超聲作用下脂肪酶催化菜籽油水解反應研究

劉 寧， 陳倩楠， 石青云， 陳雪峰， 李 騁， 李 超

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

超聲作用下脂肪酶催化菜籽油水解反應研究

劉 寧， 陳倩楠， 石青云， 陳雪峰， 李 騁， 李 超

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

以菜籽油為原料，研究了不同反應器中脂肪酶Lipozyme TL IM催化油脂水解反應效果.結果表明，探頭式超聲波作用下，Lipozyme TL IM催化菜籽油水解效果較好，其工藝條件為：溫度55 ℃、底物摩爾比(水/油)60∶1、加酶量0.9%(w/w)、超聲發(fā)生模式50%，經20 min反應時間，最終可得到水解液酸價為82.74 mg KOH/g.若僅采用攪拌器方式，達到同等水解效果，需用時300 min，可見超聲波作用大大縮短了反應時間.利用GC-MS分析了樣品的脂肪酸組成，發(fā)現菜籽油在水解后不飽和脂肪酸含量略有降低.

超聲波； 菜籽油； 水解； 脂肪酶Lipozyme TL IM； 脂肪酸組成

0 引言

油菜是我國主要的油料作物之一，油菜籽的含油量為37.5%～46.3%，菜籽油常作為普通食用油，目前其深加工開發(fā)利用程度較低.將植物油水解后，可得到脂肪酸等產品，作為進一步開發(fā)的基料，如制備單甘酯、甘油二酯、生物柴油等新產品[1-3].近年來，利用脂肪酶對油脂進行水解的研究日益受到重視[4,5].

隨著多學科的相互交叉、滲透和聲學技術的發(fā)展，研究者們發(fā)現超聲波對多種反應體系具有廣泛的適用性，其應用領域不斷拓展[6-10].利用超聲輔助油脂水解，可有效提高水解反應速率和水解效果[11].由于酶催化和超聲技術都具有條件溫和、副反應少、環(huán)境友好等特點，本文對超聲作用下脂肪酶Lipozyme TL IM催化菜籽油水解反應的影響因素進行了研究，包括反應溫度、底物摩爾比、加酶量、超聲強度和反應時間等，并利用GC-MS對產品進行了分析，研究結果可為菜籽油的深度開發(fā)提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽油，益海嘉里(興平)食品工業(yè)有限公司；脂肪酶Lipozyrne TL IM，脂肪酶Lipozyme RI IM，磷脂酶Lecitase Ultra，丹麥諾維信公司；三丁酰甘油酯，日本東京株式會社；氫氧化鉀、乙醇等均為分析純.

1.2 儀器與設備

探頭式超聲波發(fā)生器,蘇州海納科技有限公司；KQ-250DE型數控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；JBZ-14H型磁力攪拌器,上海大浦儀器有限公司；HH-4數顯電子恒溫水浴鍋,江蘇金壇宏華儀器廠；Trace Ultra氣相色譜-質譜聯用儀,美國Thermo Finnigan公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 脂肪酶活性的測定

采用水解三丁酰甘油酯pH-stat法測定脂肪酶活力，參考Mishra等[12]的方法.反應緩沖液為0.005 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.5，含0.025 mol/L CaCl2)，測定溫度為37 ℃.酶活定義為：在一定條件下，1 min水解三丁酰甘油酯產生1μmol丁酸所需的酶量，即為一個酶活力單位(U).

1.3.2 酸價測定

參考GB5009.229-2016食品中酸價的測定.

1.3.3 菜籽油水解反應

實驗研究了三種不同脂肪酶對菜籽油的水解效果，包括游離磷脂酶Lecitase Ultra、固定化脂肪酶Lipozyme RI IM、固定化脂肪酶Lipozyme TL IM.比較了四種不同處理方式對菜籽油水解效果的影響，包括磁力攪拌器、超聲清洗器、超聲發(fā)生器、超聲發(fā)生與磁力攪拌器聯用.超聲清洗器的功率為250 W，頻率為40 KHz.超聲發(fā)生器功率為200 W，頻率為20 KHz.其中，磁力攪拌與超聲發(fā)生器聯用裝置示意圖見圖1所示.

