枸杞總黃酮提取物對(duì)2型糖尿病大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

王 偉，尚 佳△，楚元奎

(1.巴彥淖爾市醫(yī)院,內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,銀川 750004)

·論著·基礎(chǔ)研究

枸杞總黃酮提取物對(duì)2型糖尿病大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

王 偉1，尚 佳1△，楚元奎2

(1.巴彥淖爾市醫(yī)院,內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,銀川 750004)

目的研究枸杞總黃酮提取物(TFLB)對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)建立的糖尿病(DM)大鼠損傷模型血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。方法采用STZ誘導(dǎo)建立DM大鼠損傷模型，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、DM模型組和TFLB干預(yù)組(60、90、120 mg/mL)。正常對(duì)照組及DM模型組大鼠每天每只予以等量生理鹽水灌胃，干預(yù)組大鼠以不同濃度TFLB灌胃4周。灌胃滿(mǎn)4周后，采用ELISA法測(cè)定大鼠血清血管性血友病因子(vWF)、可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白(sTM)、可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(sEPCR)變化情況，摘取胸主動(dòng)脈組織做HE染色，觀(guān)察TFLB對(duì)DM大鼠血管內(nèi)皮的保護(hù)作用。結(jié)果TFLB干預(yù)后，與DM模型組相比較，下調(diào)了血管內(nèi)皮功能相關(guān)因子vWF、sTM、sEPCR 的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05，Plt;0.01)；隨著TFLB劑量的升高，干預(yù)組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚程度明顯減輕,山巒樣突起逐漸減少，外膜未見(jiàn)明顯損傷，血管形態(tài)排列趨于規(guī)整。結(jié)論TFLB可以改善高血糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，調(diào)節(jié)血管損傷相關(guān)因子含量的改變，延緩DM并發(fā)癥的進(jìn)展程度，起到保護(hù)心血管系統(tǒng)作用。

枸杞總黃酮;糖尿病,2型;血管內(nèi)皮細(xì)胞

關(guān)于心腦血管高危案例發(fā)生率、致殘率、病死率的大量數(shù)據(jù)調(diào)查顯示,糖尿病(DM)在所有危險(xiǎn)因素中的占比較高[1]，DM患者如果長(zhǎng)時(shí)間血糖濃度控制不穩(wěn)定，血管內(nèi)皮細(xì)胞由于血糖濃度波動(dòng)較大，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生應(yīng)激應(yīng)機(jī)制[2]，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和逐步凋亡，若長(zhǎng)期處于較高應(yīng)激狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)通路和基因性狀發(fā)生突變，高血糖是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)生的首要危險(xiǎn)因素之一[3]。因此，研討怎樣調(diào)節(jié)和保護(hù)長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，對(duì)評(píng)估糖尿病及其并發(fā)癥進(jìn)程具有十分重要的意義。近年來(lái)黃酮類(lèi)化合物作為天然產(chǎn)物發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫功能、降血糖、降血脂、抗氧化等功能備受關(guān)注[4]。有關(guān)寧夏枸杞生物活性及指紋圖譜等大量研究表明，寧夏枸杞黃酮類(lèi)化合物生物活性較廣[5]，具有抗腫瘤、抗氧化、對(duì)抗自由基、抗慢性凋亡等多重重要藥理作用[6-7]。多年前，寧夏地區(qū)專(zhuān)家已經(jīng)證實(shí)了枸杞總黃酮在抗氧化方面的生物活性[8]，并正確運(yùn)用正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其最理想的分離提取方法?；谏鲜龀墒鞐l件，加強(qiáng)枸杞黃酮化合物在對(duì)抗細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷分子機(jī)制方面的研發(fā)，指導(dǎo)對(duì)心腦血管疾病的治療具有非常重要的啟發(fā)和補(bǔ)充。因此，本研究運(yùn)用鏈脲佐菌素(STZ)建立關(guān)于2型糖尿病大鼠的病理模型，研究枸杞總黃酮提取物(TFLB)對(duì)其血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1飼料與動(dòng)物 常規(guī)飼料：麩皮 20%；玉米粉30%；豆類(lèi)10%；酵母粉 2%；標(biāo)準(zhǔn)粉 25%；維生素、微量元素添加劑各0.5%；魚(yú)肝油1%；骨粉 10%；食用鹽 1%。Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠：80只，體質(zhì)量440～550 g，6周齡，許可證號(hào):SYXK(寧)2011-0001，由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供；

