吉非替尼對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育及腫瘤耐藥基因表達(dá)的影響

胡榮英，舒莉萍△，何志旭，孫琮杰，李志操，金 璐

(貴州醫(yī)科大學(xué)： 1.免疫學(xué)教研室；2.組織工程與干細(xì)胞中心；3.兒科學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550004)

·論著·

吉非替尼對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育及腫瘤耐藥基因表達(dá)的影響

胡榮英1,2，舒莉萍1,2△，何志旭2,3▲，孫琮杰1，李志操3，金 璐3

(貴州醫(yī)科大學(xué)： 1.免疫學(xué)教研室；2.組織工程與干細(xì)胞中心；3.兒科學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550004)

目的研究吉非替尼對(duì)斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育及abcb4腫瘤耐藥基因表達(dá)的影響。方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用斑馬魚(yú)，實(shí)驗(yàn)分為吉非替尼組、阿霉素和吉非替尼的混合液組、空白對(duì)照組。將吉非替尼稀釋成不同濃度梯度的藥液,分別處理受精后0.5～1.5 h(0.5～1.5 hpf)的斑馬魚(yú)胚胎，觀察胚胎和幼魚(yú)的死亡率、孵化率及畸形率變化。統(tǒng)計(jì)各濃度不同時(shí)間點(diǎn)的胚胎死亡率，計(jì)算出 IC50的數(shù)值；統(tǒng)計(jì)48 hpf和72 hpf的胚胎孵化率及120 hpf的畸形率；收集不同組別的斑馬魚(yú)胚胎，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)斑馬魚(yú)胚胎中abcb4基因的表達(dá)量。結(jié)果計(jì)算出吉非替尼在斑馬魚(yú)胚胎中的IC50為16.18 μmol/L。與對(duì)照組比較，高劑量吉非替尼(≥20 μmol/L)顯著抑制胚胎的孵化，并有明顯的胚胎致死效應(yīng)和致畸效應(yīng)；吉非替尼組的斑馬魚(yú)胚胎abcb4基因的mRNA水平變化不顯著，而阿霉素和吉非替尼的混合液組的abcb4基因的mRNA水平有明顯變化(Plt;0.05)。結(jié)論吉非替尼對(duì)斑馬魚(yú)早期胚胎中abcb4腫瘤耐藥基因的表達(dá)水平無(wú)明顯影響(Pgt;0.05)，但是吉非替尼能逆轉(zhuǎn)易耐藥藥物阿霉素的耐藥作用，提示使用斑馬魚(yú)可以構(gòu)建腫瘤耐藥模型。

斑馬魚(yú)；吉非替尼；發(fā)育毒性；abcb4；抗藥性，多藥

腫瘤已成為疾病死因之首，發(fā)病率和病死率逐年攀升，因此腫瘤已成為非常重要的公共健康問(wèn)題。目前，化療是腫瘤治療的主要方法，而抗腫瘤藥物的耐藥性是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤耐藥和ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette,abc)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族所介導(dǎo)的細(xì)胞藥物外排作用密切相關(guān)[1-2]。abc轉(zhuǎn)運(yùn)體主要是將細(xì)胞內(nèi)的藥物外排到細(xì)胞外，減少作用靶點(diǎn)的藥物濃度，從而產(chǎn)生耐藥性。abcb1是abc轉(zhuǎn)運(yùn)體亞家族abcb的成員之一，高表達(dá)于大部分腫瘤耐藥細(xì)胞中[3-5]。對(duì)于abcb1基因的研究，目前主要在鼠類(lèi)及耐藥細(xì)胞株中進(jìn)行[6-7]，還少有關(guān)于用斑馬魚(yú)研究abcb1基因的相關(guān)報(bào)道，尤為重要的是目前還沒(méi)有很好的腫瘤耐藥篩選斑馬魚(yú)模型。本研究以斑馬魚(yú)為模型生物，將斑馬魚(yú)發(fā)育早期的胚胎用抗腫瘤藥物,表皮生長(zhǎng)因子受體絡(luò)氨酸激酶抑制劑吉非替尼(gefitinib)進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)斑馬魚(yú)abcb4基因在藥物暴露下的表達(dá)情況。為評(píng)價(jià)斑馬魚(yú)的abcb4基因在耐藥機(jī)制中的研究提供科學(xué)依據(jù)，也為在斑馬魚(yú)模型中進(jìn)行抗腫瘤藥物篩選打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 斑馬魚(yú)由本實(shí)驗(yàn)室所飼養(yǎng)的Tubingen品系，養(yǎng)殖方法參考zebrafish book。每日光照12 h，黑暗12 h，28 ℃左右條件下雌雄魚(yú)分缸飼養(yǎng)。采卵時(shí)取健康性成熟的斑馬魚(yú)按1∶1或1∶2的雌雄比例放入交配缸內(nèi)，在燈照0.5 h后收集胚胎。收集的胚胎進(jìn)行消毒和洗滌后移入裝有胚胎培養(yǎng)用水的一次性平皿中，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。定時(shí)更換胚胎培養(yǎng)用水并吸出死胚胎，防止影響胚胎正常發(fā)育。