A:超聲發(fā)生器 B:超聲波探頭 C:磁力攪拌器 D:溫控裝置

實驗過程中，將一定量菜籽油、水、脂肪酶加入到50 mL燒杯中，在水浴作用下，分別于四種不同反應器中進行反應.待反應結束后，將水解液在10 000 r/min轉速下離心10 min，測定上層油相的酸價.

1.3.4 脂肪酸組成分析

采用氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)分析樣品的脂肪酸組成，脂肪酸甲酯的制備參考汪勇[13]的方法.GC系統(tǒng)為Trace Ultra GC(美國ThermoFinnigan公司)，配備Trisplus自動進樣器和四級桿DSQ II質譜分析儀(MS).氣相色譜柱為TR-5MS毛細管柱(30 m×0.2 mm，0.25μm，美國ThermoFinnigan公司).樣品的進樣體積為1.0μL，分流比100∶1.以氦氣為載氣，流速1.0 mL/min.進樣口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃.氣相色譜程序升溫條件為：初始爐溫40 ℃(保持1 min)，以10 ℃/min升溫速率升至150 ℃(保持2 min)，再以10 ℃/min升溫速率升至220 ℃，最后以5 ℃/min升溫速率升至280 ℃(保持3 min).每次進樣前，設備系統(tǒng)溫度保持在40 ℃.質譜掃描范圍為50～500 m/z.

2 結果與討論

2.1 酶活測定

實驗選用游離磷脂酶Lecitase Ultra、固定化脂肪酶Lipozyme RI IM和固定化脂肪酶Lipozyme TL IM進行實驗，首先測定了它們的活力，結果分別為2 835 U/g、2 060 U/g和3 033 U/g，可見三種酶的活力均較好.

2.2 不同反應器對酶促水解效果的影響

以磷脂酶Lecitase Ultra、脂肪酶Lipozyme RI IM、脂肪酶Lipozyme TL IM分別在同等條件下，于4種不同反應器中進行菜籽油水解催化反應，反應15 min后，測定上層油相酸價，比較各反應效果，結果如表1所示.

表1 不同反應器中所得樣品酸價(mg KOH/g)

注：同一行的不同字母表示差異顯著(plt;0.05).

由表1可知，在4種反應器中，不同脂肪酶對菜籽油水解反應均有一定的催化能力，其催化能力大小順序為：Lipozyme TL IMgt;Lecitase Ultragt;Lipozyme RI IM.不同反應器的作用效果由強到弱依次為：反應器四gt;反應器三gt;反應器一gt;反應器二.綜合來看，在反應器四(超聲發(fā)生+磁力攪拌器)中，Lipozyme TL IM較其他兩種酶所得產物酸價最高，水解最為徹底.這可能是因為超聲發(fā)生器具有較強的空化效應，能促使酶分子發(fā)揮其催化活力[14].同時在攪拌作用下，酶在體系中的狀態(tài)更為分散，因而該反應器中水解效果遠優(yōu)于其他樣品.故在后續(xù)實驗中均采用這一方法.

2.3 脂肪酶水解菜籽油工藝條件研究

2.3.1 溫度的影響

以菜籽油為底物，在加酶量0.5%(w/w)、底物摩爾比(水/油)70∶1、超聲作用下(反應器四)反應20 min，改變體系的溫度，測定45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃時水解液的酸價，研究溫度對水解反應效果的影響.實驗結果見圖2所示.

圖2 溫度對水解效果的影響

由圖2可知，當反應溫度低于55 ℃時，隨著溫度的升高，酸價增大.溫度為55 ℃時，酸價最高，為71.55 mg KOH/g，這可能是由于該酶在此時處于最適酶活溫度，催化效率最大.當溫度為55 ℃～65 ℃時，則隨著溫度的升高，酸價降低，水解程度下降.根據余旭亞等[15]研究結果，溫度對酶促作用的影響表現為：在低溫范圍內，隨著溫度的升高，反應體系分子活化能增加，分子碰撞幾率增加，反應速率加快，表現為酶催化活力升高；由于大多數酶是蛋白質，當溫度超過酶的最適溫度時，酶蛋白就會逐漸產生變性作用而減弱甚至喪失催化活性，酶分子發(fā)生不可逆熱變性而失活，引起催化反應速率下降，催化活力降低.酶所表現的最適溫度就是這兩種影響的綜合結果，此時酶的催化活力表現為最大.因此，本實驗最終選擇菜籽油水解反應溫度為55 ℃.