1.2試劑與儀器 枸杞總黃酮提取物(枸杞來(lái)源：寧夏農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，鑒定人：研究員陳淑華；總黃酮：濃度99.8 mg/mL)。鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司; 大鼠可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(sEPCR，批號(hào):JYM0566Ra)、大鼠可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白(sTM，批號(hào):JYM0936Ra)、大鼠血管性血友病因子(vWF，批號(hào):JYM0304Ra)，武漢基因美生物科技有限公司采購(gòu); HE 染色相關(guān)試劑：寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院提供。光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)；快速血糖儀(強(qiáng)生)及配套試紙條；酶標(biāo)儀(Me2tertech)；電子顯微鏡(日立H-600)；切片機(jī)(瑞典LKB-V)；蠟塊包埋機(jī)、切割機(jī)(德國(guó)Leica)。

1.3方法

1.3.12型糖尿病大鼠模型建立 常規(guī)飼養(yǎng)達(dá)標(biāo)后，隨機(jī)選擇10只大鼠作為正常對(duì)照組，其余70只大鼠進(jìn)行造模，隔夜禁食不禁水12 h以上，一次性腹腔皮下注射60 mg/kg STZ;正常對(duì)照組大鼠在皮下(腹腔)注射同體積枸櫞酸鹽緩沖液。觀(guān)察72 h后，于大鼠尾靜脈處穿刺采血，用快速血糖儀測(cè)定空腹血糖值，葡萄糖(GLU)gt;11.1 mmol/L為DM大鼠造模成功標(biāo)準(zhǔn) 。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組及TFLB干預(yù)階段 將成模DM大鼠分成4組：DM模型組、TFLB干預(yù)組(低、中、高)。對(duì)照組和DM模型組大鼠每天采用等體積的生理鹽水來(lái)灌胃；TFLB干預(yù)組(低、中、高)大鼠每天分別以 60、90、120 mg/kg總黃酮進(jìn)行灌胃干預(yù)，干預(yù)實(shí)驗(yàn)周期為4周。

1.3.3血清因子水平檢測(cè) 藥物干預(yù)滿(mǎn)4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，隔夜將大鼠禁食不禁水12 h，之后給予50 mg/kg苯巴比妥腹腔麻醉，自腹部剪開(kāi)皮膚于大鼠腹主動(dòng)脈分叉處向心端1～3 mm處穿刺取血，以酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)血清中vWF、sTM、sEPCR 因子水平。

1.3.4制作主動(dòng)脈HE染色切片 摘取各實(shí)驗(yàn)組大鼠胸主動(dòng)脈，放置于固定液濃度為10%的甲醛中浸泡，在常溫條件下短期保存，為HE染色病理切片做好相關(guān)準(zhǔn)備。

2 結(jié) 果

2.12型糖尿病大鼠模型的成功建立及灌胃飼養(yǎng)情況 常規(guī)飼養(yǎng)達(dá)標(biāo)后腹腔注射STZ,3 d后大鼠均出現(xiàn)多食、多飲、多尿癥狀，且伴隨精神狀態(tài)萎靡不振、動(dòng)作反應(yīng)緩慢遲鈍、體型消瘦，毛發(fā)枯黃、不潔、干澀等狀態(tài)。模型組與正常對(duì)照組大鼠空腹GLU測(cè)定值相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)，在尾靜脈處穿刺取血測(cè)得67只大鼠空腹GLU水平均大于11.1 mmol/L，其中血糖水平最低為15.8 mmol/L，最高達(dá)20.1 mmol/L，造模成功,達(dá)到2型糖尿病造模標(biāo)準(zhǔn);造模過(guò)程沒(méi)有大鼠死亡，有3只血糖水平測(cè)定值小于11.1 mmol/L，未成模，棄之不用。在實(shí)驗(yàn)階段正常對(duì)照組大鼠死亡2只，DM模型組大鼠死亡19只。

2.2TFLB 對(duì) DM模型組大鼠GLU水平的調(diào)控及影響 DM模型組大鼠灌胃前、中、后GLU與正常對(duì)照組相比升高(Plt;0.01); TFLB高劑量組灌胃后GLU水平與DM模型組相比有一定意義的下降，提示在特定濃度下其對(duì)控制血糖水平有一定的效果(Plt;0.05)；低、中劑量組大鼠GLU水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，見(jiàn)表1。

2.3TFLB對(duì)DM大鼠sTM、sEPCR、 vWF檢測(cè)水平的影響 與正常對(duì)照組相比較，DM模型組sTM、sEPCR、vWF因子的生成量明顯上調(diào)(Plt;0.01)。其中TFLB低劑量組sTM、vWF水平與DM模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，而sEPCR檢測(cè)水平較DM模型組相比較下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；TFLB高、中劑量組sTM、sEPCR、vWF因子檢測(cè)水平與DM模型組相比均下調(diào)(Plt;0.01)，見(jiàn)表2。