1.2主要儀器及試劑 儀器：體視顯微鏡(日本Nikon公司)；生化培養(yǎng)箱(中國(guó)科邁公司)；Bio-Rad CFX96TM Real-Time Systeam儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；T100TMBio-Rad PCR。試劑：吉非替尼(美國(guó)Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑First Strand cDNA Synthesis Kit(芬蘭Thermo公司)；IQTMSYBR Green Supermix試劑(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1吉非替尼溶液的配制及暴露方法 吉非替尼用含2‰的二甲基亞砜的雙蒸水配置成100 μmol/L的母液，分裝，避光保存于冰箱4 ℃?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前，用胚胎培養(yǎng)，用水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)渲萍翘婺嶙罱K濃度為0～40 μmol/L的實(shí)驗(yàn)溶液，設(shè)置胚胎培養(yǎng)液為對(duì)照組。待胚胎發(fā)育到0.5～1.5 hpf，挑選出健康的胚胎于6孔板中進(jìn)行暴露，每孔20枚胚胎，加5 mL溶液，置于28℃恒溫光照培養(yǎng)箱中以12 h∶12 h光周期培養(yǎng)，每天換液3次，觀察并記錄胚胎的發(fā)育，死亡、孵化和畸形等情況。

1.3.2藥物暴露劑量與毒性分析 根據(jù)吉非替尼濃度分為0 μmol/L(對(duì)照組)、1 μmol/L組、5 μmol/L組、10 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組，吉非替尼分別作用于受精后0.5～1.5 h(hours post-fertilization，hpf)的胚胎，統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)濃度下24、48、72、96、120 hpf，5個(gè)時(shí)相胚胎的死亡率、孵化率和畸形率，繪制致死率、孵化率和畸形率的曲線圖，求出半數(shù)抑制濃度。實(shí)驗(yàn)每組100枚胚胎，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。本實(shí)驗(yàn)采用吉非替尼在斑馬魚(yú)胚胎上的半數(shù)抑制濃度IC50=16.18 μmol/L為吉非替尼組的暴露濃度；阿霉素的暴露濃度選擇10 μmol/L[8]，另一實(shí)驗(yàn)組為吉非替尼和阿霉素的混合液。阿霉素在斑馬魚(yú)上的毒性篩選，本課題組前期已經(jīng)完成[8]。