2.3.2 底物摩爾比的影響

以菜籽油為底物，在加酶量0.5%(w/w)、反應溫度55 ℃、超聲作用(反應器四)下反應20 min，改變體系的底物摩爾比(水/油)，測定其30∶1、50∶1、60∶1、70∶1、90∶1時水解液的酸價，研究底物摩爾比對水解反應效果的影響.實驗結果如圖3所示.

圖3 底物摩爾比對水解效果的影響

從圖3可以發(fā)現，在水解過程中，當底物摩爾比(水/油)小于60∶1時，隨著摩爾比的增加，酸價不斷增大；當底物摩爾比大于60∶1時，酸價呈現遞減的趨勢.當摩爾比分別是30∶1、60∶1、70∶1和90∶1時，所得酸價值的差異較顯著(plt;0.05).當底物摩爾比為60∶1時，酸價最高，為70.80 mg KOH/g.這與黃健花等[16]的研究結果較為一致，在超聲作用下加入少量的水即可達到較好的水解效果，可認為與超聲波能夠促進反應體系的乳化作用有關，可以形成更大的油/水界面，從而實現水的"充分利用"；當加水量逐漸增加，使得酶的相對濃度減小，造成酸價減小.因此，本實驗最終選擇反應底物摩爾比(水/油)為60∶1.

2.3.3 加酶量的影響

以菜籽油為底物，在反應溫度55 ℃、底物摩爾比(水/油)60∶1、超聲作用(反應器四)下反應20 min，改變體系的加酶量，測定其0.1%、0.5%、0.9%、1.2%、2.0%、3.0%時水解液的酸價，研究加酶量對水解反應效果的影響.實驗結果見圖4所示.

圖4 加酶量對水解效果的影響

在一定條件下，反應速度隨著加酶量的增加而加快，當反應界面被酶所飽和時，反應速率達最大；繼續(xù)增大加酶量，反應速率不再增加[6].由圖4可知，在超聲作用下，當加酶量在0.1%～0.9%時，反應效率隨著加酶量的增大而提高，且呈現顯著性差異(plt;0.05).加酶量為1.2%時，其水解液酸價和加酶量0.9%所得樣品相比，無顯著性差異性.當其超過1.2%后，反應速率隨著加酶量的增加反而有所降低.造成這種現象的原因可能是，過高的加酶量導致了酶分子聚結，不利于其有效分散，從而使反應效率降低[17].另外，由于酶的價格相對較貴，如酶的用量太高不利于工業(yè)化生產.因此，本實驗最終選擇菜籽油水解反應加酶量為0.9%.

2.3.4 超聲發(fā)生模式的影響

本實驗所用探頭式超聲發(fā)生器有20%、50%和連續(xù)式3種超聲發(fā)生模式.前述實驗均采用50%發(fā)生模式.以菜籽油為底物，在加酶量0.9%(w/w)、反應溫度55℃、底物摩爾比(水/油)60∶1條件下反應20 min，研究不同超聲發(fā)生模式對酶促反應影響，實驗結果見表2所示.

表2 超聲發(fā)生模式對水解效果的影響

注：同一列的不同字母表示差異顯著(plt;0.05).

由表2可知，超聲發(fā)生模式對酶催化水解反應有較大影響.若不運用超聲處理，僅使用磁力攪拌，對照樣的酸價僅18.52 mg KOH/g.當超聲模式為20%時，反應水解液酸價為69.64 mg KOH/g；而連續(xù)的超聲模式對酶的催化反應起到一定的抑制作用(其水解液酸價為71.39 mg KOH/g)，這可能是由于超聲強度過大，其空化效應、機械效應等引起了酶分子一定程度的失活[18].可以發(fā)現，50%的超聲發(fā)生模式下Lipozyme TL IM催化能力最強，水解產物酸價最高，為82.74 mg KOH/g，較其他模式呈顯著性差異(plt;0.05).因此，本實驗選擇較適宜超聲發(fā)生模式為50%.

