HPLC法測定不同產(chǎn)地紫草中去氧紫草素的含量

朱永樂 董 娜 曲曉蘭 齊永秀

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271016)

HPLC法測定不同產(chǎn)地紫草中去氧紫草素的含量

朱永樂 董 娜 曲曉蘭 齊永秀

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271016)

目的 建立測定不同產(chǎn)地紫草中去氧紫草素含量的方法。方法 采用高效液相色譜法，色譜柱為Symmetry C18BDS柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相為乙腈-水(80∶20)，流速為1.0 ml/min,檢測波長265 nm，柱溫35℃，進樣量20 μl。結(jié)果 去氧紫草素在10.00～50.00 μɡ/ml范圍內(nèi)濃度與峰面積線性關(guān)系良好(r=0.9994)；去氧紫草素的加樣回收率分別為100.17%、112.82%、125.28%(RSD=0.10%,n=9)；山東紫草、安徽紫草、陜西紫草和新疆紫草中的去氧紫草素的百分含量分別為71.40%、67.77%、135.32%。結(jié)論 該含量測定方法準(zhǔn)確，有效，快速，重現(xiàn)性較好，可用于紫草中的去氧紫草素含量的測定。

去氧紫草素；HPLC法；不同產(chǎn)地；含量測定

紫草，別名有山紫草、地血、鴉銜草、紫草根、紫丹、紫芙等。據(jù)《中華人名共和國藥典》收載，紫草為紫草科(Boraginaceae)植物紫草(Lithospermum erythrorhizohsieb.et Zuce)、新疆紫草{Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst}和內(nèi)蒙紫草(Arnebiaguttata Bunge)的干燥根[1]。紫草藥材中的萘醌類是主要的有效成分，含量約占3%～6.5%。文獻報道在新疆紫草中得到的萘醌類化合物，包括去氧紫草素、紫草素、β- 羥基戊酰紫草素、β-二甲基丙烯酰紫草素、β-羥基異戊酰阿卡寧、乙酰紫草，其中，乙酰紫草醌、紫草醌、去氧紫草素等萘醌類色素為紫草藥材的主要有效成分[2-4]。高效液相色譜法為常用的測定方法[5]，本實驗采用高效液相色譜法對山東、新疆、安徽三個產(chǎn)地紫草藥材的去氧紫草素的含量進行測定，并進行了方法學(xué)考察，方法簡便，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，靈敏度高。

1 儀器與試劑

1.1儀器

Waterse2695高效液相色譜儀，Waters2998二極管陣列檢測器；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)；電子天平FR224CN(上海奧豪斯儀器有限公司制造)；電熱恒溫水浴鍋HH.SY11-NY2C(北京市長風(fēng)儀器儀表公司)；SHB-III循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2材料與試劑

去氧紫草素對照品(上海源葉生物科技有限公司B21034-10MG) ；山東紫草、安徽紫草和新疆紫草(藥店購買，經(jīng)段瑞老師鑒定)；乙腈色譜純(天津永大試劑有限公司)；甲醇色譜純(天津永大試劑有限公司)。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1溶液配制

2.1.1對照品溶液的制備 精密稱取去氧紫草素的對照品1 mg，置10 ml的容量瓶中，用甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1 mg/ml的對照品溶液，置陰涼干燥處，避光環(huán)境保存。

2.1.2供試品溶液的制備 將干燥紫草藥材粉碎，過60 目篩，精密稱取紫草藥材粉末1.0 g,置于50 ml的錐形瓶中，加入甲醇25 ml，超聲提取30 min，振搖后靜置冷卻約10 min,濾過，濾渣加20 ml的甲醇，超聲提取20 min，合并甲醇濾液并定容至50 ml，置40 ℃恒溫水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至25 ml，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，既得供試品溶液。