1.3.3abcb4基因mRNA測(cè)定 根據(jù)各時(shí)間點(diǎn)斑馬魚(yú)胚胎的死亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到吉非替尼的半數(shù)抑制濃度IC50，以此藥物濃度暴露下的胚胎為實(shí)驗(yàn)組；對(duì)照組為胚胎培養(yǎng)液處理組。收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組24、48、72、96、120 hpf 5個(gè)時(shí)相的斑馬魚(yú)胚胎各100枚，置于離心管中。加入TRIzol液，吹碎混勻,經(jīng)氯仿、異丙醇、75%乙醇洗滌、晾干，加入適量DEPC水溶解。將所提RNA用First Strand cDNA Synthesis Kit試劑反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用BIO-RAD CFX96TMReal-Time Systeam儀按照IQTMSYBR Green Supermix試劑反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃,10 min；95 ℃,15 s；58.3 ℃,20 s；72 ℃,20 s；40個(gè)循環(huán)。abcb4引物由課題組前期合成，基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct值進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1吉非替尼對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的致死毒性效應(yīng) 觀察斑馬魚(yú)胚胎及幼魚(yú)的存活情況，與對(duì)照組相比，隨著藥物濃度的增高，胚胎死亡率逐漸增加。對(duì)照組、1 μmol/L組、5 μmol/L組和10 μmol/L組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的死亡率相差不大。但是20 μmol/L組和40 μmol/L組胚胎死亡率逐漸升高，至120 hpf，40 μmol/L組死亡率達(dá)到90.83%。根據(jù)各時(shí)間點(diǎn)的死亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到吉非替尼的半數(shù)抑制濃度IC50=16.18 μmol/L。各濃度下不同時(shí)間點(diǎn)胚胎的死亡率比較，見(jiàn)圖1。

圖1 暴露于不同濃度吉非替尼的斑馬魚(yú)胚胎及幼魚(yú)死亡率

2.2吉非替尼對(duì)斑馬魚(yú)孵化率的影響 48 hpf時(shí)，與對(duì)照組相比，5 μmol/L組孵化率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10、20、40 μmol/L組孵化率均顯著降低；72 hpf時(shí)，10 μmol/L給藥組孵化率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，20、40 μmol/L組孵化率均顯著降低，尤其是40 μmol/L組孵化率為33%，見(jiàn)圖2。

A：48 hpf孵化率；B：72 hpf孵化率

圖2暴露于不同濃度吉非替尼的斑馬魚(yú)胚胎孵化率

2.3吉非替尼對(duì)斑馬魚(yú)發(fā)育畸形的影響 斑馬魚(yú)胚胎在36～72 hpf孵化，高濃度藥物對(duì)胚胎的孵化有抑制作用。為了便于觀察和統(tǒng)計(jì)，選擇120 hpf各實(shí)驗(yàn)組，對(duì)幼魚(yú)的畸形率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。隨著藥物濃度的增加，幼魚(yú)的畸形率逐漸升高。當(dāng)藥物濃度為20 μmol/L時(shí)，幼魚(yú)的畸形率為53.47%；而40 μmol/L時(shí)，幼魚(yú)的畸形率高達(dá)100%，見(jiàn)圖3。

圖3 暴露于不同濃度吉非替尼的斑馬魚(yú)幼魚(yú)畸形率

2.4吉非替尼對(duì)斑馬魚(yú)胚胎abcb4基因mRNA的影響 吉非替尼組和對(duì)照組從72 hpf開(kāi)始，abcb4基因mRNA水平開(kāi)始隨胚胎時(shí)相的增加而升高，相同時(shí)相吉非替尼實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)胚胎abcb4基因mRNA的水平均與對(duì)照組無(wú)顯著變化(Pgt;0.05),見(jiàn)表1、圖4。但是當(dāng)該濃度下的吉非替尼和臨床常用的易引起耐藥的抗腫瘤藥物阿霉素的混合液，在72、96、120 hpf這3個(gè)時(shí)相，相同時(shí)間點(diǎn)阿霉素和吉非替尼的混合液組斑馬魚(yú)胚胎abcb4基因mRNA的水平均較阿霉素組明顯降低。72 hpf阿霉素和吉非替尼的混合液組與阿霉素組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012 0)；96 hpf阿霉素和吉非替尼的混合液組與阿霉素組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041 6)；120 hpf阿霉素和吉非替尼的混合液組與阿霉素組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006 9)，見(jiàn)表2、圖5。

圖4 不同時(shí)相的斑馬魚(yú)胚胎abcb4基因的mRNA表達(dá)變化

組別24hpf48hpf72hpf96hpf120hpf對(duì)照組0.0013±0.00060.0840±0.01711.3549±0.23514.4264±1.009817.6398±0.9209吉非替尼0.0040±0.00290.1635±0.02021.4148±0.59664.8548±0.599718.1796±0.8846