2.3.5 反應時間的影響

以菜籽油為底物，在加酶量0.9%(w/w)、反應溫度55 ℃、底物摩爾比(水/油)60∶1，超聲發(fā)生模式50%條件下進行反應，測定一定反應時間后水解液的酸價，研究反應時間的影響.同時與攪拌條件下(反應器一)的反應效果進行對比，實驗結果見圖5所示.

圖5 反應時間對水解效果的影響

由圖5可以發(fā)現，兩種反應器中水解液酸價隨反應時間的延長而增加，但分別在20 min和300 min后逐漸趨于穩(wěn)定.這可能是因為水解反應在此時已接近平衡，即使延長反應時間，對反應效果沒有明顯的提高[19].超聲作用(反應器四)時間為20 min時，酶催化作用達到最大，反應液酸價為82.74 mg KOH/g，而攪拌模式(反應器一)達到相近的催化效果則需300 min.因此，超聲作用對水解反應的促進效果明顯，可將反應時間從300 min縮短至20 min，大大節(jié)省了反應時間，提高了反應效率.

2.4 脂肪酸組成分析

采用氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)測定了水解前后菜籽油的脂肪酸組成，結果如表3所示.

表3 菜籽油水解前后脂肪酸組成分析

由表3可以發(fā)現，菜籽油中所含脂肪酸包括棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生酸、花生烯酸等，以不飽和脂肪酸為主.水解后，油相中飽和脂肪酸含量有所增加，而不飽和脂肪酸含量略有降低.這與汪勇研究大豆油水解反應的結果類似[13].由于本實驗所用原料為低芥酸菜籽油，水解前后均無芥酸檢出.

3 結論

采用探頭式超聲發(fā)生器與磁力攪拌聯用，以脂肪酶Lipozyme TI IM催化菜籽油水解反應，表現出較好的催化反應效率.最終得到菜籽油水解的工藝條件為：溫度55 ℃、底物摩爾比(水/油)60∶1、加酶量0.9%(w/w)、超聲發(fā)生模式50%、水解時間20 min，所得水解液油相的酸價為82.74 mg KOH/g.若僅采用磁力攪拌，達同等反應效果需用時300 min，可見超聲作用大大提高了催化效率.本論文研究結論可為探頭式超聲裝置在油脂催化中的應用提供一定的參考依據.

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【責任編輯：蔣亞儒】

Studyonultrasonicassistedlipase-catalyzedhydrolysisofrapeseedoil

LIU Ning, CHEN Qian-nan, SHI Qing-yun, CHEN Xue-feng, LI Cheng, LI Chao

(School of Food and Biological Engineering， Shaanxi University of Science amp; Technology, Xi′an 710021, China)

In the present study,the lipase Lipozyme TL IM-catalyzed hydrolysis of rapeseed oil in different reactors was studied. The result showed under the action of probe-type ultrasonic,the hydrolysis conditions of rapeseed oil catalyzed by Lipozyme TL IM were as follows:reaction temperature of 55 ℃,the molar ratio of substrates (water/oil) of 60∶1,enzyme load of 0.9% (w/w),ultrasonic mode of 50%,and reaction time of 20 min.The acid value of hydrolyzate was determined as 82.74 mg KOH/g.However,when a stirrer reactor was employed,it needed 300 min to obtain the same hydrolysis result.It was showed that the ultrasonic can reduce the reaction time to a large extent.GC-MS was employed to analyze the fatty acid compositions of rapeseed oil and its hydrolyzate.The result revealed that after hydrolysis,the content of unsaturated fatty acids decreased slightly.

ultrasonic; rapeseed oil; hydrolysis; lipase Lipozyme TL IM; fatty acid composition

2017-10-11

國家自然科學基金項目(31501443)； 陜西省科技廳自然科學基礎研究計劃項目(2014JQ3111)； 陜西科技大學博士科研啟動基金項目(BJ15-02)； 陜西省2017年大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201710708041)

劉 寧(1984-)，男，四川巴中人，講師，博士，研究方向：糧油食品加工、食品乳狀體系

2096-398X(2017)06-0109-05

Q814.2

A