2.4TFLB干預(yù)后各實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈做HE染色后的橫切面圖 各組HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組大鼠，其主動(dòng)脈壁內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)分布規(guī)則；外膜整潔光滑未見(jiàn)明顯異常；中層平滑肌細(xì)胞排列整齊、緊密、形態(tài)大小分布一致；血管內(nèi)皮細(xì)胞分布均勻，光滑連續(xù)；DM模型組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜可見(jiàn)有明顯損傷突起，增厚顯著并出現(xiàn)粥樣硬化病變；內(nèi)膜下間隙明顯增大、彈性纖維形態(tài)增粗且排列順序散亂,散在區(qū)域可見(jiàn)泡沫細(xì)胞，部分區(qū)域可見(jiàn)斑塊；TFLB低、中劑量組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜仍見(jiàn)明顯突起且明顯增厚,外膜損傷程度有所減輕，血管內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)明顯增生,排列尚不規(guī)整,偶見(jiàn)散在泡沫細(xì)胞；TFLB高劑量組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜可見(jiàn)輕度增厚,血管內(nèi)皮細(xì)胞增生相對(duì)輕度、排列相對(duì)趨于規(guī)整，鏡下外膜未見(jiàn)顯著損傷。

表1 各組大鼠GLU水平比較

a：Plt;0.05，與正常對(duì)照組比較；b：Plt;0.05，與DM模型組比較

表2 各組大鼠血清sTM、sEPCR、vWF水平比較

a：Plt;0.05，與正常對(duì)照組比較；b：Plt;0.05與DM模型組比較

A：正常對(duì)照組；B：DM模型組；C：TFLB低劑量組；D：TFLB中劑量組；E：TFLB高劑量組

圖1各組主動(dòng)脈HE染色橫切面圖(HE×100)

3 討 論

大量研究表明，DM并發(fā)癥累及器官較多，其中心腦血管病變是其早期主要并發(fā)癥之一[9]，且損傷程度相對(duì)較為顯著。血管內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌、合成多種細(xì)胞因子，具有吞噬異物、細(xì)菌、壞死和衰老組織的功能，同時(shí)還可以參與集體免疫活動(dòng)及調(diào)節(jié)保護(hù)血管活性物質(zhì)，在護(hù)保血管通透性起到十分重要的作用，是保證和維護(hù)血管功能正常的一道天然屏障。血糖控制不理想，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，內(nèi)皮細(xì)胞膜被大量自由基氧化損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞膜調(diào)節(jié)水平下降、功能異常、紊亂[10]，進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體大血管和微血管方面的病變[11]，引起全身多系統(tǒng)的代謝障礙，嚴(yán)重影響了糖尿病患者的生活質(zhì)量。目前體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：sTM、sEPCR、vWF合成及分泌水平均與血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀態(tài)直接相關(guān)，以上3個(gè)因子水平的調(diào)節(jié)變化，可以間接地反映血管內(nèi)皮細(xì)胞在外因誘導(dǎo)應(yīng)激狀態(tài)下?lián)p傷的不同程度。sMT是存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的一種糖蛋白，當(dāng)不同外界因素誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)激損傷時(shí)其合成量增多[12]；當(dāng)損傷累及病變程度較重，大血管損傷的標(biāo)志因子sEPCR合成量也顯著增加[13]，與此同時(shí)鑒定內(nèi)皮細(xì)胞受損程度特異性標(biāo)志因子vWF隨損傷程度的不同相對(duì)升高[14]。因此研討怎樣保護(hù)和調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，對(duì)指導(dǎo)和治療心腦血管疾病有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。當(dāng)前對(duì)于能夠保護(hù)心腦血管功能，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞慢性凋亡藥物的研發(fā)已成為心腦血管疾病靶向治療的熱點(diǎn)[15]。

因此本實(shí)驗(yàn)以TFLB為研究對(duì)象，結(jié)合STZ誘導(dǎo)建立DM大鼠損傷模型。結(jié)果提示TFLB對(duì)DM大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一定程度保護(hù)功效，對(duì)DM并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展起到積極的預(yù)防保護(hù)作用；但總黃酮的成分很多，需后續(xù)進(jìn)一步作深入的研究證實(shí)，為研究新型治療糖尿病疾病中藥材提供理論依據(jù)。

[1]郝彥峰，鄭冬凌．2型糖尿病對(duì)心血管疾病的影響[J]．中國(guó)社區(qū)醫(yī)師(醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè))，2011，13(22)：74．

[2]姜慧芳，李向榮，陳曉樂(lè),等.紫心甘薯總黃酮對(duì)糖尿病大鼠血糖及氧化應(yīng)激的影響[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2011，46(20)：1570-1573．