表2 不同藥物各時(shí)相的斑馬魚(yú)胚胎abcb4基因的mRNA水平變化

a:Plt;0.05,b:Plt;0.01，與阿霉素組比較

圖5不同時(shí)相的斑馬魚(yú)胚胎abcb4基因的mRNA表達(dá)變化

3 討 論

吉非替尼屬于小分子表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)絡(luò)氨酸激酶抑制劑，通過(guò)與三磷酸腺苷競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，可抑制EGFR自磷酸化作用，抑制細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期。目前吉非替尼廣泛應(yīng)用于晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)治療的分子靶向藥物[9-10]。

研究發(fā)現(xiàn)吉非替尼能明顯逆轉(zhuǎn)紫杉醇在過(guò)表達(dá)abcb1的細(xì)胞株中的耐藥性，并增加紫杉醇在過(guò)表達(dá)abcb1的細(xì)胞株中的藥物濃度。由于吉非替尼對(duì)abcb1轉(zhuǎn)運(yùn)功能有抑制作，使藥物外排作用減少，提高細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度[11]。吉非替尼在細(xì)胞上的毒性研究及對(duì)部分易引起耐藥的抗腫瘤藥物的逆轉(zhuǎn)耐藥作用有報(bào)道，但是吉非替尼在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育的毒性研究。對(duì)斑馬魚(yú)abcb4耐藥基因表達(dá)的影響；對(duì)易引起耐藥的抗腫瘤藥物阿霉素的耐藥性影響少見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

目前研究提示，abcb1基因與腫瘤耐藥關(guān)系密切，但其耐藥的詳細(xì)分子機(jī)制及以此為基礎(chǔ)篩選新的腫瘤藥物的研究模型還比較局限。目前耐藥性的研究主要使用小鼠及耐藥細(xì)胞株開(kāi)展相關(guān)工作。由于小鼠生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、使用成本高、基因操作技術(shù)制備模型動(dòng)物的手段較復(fù)雜，使用有一定局限性；耐藥細(xì)胞株雖然操作簡(jiǎn)便，但是不能反映機(jī)體整體情況。而斑馬魚(yú)具有胚胎體積小、周期短、胚胎透明、易觀察和技術(shù)操作容易等優(yōu)點(diǎn)，故在胚胎發(fā)育毒性研究、藥物篩選和新藥開(kāi)發(fā)中被廣泛應(yīng)用，可作為藥物臨床前安全評(píng)估的重要體內(nèi)模型[12-13]。

本課題組前期通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)abcb4基因與人類(lèi)耐藥相關(guān)基因abcb1的氨基酸序列相似度為64%[8]。有研究報(bào)道，斑馬魚(yú)abcb4基因與細(xì)胞內(nèi)藥物吸收與積累量的變化情況有關(guān)[14-16]，但是關(guān)于abcb4基因在斑馬魚(yú)上具體耐藥機(jī)制和有關(guān)的腫瘤耐藥模型少見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究對(duì)斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行抗腫瘤藥物吉非替尼暴露后，急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明吉非替尼對(duì)斑馬魚(yú)有明顯的發(fā)育毒性，能導(dǎo)致斑馬魚(yú)發(fā)育遲緩和畸變。與對(duì)照組相比，低劑量吉非替尼對(duì)斑馬魚(yú)胚胎無(wú)發(fā)育毒性，高劑量吉非替尼顯著抑制胚胎孵化率，并有明顯的胚胎致死率和畸形效應(yīng)。斑馬魚(yú)死亡率和畸形率均隨給藥劑量的增加和給藥時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。通過(guò)死亡率計(jì)算出吉非替尼在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育早期中的IC50=(16.18±0.56)μmol/L。選用該藥物濃度為最大無(wú)毒性效應(yīng)濃度對(duì)各時(shí)相的斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行暴露，并收集胚胎。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)斑馬魚(yú)中abcb4基因的表達(dá)情況。本研究顯示，吉非替尼暴露后的斑馬魚(yú)胚胎abcb4基因mRNA水平與對(duì)照組相比，表達(dá)無(wú)顯著差異；而阿霉素和吉非替尼的混合液與阿霉素單獨(dú)暴露后的斑馬魚(yú)胚胎abcb4基因mRNA水平差異顯著，混合液組明顯降低了斑馬魚(yú)胚胎abcb4基因mRNA水平。

