也能抑制 PLD1 蛋白表達(dá)，這與 Kang等［10］的研究結(jié)果一致．cyclin D1是Wnt／β-catenin信號(hào)通路下游的最常見(jiàn)靶基因之一，在維持細(xì)胞增殖中起重要作用．本研究還發(fā)現(xiàn)TP可以同時(shí)在mRNA水平和蛋白水平下調(diào)cyclin D1表達(dá)量，提示TP抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制與Wnt／β-catenin信號(hào)通路有關(guān)．如果PLD1對(duì)Wnt信號(hào)通路在乳腺癌細(xì)胞中的活性影響及作用機(jī)制能夠得以進(jìn)一步闡明，將對(duì)以PLD1為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)抗癌藥物具有重要的指導(dǎo)作用．

綜上所述，本研究結(jié)果表明PLD1在惡性程度高的乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)增高，提示其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用．針對(duì)TP抗腫瘤作用機(jī)制的進(jìn)一步研究，有望為治療PLD1高表達(dá)乳腺癌的藥物研發(fā)提供重要依據(jù)．

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Expression of phospholipase D1 （PLD1）in breast cancer cells and the intervention of triptolide on PLD1

GU Qu-Liang， KUAI Yi-He， CHEN Jia-Yuan， LI Jiang-Chao，WANG Li-Jing
Vascular Biology Research Institute， School of Basic Sciences，Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China

AIM： To investigate the expression of phospholipase D1（PLD1） in different breast cancer cells and its role in the effects of traditional Chinese medicine triptolide（TP） on human breast cancer cells．METHODS： The expression levels of PLD1 mRNA and PLD1 protein in human breast epithelial cells and cancer cell lines were determined by RT-PCR and Western Blot．The effect of TP on cancer cell proliferation was examined by MTT assay in MDA-MB-231 cells．Meanwhile， PLD1 and cyclin D1 expression in triptolide-treated human breast cancer cells were also determined by RT-PCR and Western Blot．RESULTS：Expression levels of both PLD1 mRNA and protein were higher in breast cancer cells including MCF7，MDA-MB-231 and 4T1 than those of normal breast epithelial cell（MCF10A）， with expression level of PLD1 protein in MDA-MB-231 cell roughly 20 times that of MCF10A cells．Furthermore， expression of PLD1 and cyclin D1 reduced while MDA-MB-231 cell proliferation was inhibited by TP treatment．CONCLUSION： Higher expression of PLD1 in human MDA-MB-231 breast cancer cells is associated with its role in the development and progression of breast cancer．TP down-regulated PLD1 expression in the breast cancer cell line，which provides evidence for developing PLD1-targeted therapeutics for breast cancer with high expression of PLD1．

phospholipase D1； breast cancer cells； breast epithelial cells；triptolide

R737．9；R285

A

2095-6894（2017）11-27-04

2017-06-08；接受日期：2017-06-28

國(guó)家自然科學(xué)基金（31471290，81472336）

顧取良．博士，副教授．研究方向：腫瘤分子病理學(xué)．

E-mail：qlgu＠ gdpu．edu．cn

王麗京．博士，教授．研究方向：炎癥與腫瘤病理學(xué)．

E-mail：wanglijing＠ gdpu．edu．cn