[3]鮑曉梅，陸國(guó)平．高同型半胱氨酸血癥致血管內(nèi)皮損傷與早期動(dòng)脈粥樣硬化[J]．醫(yī)學(xué)綜述，2009，15(2)：191-193．

[4]廖國(guó)玲，王偉．反相高效液相色譜法測(cè)定枸杞活性成分[J]．醫(yī)學(xué)信息，2013，26(2)：68．

[5]張自萍，廖國(guó)玲，李弘武．寧夏枸杞黃酮類(lèi)化合物HPLC指紋圖譜研究[J]．中草藥，2008，39(1)：103-105．

[6]王輝，田呈瑞，馬守磊，等．綠原酸的研究進(jìn)展[J]．食品工業(yè)科技，2009，30(5)：341-345．

[7]廖國(guó)玲,楊鳳琴,王偉.枸杞總黃酮對(duì)H2O2損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014，20(24)：139-142．

[8]黃文波．寧夏枸杞總黃酮的提取、純化及其抗氧化活性研究[D]．銀川：寧夏大學(xué)，2006．

[9]史愛(ài)梅.心血管疾病的危險(xiǎn)因素分析[J].當(dāng)代醫(yī)藥論叢,2014,12(8)：251-252．

[10]任蓓，潘澄，林鵬，等．高糖誘發(fā)氧化應(yīng)激導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡機(jī)制研究[J]．海峽藥學(xué)，2013，25(6)：268-271．

[11]李羚.2型糖尿病血管并發(fā)癥流行情況及早發(fā)糖尿病血管并發(fā)癥患病風(fēng)險(xiǎn)研究[D].天津醫(yī)科大學(xué),2015.

[12]廖國(guó)玲,楊華,楊鳳琴,等.Ⅱ型糖尿病患者血漿sEPCR、 sTM、vWF變化的研究[J].中國(guó)輸血雜志,2013,26(6)：553-555．

[13]張子彥，張敏，柳惠榮．2型糖尿病患者血漿可溶性?xún)?nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體和凝血酶激活的纖溶抑制物的變化及意義[J]．蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，30(1)：178-179．

[14]Azou B,Femandez P,Bareille R,et al.In vitro endothelial cell susceptibility to xenobiotics:comparison of three cell types[J].Cell Biol Toxicol,2005,21(2):127-137.

[15]程寧.多靶點(diǎn)黃酮衍生物的合成及抗糖尿病血管并發(fā)癥研究[D].湘潭：湘潭大學(xué),2014.

Protectiveeffectoftotalflavonoidsoflyciumbarbarumonvascularendothelialcellsintype2diabeticrats*

WangWei1,ShangJia1△,ChuYuankui2

(1.BayannurHospital,Bayannur,InnerMongolia015000,China;2.SchoolofLaboratoryMedicine,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China)

ObjectiveTo study the protective effect of total flavonoids of lycium barbarum(TFLB) on vascular endothelial cells in streptozotocin(STZ)-induced diabetic mellitus(DM) rats injury model.MethodsThe injury model of DM rats was induced by STZ,and the rats were divided into normal control group,DM model group and TFLB intervention group(60,90 and 120 mg/mL).Rats in the normal control group and the DM model group were given the same amount of intragastric administration of normal saline every day.The rats in the intervention group were treated with TFLB at different concentrations for 4 weeks.After filling the stomach for 4 weeks,the blood samples were taken from the chest cavity,and the changes of serum vWF,sTM and sEPCR were measured by ELISA.The tissue of the thoracic aorta was removed and stained by HE,and the protective effect of TFLB on the vascular endothelium in DM rats was observed.ResultsCompared with DM model group,the levels of vascular endothelial function related factors vWF,sTM and sEPCR were down-regulated in the TFLB intervention group,and the difference was statistically significant(Plt;0.05,Plt;0.01).In the TFLB intervention group,with the increase of TFLB dose,the intima thickening degree of the rats was significantly reduced; the formation of mountain-like protrusions was gradually decreased; the outer membrane showed no significant damage; the vascular morphology arrangement tended to be regular.ConclusionTFLB can improve the hyperglycemia-caused damage of vascular endothelial cells,regulate the content of vascular injury related factors,delay the progression of DM complications,and protect the cardiovascular system.

total flavonoids from lycium barbarum;diabetes,type 2;vascular endothelial cell

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.005

寧夏自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NZ11116);氯化鋰對(duì)小鼠糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化防治作用的初步研究(XM2011008)。

王偉(1983-)，主管技師，碩士，主要從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)的研究?！?/p>

,E-mail：185362514@qq.com。

R285.5

A

1671-8348(2017)32-4481-03

2017-04-23

2017-06-27)