綜上所述，本研究證實(shí)了吉非替尼對(duì)斑馬魚(yú)abcb4基因表達(dá)水平無(wú)明顯變化，對(duì)易引起耐藥的抗腫瘤藥物阿霉素有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。說(shuō)明斑馬魚(yú)中的腫瘤藥物耐藥性與abcb4基因有關(guān)，而人類(lèi)該耐藥機(jī)制主要是由abcb1基因發(fā)揮作用，故本實(shí)驗(yàn)證實(shí)斑馬魚(yú)abcb4基因與人的abcb1基因具有較高的同源性，且斑馬魚(yú)的abcb4基因表達(dá)水平的變化和同源基因在人細(xì)胞上研究一致。介于人類(lèi)耐藥相關(guān)基因abcb1在腫瘤多藥耐藥中的重要性，由此推測(cè)斑馬魚(yú)中abcb4基因表達(dá)變化與多藥耐藥相關(guān)聯(lián)。因此，本文通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)abcb4基因的研究，為多藥耐藥轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型建立以及抗腫瘤藥物在斑馬魚(yú)模型進(jìn)行多藥耐藥性篩選奠定了重要實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。因此，可以選擇abcb4為靶基因進(jìn)行操作，建立斑馬魚(yú)腫瘤多藥耐藥模型開(kāi)展相關(guān)研究工作。另外，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)吉非替尼不僅不易引起耐藥，反而對(duì)易引起耐藥的藥物有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，因此在以后的臨床用藥中，可以考慮用吉非替尼和易耐藥的抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用于相關(guān)的臨床治療，這樣可以提高治療效果。同時(shí)，用斑馬魚(yú)構(gòu)建腫瘤多藥耐藥模型，為以后新藥臨床前的耐藥性篩選及臨床用藥中藥物耐藥性的評(píng)價(jià)提供篩藥模型。提示臨床用藥時(shí)，對(duì)于易耐藥的藥物采用像吉非替尼這樣逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物聯(lián)合運(yùn)用，提高臨床療效。

由于抗腫瘤藥物種類(lèi)繁多，且發(fā)生機(jī)制復(fù)雜。除吉非替尼、吉非替尼和阿霉素的混合液外，還需要選用更多不易耐藥的抗腫瘤藥物及吉非替尼和更多的易耐藥的藥物聯(lián)合運(yùn)用進(jìn)行驗(yàn)證，從而檢測(cè)耐藥相關(guān)的基因、蛋白和相關(guān)的信號(hào)通路，以期進(jìn)一步了解abcb4基因在斑馬魚(yú)多藥耐藥中的相關(guān)影響。

[1]Locher KP.Mechanistic diversity in ATP-binding cassette(ABC) transporters[J].Nat Struct Mol Biol,2016,23(6):487-493.

[2]Chen Z,Shi T,Zhang L,et al.Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette(ABC) family in multidrug resistance:a review of the past decade[J].Cancer Lett,2016,370(1):153-164.

[3]Fletcher JI,Haber M,Henderson MJ,et al.ABC transporters in cancer:more than just drug efflux pumps[J].Nat Rev Cancer,2010,10(2):147-156.

[4]Holland IB.ABC transporters,mechanisms and biology:an overview[J].Essays Biochem,2011,50(1):1-17.

[5]Juliano RL,Ling V.A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants[J].Biochim Biophys Acta,1976,455(1):152-162.

[6]Fletcher JI,Williams RT,Henderson MJ,et al.ABC transporters as mediators of drug resistance and contributors to cancer cell biology[J].Drug Resist Updat,2016,26:1-9.

[7]Schumacher T,Krohn M,Hofrichter J,et al.ABC transporters B1,C1 and G2 differentially regulate neuroregeneration in mice[J].PloS one,2012,7(4):e35613.

[8]孫琮杰,何志旭,舒莉萍,等.阿霉素對(duì)模式生物斑馬魚(yú)中 abcb4 基因表達(dá)的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016,47(1):7-13.