2.2方法學(xué)考察和樣品測定

2.2.1色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 色譜柱：Symmetry C18BDS柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：乙腈∶水(80∶20)；流速：1.0 ml/min；檢測波長:265 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μl；檢測時間：30 min。在此色譜條件下, 去氧紫草素的理論塔板數(shù)大于5000,與相鄰色譜峰分離度大于1.7,對稱因子為1.06。

2.2.2專屬性試驗 取空白溶液、對照品溶液、三個產(chǎn)地的供試品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖(圖1)。由圖1可見，空白溶液色譜在對照品色譜相應(yīng)的位置無吸收峰，表明在該試驗條件下其他組分對測定結(jié)果無干擾，專屬性較好。

圖1 紫草樣品及去氧紫草素的色譜圖

2.2.3線性關(guān)系的考察 精密量取去氧紫草素對照品溶液(0.1 mg/ml)各1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml,分別置于10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成10.0 μg/ml、20.0 μg/ml、30.0 μg/ml、40.0 μg/ml、50.0 μg/ml的溶液，分別取各溶液20 μl進樣，在上述色譜條件下進行分析。以對照品濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行回歸計算可得線性回歸方程為：Y=34769X-62579,r=0.9994,表明去氧紫草素在10.00～50.00 μɡ/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4精密度試驗 取線性關(guān)系項下取配好的去氧紫草素對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄在265 nm處去氧紫草素的色譜圖，以峰面積計算，RSD值為0.31%，表明儀器的精密度良好。

2.2.5穩(wěn)定性試驗 稱取三個產(chǎn)地的紫草粉末，按“2.1.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下的色譜條件進樣，分別在0 h,2 h,4 h,6 h,8 h,10 h不同時間段內(nèi)重復(fù)進樣三次，每次進樣20 μl，記錄去氧紫草素的峰面積，計算其含量，RSD分別為安徽0.10%，新疆0.07%，山東0.06%，表明三個產(chǎn)地去氧紫草素在10 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.6重復(fù)性試驗 分別取山東、新疆、安徽產(chǎn)地的紫草粉末，按“2.1.2”項下的方法分別制備供試品溶液并處理成 6 份，依次進樣每次20 μl，平行測定6 次，計算去氧紫草素的百分含量分別為山東71.40%，新疆67.83%，安徽134.37%，RSD值分別為0.04%，0.10%，0.58%。表明方法重復(fù)性較好。

2.2.7回收率試驗 準(zhǔn)確量取已知含量的安徽供試品溶液共9 份，每份1 ml,分別精密加入去氧紫草素對照品適量(約相當(dāng)于安徽紫草中去氧紫草素含量的80%，100%，120%)，置于5 ml的容量瓶。實驗分為三組，每組分為 3 份。按“2.2.1”項下色譜條件進樣20 μl，測定峰面積，計算去氧紫草素的含量。測得低、中、高三個不同濃度的平均加樣回收率分別為100.17%，112.82%，125.28%，9個加樣回收率數(shù)據(jù)的RSD值0.10%，在誤差允許的范圍內(nèi)。

2.2.8樣品的含量測定 分別稱取山東、新疆和安徽紫草粉末，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，各處理成3份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，山東、新疆、安徽紫草中去氧紫草素的百分含量分別為71.42%、67.77%、135.32%，RSD分別為0.02%、0.04%、0.04%。其結(jié)果見表1，實驗結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的紫草中去氧紫草素的含量存在差別。

表1 山東、新疆、安徽產(chǎn)地紫草中去氧紫草素含量測定結(jié)果(n=3)

3 討 論

3.1提取工藝的選擇

查閱文獻資料可知紫草的提取方法有超聲波、浸漬、滲漉、加熱回流等。當(dāng)溫度高于60 ℃時，紫草中的成分不穩(wěn)定[6]。并且紫草中萘醌類化合物對酸堿度、溫度、氧等因素都比較敏感[7]，為紫草的提取工藝提出了較為嚴(yán)格的條件。郝鶴等的發(fā)現(xiàn)使用超聲波提取的方法時無需加熱、加壓，在常溫下即可以進行實驗。綜合考慮提取效率，設(shè)備條件，操作可行性，成本，最終選擇超聲提取的方法，并且注意控制溫度在60 ℃以下。

3.2色譜條件的選擇

本實驗中考察了甲醇-水(80∶20)，甲醇-水(90∶10)，乙腈-水(60∶40)，乙腈-水(70∶30)，乙腈-水(80∶20)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水(80∶20)為流動相實驗效果比較好。在較短的時間能得到較好的峰型，并且分離效果較好，基線穩(wěn)定，所以最終選定乙腈-水(80∶20)為流動相。去氧紫草素在265 nm、475 nm均有吸收。HPLC分別測定去氧紫草素對照品在兩波長處的色譜圖，在265 nm處的峰面積大于475 nm處的峰面積，且在265 nm處時峰形較好，因而選擇在265 nm處測定。

本實驗建立的高效液相色譜法適用于不同產(chǎn)地紫草中去氧紫草素的含量測定，方法操作簡單、分析時間較短、線性范圍寬、靈敏度高、適應(yīng)性較強，可以廣泛地應(yīng)用于對紫草藥材和紫草提取物的研究。

[1] 葛素囡,王芳,周歌,等. 新疆紫草及其毛狀根中萘醌類化合物的研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理,2015,25(5):675-681.

[2] 劉力豐.紫草化學(xué)成分研究進展[J].中國醫(yī)藥指南，2009，7(4):49.

[3] 馮文文,李國玉,譚勇,等. 軟紫草與硬紫草萘醌類化學(xué)成分的研究[J]. 中國現(xiàn)代中藥,2010,11(7):15-18.

[4] 詹志來,胡峻,劉談,等. 紫草化學(xué)成分與藥理活性研究進展[J]. 中國中藥雜志,2015,40(21):4127-4135.

[5] 郝鶴,李鵬躍,葉和春,等. 新疆紫草7種萘醌類成分的同時測定[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(18):108-112.

[6] 李曉瑾,譚秀芳,馬媛,等. 新疆紫草質(zhì)量穩(wěn)定性研究[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2006,29(11):1045-1046+1049.

[7] 韋英杰,王茉,袁慕榮,等. 紫草效應(yīng)成分動態(tài)變化與穩(wěn)定性研究[J]. 中藥材,2011,(4):611-615.

Content determination of deoxyshikonin of Arnebia Radix in different producing area by HPLC

ZHU Yong-le DONG Na QU Xiao-lan QI Yong-xiu

(Dept.of Pharmacy ,Taishan Medical University,Taian 271016,China)

Objective: To establish a HPLC method for Deoxyshikonin and to determine content of Deoxyshikonin in Arnebia Radix. Methods: HPLC method was adopted, the determination was performed on Symmetry C18 BDS (250 mm×4.6 mm,5 μm) column with mobile phase consisting of acetonitrile-methanol (80:20) at the flow rate of 1.0 ml/min, the detection wavelength was set at 265 nm, and the sample size was 20μl. Results: Deoxyshikonin standard solution had good linear relationship between concentration and peak area in the range of 10.00～50.00μg/ml(r=0.9994);average recovery rates of deoxyshikonin were 100.17%,112.82% and125.28%(RSD=0.10%,n=9);Percentage of deoxyshikonin in Shandong Arnebia Radix, Anhui Arnebia Radix, Xinjiang Arnebia Radix were respectively 71.40%, 67.77% and 135.32%. Conclusion: The content determination method is accurate, effective, fast and reproducible, which can be used to determine the content of deoxyshikonin.

deoxyshikonin;HPLC;different producing area; content determination

R917

A

1004-7115(2017)11-1229-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.11.009

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510439195)，山東省高等學(xué)?？萍加媱濏椖?J16LM10)。

朱永樂，泰山醫(yī)學(xué)院在讀學(xué)生。

齊永秀，碩士導(dǎo)師，研究方向：藥物色譜分析。

2017-09-24)