[9]Hirose T,Fujita K,Kusumoto S,et al.Association of pharmacokinetics and pharmacogenomics with safety and efficacy of gefitinib in patients with EGFR mutation positive advanced non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2016,93:69-76.

[10]Leggas M,Panetta JC,Zhuang Y,et al.Gefitinib modulates the function of multiple ATP-binding cassette transporters in vivo[J].Cancer Res,2006,66(9):4802-4807.

[11]Kathawala RJ,Gupta P,Ashby CR,et al.The modulation of ABC transporter-mediated multidrug resistance in cancer:A review of the past decade[J].Drug Resist Updat,2015,18:1-17.

[12]Lieschke GJ,Currie PD.Animal models of human disease:zebrafish swim into view[J].Nat Rev Genet,2007,8(5):353-367.

[13]MacRae CA,Peterson RT.Zebrafish as tools for drug discovery[J].Nat Rev Drug Discov,2015,14(10):721-731.

[14]Fischer S,Klüver N,Burkhardt-Medicke K,et al.Abcb4 acts as multixenobiotic transporter and active barrier against chemical uptake in zebrafish(Danio rerio) embryos[J].BMC Biol,2013,11(1):1-16

[15]Kiehl S,Herkt SC,Richter AM,et al.ABCB4 is frequently epigenetically silenced in human cancers and inhibits tumor growth[J].Sci Rep,2014,4:6899.

[16]Lu X,Long Y,Sun R,et al.Zebrafish Abcb4 is a potential efflux transporter of microcystin-LR[J].Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol,2015,167:35-42.

Effectsofgefitinibonembryonicdevelopmentandexpressionoftumorresistancegenesinzebrafish*

HuRongying1,2,ShuLiping1,2△,HeZhixu2,3▲,SunCongjie1,LiZhicao3,JinLu3

(1.DepartmentofImmunology;2.CenterforTissueEngineeringandCellResearch;3.DepartmentofPediatrics,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

ObjectiveTo investigate the effects of gefitinib on early embryonic development and expression of abcb4 tumor resistance genes in zebrafish.MethodsZebrafish were adopted as experimental animals and divided into gefitinib group,mixture of doxorubicin and gefitinib group and blank group.Zebrafish embryos of 0.5-1.5 hours after fertilization(0.5-1.5 hpf) were exposed to different concentrations of gefitinib,and then embryo development of zebrafish in 24-120 hpf was observed and the number of death,hatch and malformation was recorded.The embryo mortality was calculated under different concentrations of gefitinib at different time points,and the numerical value of IC50was calculated;Hatching rates of zebrafish embryo in 48 hpf and 72 hpf and malformation rates of zebrafish embryo in 120 hpf were calculated.The zebrafish embryos exposed to different concentrations of gefitinib in different groups were collected,and the expression of abcb4 gene in zebrafish embryos was detected by real-time quantitative PCR.ResultsGefitinib IC50in zebrafish embryos was 16.18 μmol/L.Compared with the control group,higher dosage(20 μmol/L) of gefitinib in other two groups significantly decreased hatching rates of embryos,and had obvious embryonic lethal effects and teratogenic effects.Moreover,the mRNA levels of the abcb4 gene in the zebrafish embryos of gefitinib group were not significantly changed,whereas the mRNA levels of the abcb4 gene in mixture of doxorubicin and gefitinib group were significantly different(Plt;0.05).ConclusionGefitinib has no significant effects on the expression of abcb4 tumor resistance gene in early development of zebrafish embryos(Pgt;0.05),but it can reverse the drug resistant effects of doxorubicin,suggesting that zebrafish can construct tumor resistance model.

zebrafish;gefitinib;developmental toxicity;abcb4;drug resistance,multiple

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31460312)；貴州省重大應(yīng)用基礎(chǔ)專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目資助[(2015)2003]。

胡榮英(1990-)，在讀碩士，主要從事發(fā)育生物學(xué)的研究。△

，E-mail:gyslp456@gmc.edu.cn。▲共同通信作者，E-mail:hzx@gmc.edu.cn。

R965.1

A

1671-8348(2017)32-4469-04

2017-04-19

2017-06-17)